植物組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗培養(yǎng)

關(guān)于植物組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗培養(yǎng)第1頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月教學(xué)目的和要求

(1）了解植物病毒的危害和培養(yǎng)無(wú)病毒植物的意義。（2）理解和掌握脫除植物病毒的原理及方法。（3）分離莖尖及培養(yǎng)方法。（4）掌握無(wú)毒苗木的鑒定方法。（5）掌握脫毒苗木的保存和利用方法。第2頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

第一節(jié)植物病毒的危害和培養(yǎng)無(wú)病毒植物的意義

病毒之所以致病不是由于消耗細(xì)胞養(yǎng)分、通過(guò)毒素殺死細(xì)胞，而是利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)繁殖，干擾細(xì)胞的代謝過(guò)程，在寄主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一些對(duì)細(xì)胞正常功能有害的異常物質(zhì)和條件，這使得植物病毒病的防治較其他植物病害防治更為困難，常給生產(chǎn)帶來(lái)災(zāi)難的損失，被稱為“植物的癌癥”。第3頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、植物病毒的危害植物病毒已超過(guò)600種，嚴(yán)重危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。在果樹(shù)、蔬菜、花卉、林木以及農(nóng)作物上皆有發(fā)現(xiàn)。隨著生產(chǎn)栽培時(shí)間的推移，危害越來(lái)越嚴(yán)重，發(fā)現(xiàn)的病毒種類也越來(lái)越多。第4頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒癥狀第5頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第6頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月危害園藝植物的病毒數(shù)目第7頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月如侵染菊花的病毒和類病毒有19種之多

如無(wú)子病毒(CAV)

潛隱病毒(CLV)B病毒(CVB)

輕斑駁病毒(CMMV)

矮化病毒(CSV)

脈斑駁病毒(CVMV)

退綠斑駁類病毒(CCMV)等第8頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4種病毒對(duì)草莓生產(chǎn)造成重大影響:

斑駁病毒（SMoV）草莓黃邊病毒（SMYEV）草莓鑲脈病毒（SVBV）草莓皺縮病毒（SCrV）、第9頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月甘薯根腐病.甘薯葉點(diǎn)病甘薯枯萎病甘薯黑痣病第10頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.病毒的特性及其侵染

多數(shù)植物病毒不經(jīng)種子傳播，多數(shù)以種子繁殖后代的植物，可以從輕度染病植株上采集種子，播種繁殖，不會(huì)將病毒傳至下一代。（專化性強(qiáng)的病毒除外，如豆類病毒——由一種?；詮?qiáng)的蚜蟲(chóng)傳播)可隨著種子傳播。）對(duì)于有性生殖退化，僅能用無(wú)性繁殖方法繁殖的植物，一旦染病則毫無(wú)辦法。母株一旦染病，病毒在其細(xì)胞內(nèi)增殖，并通過(guò)插條、接穗、種薯、球根、鱗片傳至下一代。通過(guò)昆蟲(chóng)作為媒介加速傳播。第11頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月３.植株脫病毒的意義植物組織培養(yǎng)脫病毒技術(shù)是植物細(xì)胞工程的重要組成部分，脫毒種苗的生產(chǎn)在提高作物質(zhì)量和產(chǎn)量方面已顯示出極大潛力，良種、新品種的脫毒組培苗的大面積推廣和應(yīng)用，有效地解決了因病毒引起的品種退化問(wèn)題。因此，植物組培脫毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的科學(xué)化、現(xiàn)代化中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，還可減少農(nóng)藥的施用，改善生態(tài)環(huán)境條件，防止病害的蔓延與擴(kuò)散，該方法已成為農(nóng)業(yè)中應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù)。第12頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月脫毒苗第13頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒活力與溫度的關(guān)系第14頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

