顯微操作技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)的特點和應(yīng)用

關(guān)于顯微操作技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)的特點和應(yīng)用第1頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微鏡的種類透射式落射式第2頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月和傳統(tǒng)顯微技術(shù)相比,熒光顯微技術(shù)具有以下優(yōu)點:(1)熒光顯微鏡所用光源的波長比傳統(tǒng)顯微鏡光源的波長短1/2,因此熒光顯微鏡的分辨能力超出了傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率的極限(2)熒光顯微鏡技術(shù)具有高度靈敏性和專一性.它所用染料的量是極其微小的,只相當于傳統(tǒng)顯微技術(shù)中染料消耗量的幾千分之一.第3頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)熒光顯微鏡能夠直接顯示細胞內(nèi)的生物化學成分,并且顯示的彩色效果很明亮,極易觀察,極易進行定量分析,而且能以極低濃度的染料檢測出含量極微的物質(zhì).(4)隨著新的熒光染料的發(fā)明,可不斷擴大被測物質(zhì)的范圍.第4頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月生物學材料，有各種產(chǎn)生熒光:1.自發(fā)熒光:或原發(fā)熒光細胞組織中自然存在的某些物質(zhì)可被激發(fā)產(chǎn)生熒光2.誘發(fā)熒光材料中的某些物質(zhì)經(jīng)一定的化學處理后，可轉(zhuǎn)化為熒光色團，由此被誘發(fā)產(chǎn)生熒光。最常見的是甲醛誘發(fā)蛋白質(zhì)中所含的芳香乙胺基團轉(zhuǎn)化為熒光色團。戊二醛也能誘發(fā)熒光第5頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月3熒光染料染色：應(yīng)用含熒光色團的物質(zhì)作為染料，使與生物組織中和該物質(zhì)有特殊親和力的成分相結(jié)合，即可被激發(fā)熒光。這類染料稱為熒光染料或熒色素。許多常規(guī)染色劑(如剛果紅、曙紅、堿性品紅、水溶性苯胺藍等)兼有熒光染料的性能第6頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月1.DNA研究用細胞熒光測定技術(shù)測量DNA,是熒光顯微技術(shù)和細胞光度技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物,標志著前者由定性向定量測定發(fā)展.第7頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月吖啶橙3，6－（二甲胺基）吖啶鹽酸鹽，分子式C17H19N3·HCl·ZnCl?,分子量438.12g/mol,是一種熒光色素，其檢測激發(fā)濾光片波長488nm,阻斷濾光片波長515nm。第8頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月吖啶橙染色原理:吖啶橙可對細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光。其激發(fā)峰為492nm，熒光發(fā)射峰為530nm（DNA）、640（RNA），它與雙鏈DNA的結(jié)合方式是嵌入雙鏈之間，而與單鏈DNA和RNA則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍光（502nm）激發(fā)下，細胞核發(fā)亮綠色熒光（約530nm），胞質(zhì)RNA發(fā)橘紅色熒光（>580nm）。第9頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月它與細胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的熒光，與DNA結(jié)合量少發(fā)綠色熒光，與RNA結(jié)合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光。第10頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月體外培養(yǎng)的肝癌細胞吖啶橙熒光染色可見含DNA的細胞核顯示黃綠色熒光，含RNA的細胞質(zhì)顯示橘紅色熒光第11頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月DAPIDAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm。第12頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月DAPI染色原理：

DAPI為一種熒光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強20多倍的熒光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍色熒光的細胞，熒光顯微鏡觀察細胞標記的效率高(幾乎為100%)，且對活細胞無毒副作用。第13頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月2.細胞壁研究

熒光顯微技術(shù)在植物細胞學中應(yīng)用的一個突出方面,是用于鑒定細胞壁成分,研究壁形成和再生,以及壁在植物發(fā)育過程中和環(huán)境影響下性質(zhì)的變化觀察細胞壁的方法很多,如用專一的染料染色或利用纖維素的偏振光性質(zhì)等?，F(xiàn)在國外常用的方法是熒光增白劑染色,在4QOnm左右的激發(fā)光照射下觀察細胞壁(纖維素)所產(chǎn)生的綠色熒光來判斷細胞壁的有無

第15頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光增白劑染色熒光增白劑和細胞壁成分有強烈親和力,當前常用的熒光增白劑有ST,M2R,VBL.ST開始被用于顯示細菌,放線菌與真菌的細胞壁,在粘菌材料中,它被證明與纖維素和幾丁質(zhì)有親和力胼胝質(zhì)是一種以β-1,3鍵結(jié)合的葡聚糖。在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其合成、分解直接關(guān)系植物正常的生長代謝過程。第16頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月胼胝質(zhì)是一種以β-1,3鍵結(jié)合的葡聚糖。在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其合成、分解直接關(guān)系植物正常的生長代謝過程。

第17頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月3細胞生活力測定熒光素雙醋酸酯（FDA）是一種常用的培養(yǎng)動植物細胞以及植物細胞原生質(zhì)體的生活力鑒定染料，其染色機理也利用了死活細胞在代謝上的差異：FDA本身不產(chǎn)生熒光，也無極性，能自由滲透出入完整的細胞膜。當FDA進入活細胞后，被細胞內(nèi)的脂酶分解，生成有極性的、能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)——熒光素，該物質(zhì)不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞膜內(nèi)，因而使有活力的細胞產(chǎn)生綠色熒光；而無活力的細胞因不能使FDA分解，而無法產(chǎn)生熒光第18頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月活體染色

vitalstaining

將無毒或毒性較小的某種染料注入動物體內(nèi),可被機體內(nèi)某些組織或細胞所攝取,稱為活體...第19頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月影響熒光的因素1.pH的影響帶有酸性或堿性官能團的大多數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液PH值有關(guān)，例如：在pH=7-12的溶液中苯胺以分子形式存在，會發(fā)出藍色熒光；而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以離子形式存在，都不會發(fā)出熒光。同時所用酸的種類也影響熒光的強度，例如：奎寧在硫酸溶液中的熒光比在鹽酸中的要強。第20頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月2.溫度的影響溫度對熒光強度的影響較敏感。溶液溫度下降時，介質(zhì)的粘度增大，熒光物質(zhì)與分子的碰撞也隨之減少，去活化過程也減少，則熒光強度增加。相反，隨著溫度上升，熒光物質(zhì)與分子的碰撞頻率增加，使去活化幾率增加，則熒光強度下降。第21頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月3.熒光強度與溶液濃度的關(guān)系

在稀溶液中：F＝KcF為熒光強度K-檢測效率（由儀器決定）c為液體的濃度高濃度時，熒光物質(zhì)發(fā)生熄滅和自吸收現(xiàn)象，使F與c不呈線性關(guān)系第22頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月4猝滅劑

何為猝