實驗四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉化

實驗四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉化演示文稿目前一頁\總數(shù)三十八頁\編于二點優(yōu)選實驗四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉化ppt目前二頁\總數(shù)三十八頁\編于二點重組DNA技術操作步驟目前三頁\總數(shù)三十八頁\編于二點基本原理目的基因的獲取DNA導入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

目前四頁\總數(shù)三十八頁\編于二點主要步驟：①制備目的基因和選擇相關載體②目的基因和有關載體進行連接③重組的DNA導入受體細胞④DNA重組體的篩選和鑒定⑤DNA重組體的擴增、表達和其他研究目前五頁\總數(shù)三十八頁\編于二點以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目前六頁\總數(shù)三十八頁\編于二點（三）PCR擴增特定基因（四）人工合成一、目的基因的獲得——分（一）從基因組文庫中獲得

（二）從cDNA文庫中獲得目前七頁\總數(shù)三十八頁\編于二點組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因目前八頁\總數(shù)三十八頁\編于二點限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構建基因文庫目前九頁\總數(shù)三十八頁\編于二點mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉錄酶載體受體菌復制從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目前十頁\總數(shù)三十八頁\編于二點化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。目前十一頁\總數(shù)三十八頁\編于二點幾種常用克隆載體的比較注：+表示可用；-表示不可用比較內(nèi)容質(zhì)粒λ噬菌體黏性質(zhì)粒M13噬菌體克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因組DNA文庫-++-cDNA文庫++--亞克隆+--+序列分析++-+E.coli表達++--二、載體的選擇與準備——選目前十二頁\總數(shù)三十八頁\編于二點三、DNA分子的體外連接——接（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（四）平端連接目前十三頁\總數(shù)三十八頁\編于二點（一）黏性末端目前十四頁\總數(shù)三十八頁\編于二點（二）人工接頭目前十五頁\總數(shù)三十八頁\編于二點（三）加入同聚體尾待克隆DNA片段重組質(zhì)粒混合、退火空白質(zhì)粒目前十六頁\總數(shù)三十八頁\編于二點（四）平端連接目前十七頁\總數(shù)三十八頁\編于二點5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA

λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′5′目前十八頁\總數(shù)三十八頁\編于二點四、外源DNA導入宿主細胞——轉受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式：轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)目前十九頁\總數(shù)三十八頁\編于二點

外源基因?qū)胨拗骷毎?，篩選含有目的基因的陽性克隆并加以擴增。所用的方法主要有遺傳學方法、免疫學方法、核酸雜交法、PCR等。五、目的基因的篩選和鑒定——篩目前二十頁\總數(shù)三十八頁\編于二點1.借助載體上的遺傳標志進行篩選

(1)利用抗生素抗性標志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達特性篩選(3)利用標志補救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進行篩選2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸雜交法(4)DNA測序法

目前二十一頁\總數(shù)三十八頁\編于二點（一）

遺傳學方法1.插入滅活法目前二十二頁\總數(shù)三十八頁\編于二點插入失活篩選帶有重組載體的克隆目前二十三頁\總數(shù)三十八頁\編于二點目前二十四頁\總數(shù)三十八頁\編于二點2.藍-白篩選（α互補）許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal轉化成藍色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源DNA片段，將使lacZ基因滅活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，結果菌落呈現(xiàn)白色。目前二十五頁\總數(shù)三十八頁\編于二點α互補篩選（藍-白篩選）目前二十六頁\總數(shù)三十八頁\編于二點目前二十七頁\總數(shù)三十八頁\編于二點PCR產(chǎn)物的T載體

克隆和轉化

目前二十八頁\總數(shù)三十八頁\編于二點實驗目的：

學習T載體的特點和PCR產(chǎn)物的克隆方法。實驗要求：

掌握利用T載體克隆PCR產(chǎn)物的方法；復習連接實驗流程。技術應用：

目的基因片段與T載體DNA連接，達到克隆基因的目的。目前二十九頁\總數(shù)三十八頁\編于二點材料：目的基因片段（回收的PCR產(chǎn)物）藥品：pEMGT-Vector(Promega公司)目前三十頁\總數(shù)三十八頁\編于二點

質(zhì)粒（plasmid）是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對。常有1~3個抗藥性基因，以利于篩選。目前三十一頁\總數(shù)三十八頁\編于二點質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作?；虮磉_的質(zhì)粒載體

允許外源DNA的插入、儲存和表達。目前三十二頁\總數(shù)三十八頁\編于二點目前三十三頁\總數(shù)三十八頁\編于二點實驗原理普通Taq酶會在3′末端加一個A，這樣所有PCR產(chǎn)物都會在雙鏈DNA的3′端均有一個單鏈狀態(tài)的A；T-載體是線狀DNA片段，在DNA雙鏈的3′端均有一個單鏈狀態(tài)的T；二者在連接酶的作用下連接為一個重組的環(huán)狀分子，從而達到克隆的目的。目前三十四頁\總數(shù)三十八頁\