第二節(jié)脫除植物病毒的原理及方法

一、物理學(xué)方法：

X射線紫外線超短波高溫

都能使病素鈍化，其中以熱處理最常用。第15頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.熱處理脫除植物病毒的原理①病毒是DNA大分子，病毒進(jìn)入植物細(xì)胞后；隨植物細(xì)胞的DNA一起復(fù)制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止，而失去侵染的能力。②熱處理是一種物理效應(yīng)，與冷處理一樣，它可以加速植物細(xì)胞的分裂，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競(jìng)爭(zhēng)中取勝。第16頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）溫湯浸漬處理法：將剪下的接穗或種植材料，在50℃左右的溫水中，浸漬3-15分鐘至數(shù)小時(shí)。（2）熱風(fēng)處理法：讓盆載植物在35-40℃高溫下生長(zhǎng)發(fā)育，熱處理空氣溫度應(yīng)逐漸升高，然后達(dá)到所需溫度，同時(shí)必須保持一定的濕度和光照，以后可切取處理后新長(zhǎng)出的枝條作接穗和砧木，或?qū)崽幚砼c組織培養(yǎng)結(jié)合效果更好。熱處理脫毒第17頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、愈傷組織熱處理脫毒法

方法：從患病植株上取葉片(莖片、鱗片、花器亦可)進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后將愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)同時(shí)兼用熱處理。

常用處理溫度及處理時(shí)間：溫度：37-38℃時(shí)間：處理2周、4周或8周溫度：50℃時(shí)間：3-15min。反復(fù)繼代兼熱處理，經(jīng)歷一定的時(shí)間(繼代次數(shù)需試驗(yàn))后，將熱處理過(guò)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)器官分化。第18頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月果樹(shù)作物：桃(無(wú)黃萎病)、蘋(píng)果(花葉病)、葡萄(扇葉病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、樹(shù)莓、紅莓苔子、草莓等。蔬菜作物：馬鈴薯、番茄、菠菜?；ɑ苤参铮郝L(zhǎng)春花、康乃馨、菊花等。其他植物：曼陀羅等。第19頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

例：煙草愈傷組織兼熱處理鈍化煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)獲得無(wú)病毒株效果做法：

A：從患病煙草植株上取5mm葉片培養(yǎng)，在MS附加IAA2mg/L+KT0.2mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。B：將其中一部分愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)中分別兼用25℃、30℃和37℃溫度熱處理8周。C：將熱處理后的愈傷組織，轉(zhuǎn)到MS附加IAA2mg/L+KT2mg/L的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分化。D：將1cm長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)移到MS附加IAA2mg/L+KT0.02mg/L生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)根分化。E：完整植株獲得后，移植到無(wú)毒土壤栽培并進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：反復(fù)繼代培養(yǎng)可獲得無(wú)病毒株。第20頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.低溫處理脫除病毒菊花植株----5℃,4-7.5個(gè)月處理后進(jìn)行莖尖培養(yǎng),可以除去矮化病毒(CSV)和褪綠班駁病毒(CCMV),而單獨(dú)的莖尖培養(yǎng)無(wú)此效果。第21頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

二、化學(xué)方法

使用農(nóng)藥是防治植物真細(xì)菌病害的主要方法，理論上講，也應(yīng)該是防治病毒的有效途徑。有不少化學(xué)物質(zhì)能抑制病毒復(fù)制，例如孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、以及某些病毒抑制劑。如Viraz01e(病毒唑)和一些蛋白質(zhì)、核酸合成抑制劑等。由于病毒的復(fù)制和寄主的代謝過(guò)程關(guān)系非常密切，因此，要找出既干擾病毒復(fù)制，又不影響寄主細(xì)胞正常代謝的藥劑十分困難。第22頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月利用這些化合物處理整株植物去病毒的效果雖不理想，但培養(yǎng)離體的組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等卻可能有良好效果。如在培養(yǎng)基中加入2—硫尿嘧啶可以除去煙草愈傷組織中的PVY病毒，加入放線菌素D可以抑制原生質(zhì)體中的病毒復(fù)制等。

第23頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月鈍化、抑制和清除植物病毒的一些化合物第24頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

