分子標(biāo)記輔助育種MAS

分子標(biāo)記輔助育種MAS演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)優(yōu)選分子標(biāo)記輔助育種MAS目前二頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)目錄一、簡(jiǎn)介二、應(yīng)用實(shí)例目前三頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)一、簡(jiǎn)介：

分子標(biāo)記輔助選擇(MolecularMarker-AssistedSelectionMAS)是利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行間接選擇,是對(duì)目標(biāo)性狀在DNA水平的選擇,不受環(huán)境影響,不受等位基因顯隱性關(guān)系干擾,選擇結(jié)果可靠,同時(shí)又可避免等位基因間顯隱性關(guān)系的干擾,從而達(dá)到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良;標(biāo)記輔助育種具有標(biāo)記基因型鑒定可以在低世代和植株生長(zhǎng)的任何階段進(jìn)行、共顯性的分子標(biāo)記允許在雜合體階段進(jìn)行鑒定隱性基因、對(duì)目的基因的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記輔助育種它是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物改良的一種手段。其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離的分子標(biāo)記對(duì)選擇個(gè)體進(jìn)行目標(biāo)以及全基因組篩選,從而減少連鎖累贅,獲得期望的個(gè)體,達(dá)到提高育種效率的目的。目前四頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)

分子標(biāo)記輔助選擇是分子標(biāo)記技術(shù)用于作物改良的重要領(lǐng)域,是傳統(tǒng)育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。

分子標(biāo)記（DNA標(biāo)記）：能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。分子標(biāo)記的類型：基于DNA-DNA雜交的分子標(biāo)記，如RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,即限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性）?；赑CR的分子標(biāo)記，RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA，即隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)）限制性酶切和PCR結(jié)合的分子標(biāo)記，AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)）基于DNA序列和芯片的分子標(biāo)記，如SNP（Singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性）。目前五頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇的優(yōu)越性：可以在植物發(fā)育的任何階段進(jìn)行選擇,對(duì)目標(biāo)性狀的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境的影響,可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確的選擇,加速育種進(jìn)程,提高育種效率;共顯性標(biāo)記可區(qū)分純合體和雜合體,不需下代再鑒定,而且在分離世代能快速準(zhǔn)確地鑒定植株的基因型?？捎行У貙?duì)抗病性、抗逆性和根部性狀等表型鑒定困難的性狀進(jìn)行基因型鑒定。在育種項(xiàng)目的初期,育種材料較少,不允許做重復(fù)鑒定,或要冒一定風(fēng)險(xiǎn)。利用分子標(biāo)記技術(shù)則可克服基因型鑒定的困難。可聚合多個(gè)有利基因提高育種效率。克服不良性狀連鎖,有利于導(dǎo)入遠(yuǎn)緣優(yōu)良基因。目前六頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)

影響分子標(biāo)記輔助選擇的主要因素：①標(biāo)記與連鎖基因間的連鎖程度?；亟贿x擇程序中的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可分為前景選擇(foregroundselection)和背景選擇(back-groundselection)。前景選擇是在對(duì)回交群體的選擇中,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)入受體中的與供體優(yōu)良基因座位緊密連鎖的標(biāo)記或基因內(nèi)標(biāo)記的檢測(cè),從而篩選出攜帶目標(biāo)基因的單株。前景選擇的準(zhǔn)確性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖強(qiáng)度,標(biāo)記與基因連鎖得愈緊密,依據(jù)標(biāo)記進(jìn)行選擇的可靠性就愈高。②性狀的遺傳率。性狀的遺傳率極大地影響MAS選擇效率。遺傳率較高的性狀,根據(jù)表型就可對(duì)其實(shí)施選擇,此時(shí)分子標(biāo)記提供的信息量較少,MAS效率隨性狀遺傳率增加而顯著降低。在群體大小有限的情況下,低遺傳率的性狀,進(jìn)行MAS的相對(duì)效率較高,但存在一個(gè)最適的群體大小,在此限之下MAS效率會(huì)降低。目前七頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)群體大小。群體大小是制約MAS選擇效率的重要因素之一。一般情況下,MAS群體大小不應(yīng)小于200個(gè)。選擇效率隨著群體增加而提高,特別是在低世代,遺傳率較低的情況下尤為明顯。選用分子標(biāo)記數(shù)目。理論上標(biāo)記數(shù)越多,從中篩選出對(duì)目標(biāo)性狀有顯著效應(yīng)標(biāo)記機(jī)會(huì)就越大,因而應(yīng)有利于MAS。事實(shí)上,MAS效率隨標(biāo)記數(shù)增加先增后減。MAS效率主要取決于對(duì)目標(biāo)性狀有顯著效應(yīng)的標(biāo)記,因而選擇時(shí)所用標(biāo)記數(shù)并非越多越好。世代的影響。對(duì)基因組中除了目的基因之外的其它部分的選擇,即背景選擇。背景選擇目標(biāo)之一是減少目標(biāo)等位基因載體染色體上供體基因組的比例;目標(biāo)之二是減少非目標(biāo)等位基因載體染色體上的供體基因組。背景選擇盡可能覆蓋整個(gè)基因組,進(jìn)行全基因組的選擇。在早代變異方差大,重組個(gè)體多,中選幾率大。因此背景選擇應(yīng)在育種早期世代進(jìn)行,隨著世代的增加,背景選擇效率會(huì)逐漸下降。目前八頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)⑥控制性狀基因數(shù)目。模擬研究發(fā)現(xiàn),隨著QTL（數(shù)量性狀基因座，它指的是控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置）增加,MAS效率降低。當(dāng)目標(biāo)性狀由少數(shù)幾個(gè)基因(1~3)控制時(shí),用標(biāo)記選擇對(duì)發(fā)掘遺傳潛力較為有效;然而當(dāng)目標(biāo)性狀由多個(gè)基因控制時(shí),由于需要選擇世代較多,加劇了標(biāo)記與QTL位點(diǎn)間的重組,降低了標(biāo)記選擇效果;在少數(shù)QTL可解釋大部分變異的情況下,MAS效率較高。二、應(yīng)用實(shí)例：《利用SNP和EST-SSR分子標(biāo)記鑒定荔枝新種質(zhì)御金球》，孫清明，李永忠，向旭，等，2013年11卷第3期，第403-414頁(yè)，分子植物育種（MolecularPlantBreeding）目前九頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)

