原理及操作流程詳解

原理及操作流程詳解演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)優(yōu)選原理及操作流程目前二頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)Westernblot

原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。目前三頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。Westernblot

原理目前四頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)WesternBlot操作流程蛋白樣品的制備（蛋白抽提、定量）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS凝膠制備、上樣）轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色目前五頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)水溶液提取法針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。細(xì)胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0有機(jī)溶劑提取法對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。一、蛋白樣品的制備目前六頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)蛋白樣品的定量(Bradford法

)原理—考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（插入表格）檢測(cè)樣品蛋白含量：取一管考馬斯亮藍(lán)+95l0.15mol/LNaClNaCl溶液+5l待測(cè)蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入比色杯中測(cè)試。目前世界上最常用的蛋白濃度檢測(cè)方法是：BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCA

Protein

Assay

Kit)Bradford法蛋白定量試劑盒（Bradford

Protein

Assay

Kit)

。二、蛋白定量目前七頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒BCA

法與傳統(tǒng)方法相比，更簡(jiǎn)單、更穩(wěn)定、更靈敏度。

BCA法測(cè)定蛋白濃度兼容性亦很好，其不受大部分樣本中其他成分的影響，對(duì)于5%以內(nèi)的SDS、Triton

X-100、Tween

20、Tween

80具有很好的兼容性。BCA法測(cè)定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑影響。在BCA法測(cè)定蛋白濃度前，應(yīng)盡量使EDTA濃度≤m10M;

DTT濃度≤1mM，2-ME≤0.01%。

BCA法在50～1000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，

其最小檢出量為25μg/ml。目前八頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)

20-30ug

細(xì)胞/組織裂解物

100ng

純化蛋白根據(jù)蛋白表達(dá)豐度調(diào)整適當(dāng)?shù)牡鞍咨蠘恿可蠘恿恳恢拢好靠咨蠘恿勘３忠恢律蠘忧坝胠oadingbuffer加熱變性樣本三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳目前九頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，因此電泳時(shí)可以從負(fù)極向正極移動(dòng)Anode-內(nèi)槽緩沖液帶有負(fù)電荷，與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cathode+帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從上到下運(yùn)動(dòng)（負(fù)極到正極），分開(kāi)電泳進(jìn)程可以根據(jù)前沿指示劑來(lái)確定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑的比較快.蛋白根據(jù)分子量大小分開(kāi)標(biāo)本加入到上樣孔中目前十頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)-濾紙凝膠膜濾紙+目前十一頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)目前十二頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)四、WesternBlot

轉(zhuǎn)膜

分離的蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)膜方式從凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交膜上（PVDF或NC膜）PVDF膜：價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。NC膜（硝酸纖維素膜）：價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。目前十三頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)WesternBlot的具體步驟轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備目前十四頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)制作“三明治”“黑膠白膜”WesternBlot的具體步驟轉(zhuǎn)膜

目前十五頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)WesternBlot的具體步驟轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜條件：推薦：100V，1——2小時(shí)；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。目前十六頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)WesternBlot的具體步驟轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)：（立春紅染色）

為檢測(cè)轉(zhuǎn)膜是否成功，可用相關(guān)染料對(duì)膜進(jìn)行染色。1x立春紅5min染色前染色后目前十七頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)五、封閉脫脂奶粉（含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液）BSAWesternBlot

膜封閉液（生物試劑公司提供）不能用于磷酸化蛋白！目前十八頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一抗溶液與濾膜溫育，室溫小時(shí)或4℃過(guò)夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。加入配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫一小時(shí)或4℃過(guò)夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。目前十九頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)七、二抗與底物反應(yīng)顯色ECL化學(xué)發(fā)光顯色

比較常用，結(jié)果容易控制，但是被催化是靈敏度差一點(diǎn)DAB顯色

比較靈敏，是HRP最敏感的底物目前二十頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)WesternBlot

需要的主要試劑目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)主要試劑1. 1.0mol/LTris?HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)12.114g蒸餾水100ml溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至6.8），室溫下保存。2. 1.5mol/LTris?HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)18.671g蒸餾水100ml溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至8.8），室溫下保存。3. 10％SDSSDS10g蒸餾水至100ml如溶解困難，可在50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)4. 10％過(guò)硫酸胺（AP）過(guò)硫酸胺0.1g蒸餾水1ml（現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過(guò)硫酸胺干粉稱好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多裝幾管，使用時(shí)加入蒸餾水水即可，溶解后，4℃保存，保存時(shí)間為1周）5． 四甲基乙二胺原液（TEMED）：4℃保存。6． 30%丙稀酰胺：4℃保存。7．5X電泳液緩沖液Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.00g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存,用時(shí)稀釋5倍，通常取160ml配制成800ml即可。8．10X轉(zhuǎn)膜緩沖液甘氨酸（MW75.07）151.1gTris（MW121.14）30.3g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存,用時(shí)稀釋10倍，并加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸餾水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易產(chǎn)生沉淀）目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)9． 10XTBS緩沖液Tris（MW121.14）24.2gNaCl80.0g蒸餾水至1000ml（濃鹽酸調(diào)pH至7.6），溶解后室溫保存。10．1XTBST緩沖液10XTBS緩沖液100ml蒸餾水900mlTween-201ml因Tween-20比較粘稠，應(yīng)緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防止產(chǎn)生氣泡。溶解后室溫保存。11．封閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶)：

1XTBST緩沖液95-100ml脫脂奶粉5g溶解后4℃保存，可于一周內(nèi)使用。目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)WB需要試劑－膜常用的有PVDF膜，硝酸纖維素膜或者尼龍膜目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)目前二十七頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)主要目的是確定靶蛋白的分子量大??；使用預(yù)染的Marker還可以實(shí)時(shí)檢測(cè)電泳分離情況，并可以轉(zhuǎn)移到膜上。WB需要試劑－蛋白質(zhì)Marker目前二十八頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)WB需要試劑－一抗選擇適合檢測(cè)標(biāo)本種屬的一抗（說(shuō)明書(shū)有驗(yàn)證）選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說(shuō)明書(shū)有驗(yàn)證）選擇單克隆抗體或者經(jīng)過(guò)親和純化的多克隆抗體根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦的濃度優(yōu)化最佳稀釋比例

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.選擇合適的一抗：目前二十九頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)雜交需要試劑－二抗二抗選擇：根據(jù)一抗來(lái)源種屬以及抗體Ig亞型選擇合適的二抗。二抗的使用：根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦濃度使用TBST稀釋二抗。如果說(shuō)明書(shū)沒(méi)有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)。

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.目前三十頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于二十三點(diǎn)雜交需要試劑－底物顯色底物：操作簡(jiǎn)單，靈敏度低