三、生物學(xué)方法

1.莖尖培養(yǎng)脫毒（1）莖尖培養(yǎng)脫毒的理論基礎(chǔ)a、病毒在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移是通過(guò)維營(yíng)束系統(tǒng)完成的，在分生組織區(qū)域內(nèi)沒(méi)有維管束組織，病毒只能通過(guò)胞間連絲傳遞趕不上細(xì)胞的不斷分裂和活躍的生長(zhǎng)速度；b、在分裂旺盛的分生組織內(nèi)，病毒的復(fù)制受到旺盛代謝活動(dòng)的限制；c、在植物分生區(qū)域內(nèi)，“病毒鈍化體系”的活性較其他部位的活性高；d、莖尖分生組織內(nèi)高濃度的植物內(nèi)源激素可能會(huì)抑制病毒的增殖。第25頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）莖尖培養(yǎng)脫毒苗的方法在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖?？紤]到脫毒效果及提高成活率，一般切取0.2—0.5mm的莖尖為組織材料進(jìn)行培養(yǎng)，不同的植物莖尖對(duì)外源激素的反應(yīng)不同。莖尖大小:過(guò)大時(shí)接種易成活，但脫毒效果差，過(guò)小時(shí)難成活，但脫毒效果好。一般以帶有1-2片葉原基為好，大小為0.2-0.3mm為宜，超過(guò)0.5mm時(shí)，脫毒效果差。培養(yǎng)基:只要能使莖尖快速生長(zhǎng)，分化快的培養(yǎng)基均適于脫毒。一般以MS較好，添加一定比例的細(xì)胞分裂素就行。第26頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月馬鈴薯的芽第27頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月莖尖的結(jié)構(gòu)第28頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微莖尖普通莖尖第29頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月馬鈴薯脫毒苗第30頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第31頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月康乃馨不同莖尖培養(yǎng)與康乃馨斑駁病毒的脫除情況第32頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒的技術(shù)關(guān)鍵①同一種病毒在不同植物體內(nèi)分布部位不同。例：煙草花葉病毒(TMV)在如下植物中的熒光反應(yīng)。煙草：l-4片葉原基中未見(jiàn)TMY特異熒光撞羽矮牽牛：一兩片葉原基未見(jiàn)TMV特異熒光，而在三四片葉原莖中可見(jiàn)TMV熒光。番茄：1片葉原莖中未見(jiàn)TMV特異熒光。

所以在用莖尖培養(yǎng)脫毒時(shí)，必須認(rèn)真確定病毒在植物莖尖中的分布部位，然后確定培養(yǎng)莖尖的大小.第33頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月番茄：只能取生長(zhǎng)錐或僅帶一片葉原基的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)；撞羽矮牽牛：可取生長(zhǎng)錐或帶一兩片葉原基的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)；煙草：可取帶4片葉原基的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)。

利用莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒時(shí)，最好找出莖原基所帶葉原基的數(shù)目與生長(zhǎng)點(diǎn)(莖尖)大小的相關(guān)性，這樣在取材時(shí)就方便多了。第34頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

莖原基0.05~0.08mm

莖原基帶2片葉原基0.1~0.2mm

莖原基帶4片葉原基0.3~0.4mm

莖原基帶6片葉原基0.6~0.8mm第35頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②不同病毒種類在同一種植物中分布部位不同。第36頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月甘薯斑紋花葉病毒、縮葉花葉病毒：分布于1.0-2.0mm以內(nèi)的莖尖中羽毛狀花葉病毒：