此項(xiàng)研究利用自主開(kāi)發(fā)的荔枝SNP和EST-SSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)近年發(fā)掘的荔枝優(yōu)稀種質(zhì)御金球進(jìn)行分子鑒定，明確其與現(xiàn)有的363份荔枝種質(zhì)的親緣關(guān)系，以探索其是否為新種質(zhì)，并揭示親本來(lái)源，為進(jìn)行新品種保護(hù)提供分子證據(jù)。SNP分型技術(shù)首次成功地用于荔枝新種質(zhì)御金球的親本來(lái)源鑒定，為今后荔枝種質(zhì)的鑒別提供了可借鑒手段1、實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料。此研究共用364份。1.2EST-SSR檢測(cè)。引物來(lái)源：引物序列來(lái)自孫清明等(2011)，從中挑選13對(duì)多態(tài)性高，擴(kuò)增穩(wěn)定的EST-SSR引物用于種質(zhì)分析。PCR反應(yīng)：使用BiometraPCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增；94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，28個(gè)循環(huán)；72℃5min。采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓150V,時(shí)間2h)進(jìn)行PCR產(chǎn)物分離，電泳緩沖液(1TBE)，參照McCouch等(1997)的方法進(jìn)行銀染顯色。數(shù)據(jù)分析：利用NTSYS2.10e軟件進(jìn)行相似性數(shù)據(jù)分析，采用SM系數(shù)計(jì)算種質(zhì)之間的相似性系數(shù)，進(jìn)行UPGMA聚類。目前十頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)1.3SNP檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)：將前期獲得的兩個(gè)荔枝品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從中發(fā)掘SNP位點(diǎn)，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。PCR反應(yīng)：利用BiometraPCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：變性(95℃

3min)；50個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95℃

15s,(55±1℃)10s,72℃8s)；變性、復(fù)性(94℃30s,28℃30s）。HRM（高分辨率熔解曲線技術(shù)(highresolutionmelting,HRM)由于具有高通量快速準(zhǔn)確分析簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于人類致病基因突變的SNP分型診斷中）檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析：利用LightCycler(Spectron)進(jìn)行HRM檢測(cè)；利用MEGA5中的Align進(jìn)行序列比對(duì)，UPGMA進(jìn)行種質(zhì)間系統(tǒng)演化分析,并計(jì)算演化分化系數(shù)。2、結(jié)果與分析2.1御金球與現(xiàn)有363份荔枝種質(zhì)的親緣關(guān)系。

13對(duì)EST-SSR引物在供試的364份種質(zhì)中共產(chǎn)生122條譜帶，其中多態(tài)性條帶112條，多態(tài)性比例為91.8%。御金球與其他種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)介于0.1230~0.8770之間，可見(jiàn)，御金球不同于其他363份荔枝種質(zhì)。目前十一頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)