分布于0.3-1.0mm以內(nèi)莖尖中馬鈴薯馬鈴薯卷葉病毒、Y病毒：分布于1.0-3.0mm以內(nèi)的莖尖中；

X病毒：分布于0.2-0.5mm以內(nèi)的莖尖

G病毒：分布于0.2-0.3mm以內(nèi)的莖尖

S病毒：0.2mm以下

第37頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.愈傷組織培養(yǎng)脫毒植物各部位器官和組織培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無(wú)病毒苗。說(shuō)明病毒顆粒會(huì)在愈傷組織的培養(yǎng)過(guò)程中逐漸消失。第38頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織脫病毒的機(jī)理可能的原因有：①病毒在植物體內(nèi)不同器官或同一器官的不同組織中分布不均勻，由那些無(wú)病毒細(xì)胞增殖產(chǎn)生的愈傷組織就是獲得無(wú)病毒苗的基礎(chǔ)。②有些愈傷組織細(xì)胞中病毒濃度較低，在愈傷組織細(xì)胞快速分裂過(guò)程中，病毒的復(fù)制能力衰退或丟失。③繼代培養(yǎng)的愈傷組織容易產(chǎn)生抗性變異細(xì)胞，因而可能出現(xiàn)不帶病毒的愈傷組織。但經(jīng)愈傷組織產(chǎn)生無(wú)病毒苗的脫毒途徑容易產(chǎn)生變異，可能導(dǎo)致植株喪失其原有的優(yōu)良性狀，當(dāng)然也有可能產(chǎn)生有益的變異，但頻率極低。第39頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.莖尖微體嫁接脫毒先將砧木種子進(jìn)行表面消毒，以后再接到1%瓊脂以MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)芽，用苗齡約2周的幼嫩實(shí)生苗作砧木。把實(shí)生苗從試管中取出，在無(wú)菌條件下切去頂部，留下1-1.5cm的上胚軸部分，將子葉和腋芽除去，把根切短至4—6cm長(zhǎng)。從田間或溫室旺盛生長(zhǎng)的成年樹(shù)剪取一小段新梢，經(jīng)消毒后在超凈臺(tái)上用顯微操作法取出僅帶1-3個(gè)葉原基的莖尖約1mm大小作穗用。采用倒T字形的水平切口。嫁接苗用液體濾紙橋培養(yǎng)基培養(yǎng)。成活率30%—50%，嫁接成功的植株移植到土壤之前至少要有兩片展開(kāi)的真葉。第40頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蘋(píng)果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率第41頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蘋(píng)果不同取材時(shí)期對(duì)微體嫁接成功率的影響第42頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月試管微體嫁接在果樹(shù)方面發(fā)展最快

(1)嫁接植物不受與珠心及有性實(shí)生苗相關(guān)的幼年階段的影響。(2)許多栽培品種通過(guò)嫁接繁殖了許多世代，因此果樹(shù)研究者和種植者關(guān)于這些品種的自根苗的根冠大小、病蟲(chóng)害情況以及耐寒性等了解得很少。第43頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)莖尖組織培養(yǎng)繁殖結(jié)合熱處理可產(chǎn)生無(wú)病毒植物，因此，許多研究者認(rèn)為對(duì)通常采用嫁接繁殖的果樹(shù)進(jìn)行試管嫁接是很適宜的。(4)試管微體嫁接除了可培育無(wú)病毒植株外，還可解決難以生根的園藝植物的生根問(wèn)題和進(jìn)行嫁接親和力的研究。第44頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

4.珠心胚培養(yǎng)脫毒

柑桔類80%以上的種類具有多胚性,而單胚占的比例很小。柑橘類植物中有不少多胚品種，一顆種子內(nèi)除一個(gè)合子胚外，還有數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)由珠心細(xì)胞形成的無(wú)性胚，稱做珠心胚。因?yàn)椴《就ǔＪ墙?jīng)維管束的韌皮組織傳播的，而珠心與維管束系統(tǒng)無(wú)直接聯(lián)系。由珠心組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的植株就可免除病毒的危害。第45頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①它與合子胚不同，不是受精的產(chǎn)物，而是由體細(xì)胞產(chǎn)生的，因此具有和母體相同的遺傳組成；②與合子胚一樣，在珠心胚和植株之間無(wú)維管組織連系，因此即使母體植株感染了病毒，珠心胚也是無(wú)毒的；③在自然條件下，珠心胚一般都不能發(fā)育成熟，只有適時(shí)從種子中剝離出來(lái)，接種在人工培養(yǎng)基上，珠心胚才能長(zhǎng)成植株，而這些植株應(yīng)當(dāng)是不帶病毒的母體無(wú)性系。珠心胚具有3個(gè)特征第46頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.花藥培養(yǎng)脫毒花藥培養(yǎng)的最初目的，是培育起源于花藥內(nèi)部花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料的來(lái)源。但經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)表明花藥培養(yǎng)所得的植株有95%以上是能開(kāi)花結(jié)果的多倍體，而且生長(zhǎng)發(fā)育都優(yōu)于母株。已證明，經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)出來(lái)的花藥植株是不帶病毒的，借此方法，不僅可快速培育出大量的無(wú)毒植株，并可省去病毒鑒定工作，對(duì)基層生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)為一舉兩得的事情。第47頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、分離莖尖的培養(yǎng)情況第一種：是生長(zhǎng)停止，接種的組織擴(kuò)大，顏色逐漸變褐而枯死，這種情況大多是生長(zhǎng)點(diǎn)在分離接種過(guò)程中受傷而造成的；第二種：是生長(zhǎng)太慢，莖尖接種后顏色逐漸變綠，但不見(jiàn)增大，最后成綠色小點(diǎn)。這是由于生長(zhǎng)素濃度偏低，或培養(yǎng)溫度過(guò)低所造成的，如果立即轉(zhuǎn)入較高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中，或提高培養(yǎng)溫度，即能促進(jìn)莖尖生長(zhǎng)；第48頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三種：是生長(zhǎng)過(guò)旺，接種后莖尖明顯增大，約培養(yǎng)一同后即在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織，但不易見(jiàn)到莖尖的伸長(zhǎng)，組織顏色也較淺。這是由于培養(yǎng)莖生長(zhǎng)素濃度偏高，或光照弱，溫度高而造成的。為此應(yīng)將培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)素濃度較低的培養(yǎng)基中，或降低溫度，提高光照強(qiáng)度來(lái)解決。否則時(shí)間長(zhǎng)了愈傷組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)分化能力；第四種：是生長(zhǎng)正常、在營(yíng)養(yǎng)、激素、溫度、光照等各方面條件正常的情況下，接種的莖尖顏色逐漸變綠，基部逐漸增大，有時(shí)形成少量的愈傷組織，莖尖也逐漸伸長(zhǎng)，培養(yǎng)一個(gè)月左右轉(zhuǎn)入無(wú)基素的基本培養(yǎng)基，莖尖繼續(xù)伸長(zhǎng)，并產(chǎn)生根系，最后發(fā)育成完整植株。第49頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)無(wú)病毒植株脫毒程序一、材料準(zhǔn)備1．選擇植物種類及品種。選用生長(zhǎng)健壯，遺傳性一致的品種為材料，并探明該品種所脫除的病毒在寄主中的位置。2．了解該植物體內(nèi)所具有的病毒種類及危害的程度。根據(jù)植物所帶病毒種類，選擇指示植物(敏感植物)。3．決定脫除病毒的方法：“莖尖培養(yǎng)”還是“熱處理”還是“微體嫁接”。第50頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、生長(zhǎng)點(diǎn)分離和培養(yǎng)(莖尖培養(yǎng)為例)

1．從罹病的植株上切取頂芽或腋芽。2．材料表面滅菌、決定滅菌藥劑、濃度、時(shí)間。3．根據(jù)病毒在寄主內(nèi)分布位置決定切取莖尖大小。如果熱處理，那么決定熱處理的溫度、時(shí)間。4．接種成功率與莖形狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。例馬鈴薯、百合生長(zhǎng)點(diǎn)呈半圓形，較大、好分離。番薯、矮牽牛、香石竹呈半圓形，也比較好分離。大麗花、菊花生長(zhǎng)點(diǎn)扁平、被對(duì)生葉原基夾住難分離。草莓，葉原基上生有密集茸毛，生長(zhǎng)點(diǎn)埋在肉質(zhì)凹形槽內(nèi)，不僅難分離且容易污染。第51頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、無(wú)病毒植物的鑒定