從50對(duì)SNP引物中篩選出17對(duì)（見(jiàn)表）擴(kuò)增效率高分型效果明顯的SNP引物。利用這些引物對(duì)御金球與現(xiàn)有363份荔枝種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系分析結(jié)果表明，17對(duì)SNP引物均表現(xiàn)為二等位性，御金球與其它363份荔枝種質(zhì)的演化分化系數(shù)介于0.043~1.924之間，可見(jiàn)SNP分型同樣證明御金球是一份新種質(zhì)。目前十二頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)2.2御金球22份疑似親本種質(zhì)的親緣關(guān)系分析。選擇22份御金球的疑似親本種質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行EST-SSR和SNP分子標(biāo)記鑒定分析。

EST-SSR分析表明，御金球與22疑似親本的相似系數(shù)為0.4590~0.8443。從圖3可以看出，御金球與糯米糍的親緣關(guān)系最近(相似系數(shù)為0.8443)，隨后與紅燈籠聚到一起，并最終與懷枝類(同沙遲懷枝,焦核懷枝和懷枝)聚到一起；而與廣東廣西和云南來(lái)源的胭脂紅并未首先聚到一起可見(jiàn)，御金球不同于胭脂紅，而是與糯米糍及懷枝類型的種質(zhì)更相似一些。目前十三頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)SNP分析與EST-SSR的鑒定結(jié)果相似御金球與22份疑似親本種質(zhì)的演化分化系數(shù)介于0.088~1.804之間。其中，與糯米糍的分化系數(shù)最小(0.088)，與三月紅的分化系數(shù)最大。圖4的聚類分析同樣表明，御金球與糯米糍的親緣關(guān)系最近，來(lái)自廣西和廣東的胭脂紅與紅燈籠和焦核懷枝首先聚在一起后，才與糯米糍和御金球這一分支聚到一起。目前十四頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)2.3御金球的親本來(lái)源鑒別。

利用17個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)御金球及其22份疑似親本進(jìn)行等位基因型檢測(cè)。判定親本的標(biāo)準(zhǔn)為一個(gè)位點(diǎn)的二等位基因中，只要有一個(gè)等位基因與御金球的相同，該材料即為御金球的推測(cè)親本。從表4（部分）中可以看出，在22份疑似親本種質(zhì)中，只有焦核懷枝和紅燈籠的17個(gè)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)為二等位基因或其中一個(gè)等位基因與御金球完全相同，因此這兩個(gè)品種為御金球的推測(cè)親本；其余種質(zhì)與御金球存在1~12個(gè)SNP位點(diǎn)的差異。例如：目前十五頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)此外，在SNP35這個(gè)位點(diǎn)上，御金球?yàn)殡s合型AG，焦核懷枝為AA

從表4可以看出，糯米糍(GG)和紅燈籠(AG)在該位點(diǎn)可能成為其另一個(gè)親本的來(lái)源，但從起源時(shí)間上判斷，紅燈籠母樹(shù)樹(shù)齡遠(yuǎn)小于御金球母樹(shù)樹(shù)齡，因此可排除紅燈籠是御金球親本來(lái)源的可能，結(jié)合親緣關(guān)系分析，本研究推測(cè)御金球是來(lái)源于以糯米糍為母本焦核懷枝為父本的有性雜種后代。3、討論

EST-SSR、SNP等分子標(biāo)記是近年開(kāi)發(fā)的兩類特異性強(qiáng)的遺傳標(biāo)記EST-SSR是基于EST文庫(kù)開(kāi)發(fā)的新型SSR標(biāo)記，不同于傳統(tǒng)的基因組SSR(gSSR)標(biāo)記，除具有遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高、檢測(cè)迅速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)外，還反映了基因的外顯子區(qū)段，可以直接獲得基因表達(dá)的信息，這就有可能對(duì)決定重要表型性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定。SNP即為單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(singlenucleotidepolymorphism)，是指由同一位點(diǎn)的不同等位基因之間個(gè)別核苷酸的差異或者小的插入缺失等變異所造成的一種DNA序列的多態(tài)性。目前十六頁(yè)\總數(shù)十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)SNP的共顯性及二等位的特點(diǎn)使得SNP成為一種較為有效的鑒定品種親本來(lái)源的分子標(biāo)記技術(shù)。

分析結(jié)果表明，SNP分型技術(shù)還需要與品種的起源信息相結(jié)合，比如僅從17個(gè)SNP位點(diǎn)(表4)看，焦核懷枝和紅燈籠均可能為御金球的親本之一，但卻無(wú)法判定；從農(nóng)藝性狀如葉片形狀上看，二者與御金球都很相似，但從品種的起源信息看，焦核懷枝是一個(gè)起源較早的品種，但紅燈籠母樹(shù)樹(shù)齡尚不足30年屬于實(shí)生變異，可能為懷枝的自交后代。御金球來(lái)自于廣東省珠海市斗門(mén)鎮(zhèn)斗門(mén)村，其母樹(shù)應(yīng)有