通過(guò)莖尖分生組織培養(yǎng)、熱處理脫毒法、微體嫁接法而培養(yǎng)成的植株，不一定都是無(wú)病毒植株。當(dāng)前用于病毒檢測(cè)的方法有如下3種：①血清鑒定法；②生物鑒定法(敏感植物或指示植物)；③電子顯微鏡鑒定法。采用單一鑒定法并不十分可靠。特別是對(duì)一些特異性病毒，單一鑒定方法可靠性更差。最好三種方法同時(shí)鑒定，可以獲得理想的結(jié)果。第52頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(一)指示植物鑒定法1、原理

指示植物法是利用病毒在其它植物上產(chǎn)生的枯斑作為病毒種類鑒別的標(biāo)準(zhǔn)，也即枯斑和空斑測(cè)定法。第53頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、指示植物兩種類型一種是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，擴(kuò)展到植物非接種部位，通常沒(méi)有局部明顯病斑；另一種是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)斑構(gòu)成。常用的指示植物：千日紅、曼陀羅、豇豆、心葉煙、辣椒、莨菪等。

第54頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月每種病毒都有自己的敏感植物如：馬鈴薯病毒的敏感植物：千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼陀羅；大蒜病毒的敏感植物：藜、千日紅；草莓病毒的敏感植物：威州草莓(從八倍體野生種選出)、野草莓、野紅草莓等。桃紅葉病毒的敏感植物：旱金蓮。大麗花病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜、心葉煙、克里芙蘭煙、矮牽牛、黃瓜。香石竹病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜。菊花病毒的敏感植物：矮牽牛、豇豆。第55頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、敏感植物鑒定病毒的方法：

A、摩擦接種法：取培養(yǎng)植株的葉片榨汁，將其汁用摩擦法接種到各自的敏感植物上，然后視其病斑有無(wú)，來(lái)判斷是否脫除了病毒。接種后如若敏感植物葉片表現(xiàn)病斑，可根據(jù)病斑類型判斷，還有哪種病毒沒(méi)有脫除。

第56頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例：馬鈴薯體內(nèi)各種病毒在其敏感植物上表現(xiàn)的癥狀：X病毒侵染千日紅(葉片呈枯斑)；M、S病毒侵染千日紅(葉片呈突起枯斑)；X病毒侵染黃花煙(葉片呈花葉)；Y病毒侵染黃花煙(葉片花葉或條斑或呈明顯脈綠帶)；X病毒侵染心葉煙(葉片呈花葉)；Y病毒侵染心葉煙(葉片呈條斑)；P／G帶毒體侵染心葉煙(葉片呈花葉)；M、Y病毒侵染毛葉曼陀羅(葉片呈枯斑)。植物汁液摩擦接種后，如使千日紅葉片呈枯斑，使黃花煙、心葉煙葉片呈花葉證明，該植物體內(nèi)具有馬鈴薯X病毒。第57頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月B．嫁接法：有些病毒不是通過(guò)汁液傳播，而是通過(guò)專門(mén)的介體傳播。如草莓黃化病毒、草莓叢枝病毒是通過(guò)一種特殊的蚜蟲(chóng)為介體進(jìn)行傳播。這種病毒的鑒定，需將培養(yǎng)植株的芽嫁接在敏感植物上，根據(jù)敏感植物的病癥表現(xiàn)來(lái)判斷是否脫除了病毒。第58頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月木本多年生植物及草莓等無(wú)性繁殖的草本植物通常采用嫁接接種的方法以指示植物作砧木，被鑒定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法為多。如草莓以對(duì)病毒敏感的歐洲草莓（野草莓）和深紅莓作指示植物，從經(jīng)脫毒得到的植株上僅取頂端一小葉作接穗，葉柄用刀片削成楔形，削面長(zhǎng)8~10mm，然后迅速將接穗小葉的葉柄插入切口，用塑料綁縛接合部，嫁接后4周，若帶有病毒，則在新展開(kāi)的葉片、匍匐莖或老葉上會(huì)出現(xiàn)病征第59頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（二）抗血清鑒定法1、基本原理：當(dāng)動(dòng)物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一種特異性丙種球蛋白稱為免疫球蛋白，即所謂“抗體”。引起形成抗體的物質(zhì)(病毒或異體蛋白)稱為“抗原”。第60頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抗原和抗體結(jié)合，表現(xiàn)為很強(qiáng)的特異性。即由一種病毒產(chǎn)生的抗體，只能結(jié)合該種病毒。抗體在特殊細(xì)胞內(nèi)形成，進(jìn)入血液存在于血清和體液內(nèi)。這種含有特異性“抗體”的血清稱為“抗血清”。抗原和抗體相結(jié)合的反應(yīng)稱為“血清反應(yīng)”。第61頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.病毒抗血清在診斷上的價(jià)值

A.病毒抗血清具有高度的專化性。即由一種病毒產(chǎn)生的“抗體”，只能結(jié)合該種病毒(抗原)。如由注射(感染)TMV而產(chǎn)生的抗體(免疫球蛋白)，只能檢測(cè)TMV病毒(才可能發(fā)生血清反應(yīng))。B．由于“抗血清”法具有高度專化性，因此對(duì)于那些受感染而沒(méi)有癥狀的帶毒植物，也能診斷，故在實(shí)用上具有很高的價(jià)值。C．由于病毒與“抗血清”的“反應(yīng)量”與病毒濃度成正比。只要知道其中一種濃度，可根據(jù)反應(yīng)量來(lái)測(cè)定另一種的濃度。故此可以用來(lái)作病毒的定量分析。第62頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.病毒抗血清在診斷上的局限性：A.不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黃化型”病毒，或嚴(yán)格由專化性昆蟲(chóng)傳播的病毒。如馬鈴薯卷葉病毒極難或不能獲得“抗血清”。B．病毒在寄主體內(nèi)含量太少，而提純過(guò)程中喪失又太多?；蛘咛峒冞^(guò)程中，病毒質(zhì)粒喪失了必備的抗原結(jié)構(gòu)。C．植物體內(nèi)具有單寧物質(zhì)，單寧與病毒結(jié)合，使病毒喪失了抗原性質(zhì)。第63頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、方法抗血清鑒定首先要進(jìn)行抗原的制備，包括病毒的繁殖、病葉研磨、汁液的澄清、病毒懸浮液的提純、病毒的沉淀等過(guò)程。只有獲得高純度的抗原，才有可能獲得高度純凈的抗血清。一般采用家兔制備抗植物病毒的抗血清，以9~24個(gè)月大小的家兔為好，注射病毒懸浮液，在家兔饑餓12h后采血，再進(jìn)行抗血清的分離和吸收等過(guò)程。血清可分裝在小玻璃瓶中，貯存在－15~－20℃的冰凍條件下，也可以分裝在安瓶中，冷凍干燥，然后密封，有效保存。第64頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月具體測(cè)定可采用沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等多種方法。第65頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酶聯(lián)免疫吸附法

(enzyme1inkedimmunosorbentassay，EL工SA)酶聯(lián)免疫吸附法是把抗原—抗體的免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相互結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種綜合性技術(shù)，它的靈敏度高，特異性強(qiáng)，特別是當(dāng)寄主體內(nèi)病毒濃度很低或同時(shí)存在病毒鈍化物或抑制劑時(shí)，它的優(yōu)勢(shì)尤為明顯，因而是近年來(lái)病毒檢測(cè)方法中發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的一種方法。第66頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酶聯(lián)免疫吸附法的原理利用以酶標(biāo)記的特異抗體來(lái)指示抗原—抗體的結(jié)合，從而檢出樣品中的抗原。具體操作程序是：將待檢植物汁液(抗原)注入酶聯(lián)板(聚苯乙烯多孔微量反應(yīng)板)中，使抗原吸附于它的孔壁，然后加入以酶標(biāo)記的特異抗體，待抗原與抗體充分反應(yīng)后，洗去未與抗原結(jié)合的多余酶標(biāo)記抗體，于是在固相載體酶聯(lián)板表面就只留下以酶標(biāo)記的抗原—抗體復(fù)合物。這時(shí)加入酶的無(wú)色底物，復(fù)合物上的酶催化底物降解，生成有色產(chǎn)物。這一結(jié)果可用肉眼識(shí)別，也可用分光光度計(jì)對(duì)底物的降解量進(jìn)行測(cè)定。第67頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月血清鑒定法第68頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月血清鑒定的基本方法A.玻璃片凝集法在清潔玻璃片的一端，用毛細(xì)管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量對(duì)照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出的原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置20-50min，然后在40-60倍顯微鏡下觀察。帶病毒的葉綠體發(fā)生典型的凝集現(xiàn)象。第69頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月玻璃片凝集法第70頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月B．微量凝集試驗(yàn)(MAT)在培養(yǎng)皿底部，鋪上一層火棉膠或聚乙烯醇縮甲醛薄膜，然后將抗血清、提取汁液滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆蓋一層石蠟油。在20—25℃下保溫，20-50min后觀察。此法優(yōu)點(diǎn)：鑒定時(shí)可以完全避免蒸發(fā)，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培養(yǎng)皿可以鑒定幾十個(gè)樣品。對(duì)某些病毒(馬鈴薯M病毒)引起的細(xì)微病毒凝聚現(xiàn)象均可識(shí)別。第71頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）電子顯微鏡檢查法采用電子顯微鏡，可以通過(guò)直接觀察，檢查出有無(wú)病毒存在，并可以得知有關(guān)病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu),又可以鑒定病毒的種類。這是一種較為先進(jìn)的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。

病毒

形態(tài)長(zhǎng)(nm)寬（nm）

X線狀51513Y線狀73011A線狀73011S線狀65012~13M線狀65012~13第72頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測(cè)定病毒。目前運(yùn)用負(fù)染和超薄切片電鏡觀察能夠診斷和鑒別病毒到屬的水平。1973年，Derrick把電鏡與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，建立了更為靈敏的免疫吸附電鏡技術(shù)，該技術(shù)已成為植物病毒研究的一個(gè)重要手段。方法的優(yōu)點(diǎn)第73頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(四)分子生物學(xué)方法在植物病毒鑒定中采用的分子生物學(xué)方法主要是檢測(cè)病毒的核酸。一般都具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。核酸雜交技術(shù)的原理:采用帶有放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的已知序列核酸單鏈作為探針，在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。通過(guò)雜交信號(hào)的檢測(cè)，鑒定樣本中有無(wú)相應(yīng)病毒的基因。第74頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月19世紀(jì)末以來(lái)，許多國(guó)家開(kāi)始用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)果樹(shù)病毒，并取得很好的效果。常用的有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)，即利用已知病毒的核苷酸序列或同組病毒的相似序列區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)引物，將待測(cè)樣品用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增后的產(chǎn)物可進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNARAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturinggradegelelectrophoresis，DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationpolymorphism，SSCP)、探針交叉雜交等技術(shù)分析檢測(cè)病毒是否存在。第75頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月由于多數(shù)植物病毒核酸是RNA，在進(jìn)行PCR檢測(cè)前，需以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，再利用病毒核酸特有的序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，即可知道在寄主中是否有病毒存在。RNA病毒和類病毒等在寄主體內(nèi)可形成雙鏈RNA(dsRNA)，而一般情況下植物體內(nèi)不存在dsRNA，因此dsRNA分析也可用于植物病毒鑒定。第76頁(yè)，課件共86頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月利用DNA雜交和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的基因芯片技術(shù)也是植物病毒快速檢測(cè)的重要發(fā)展方向。在實(shí)際應(yīng)用中，為了提高檢測(cè)的可靠性，往往用幾種方法同時(shí)鑒定。最后選擇出的無(wú)毒苗即可進(jìn)行擴(kuò)增繁殖，用于生產(chǎn)。但在無(wú)毒種苗的