演示文稿流加發(fā)酵與高密培養(yǎng)

演示文稿流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)目前一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)（優(yōu)選）流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)目前二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)流加發(fā)酵所謂流加發(fā)酵，即補(bǔ)料分批發(fā)酵(Fed-batchfermentation)，有時(shí)又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法目前三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)分批、連續(xù)、流加操作方式的比較目前四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)流加發(fā)酵的研究進(jìn)展在20世紀(jì)70年代以前流加發(fā)酵的理論研究幾乎是個(gè)空白，流加過程控制僅僅以經(jīng)驗(yàn)為主，流加方式也僅僅局限于間歇或恒速流加1973年日本學(xué)者Yoshida等人首次提出了“Fed-BatchFermentation”這個(gè)術(shù)語，并從理論上建立了第一個(gè)數(shù)學(xué)模型，流加發(fā)酵的研究才開始進(jìn)入理論研究階段目前五頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)流加發(fā)酵所取得的三個(gè)方面的重大進(jìn)展

20世紀(jì)70年代中后期對(duì)流加發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)解析結(jié)合發(fā)酵過程的可測(cè)參數(shù)對(duì)流加過程進(jìn)行反饋控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH法、代謝物法、螢光法等）流加發(fā)酵的最優(yōu)化研究目前六頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)流加發(fā)酵最優(yōu)化研究的核心問題是找出最佳的底物流加方式，以維持發(fā)酵過程始終處于最佳狀態(tài)流加發(fā)酵最優(yōu)化的研究?jī)?nèi)容包括：（1）狀態(tài)方程的建立（2）目標(biāo)泛函的確定（3）最優(yōu)化底物流加方式的求解目前七頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)流加發(fā)酵的物料衡算式可以表達(dá)為：流加發(fā)酵的最優(yōu)化理論有：格林原理、龐特里金最小值(最大值)原理等目前八頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)在采用流加發(fā)酵技術(shù)之前要考慮的兩個(gè)問題一、何時(shí)采用流加發(fā)酵方式？二、如何進(jìn)行底物的流加？目前九頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)一、何時(shí)采用流加發(fā)酵方式？所用底物在高濃度時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用

高菌體濃度培養(yǎng)即高密度培養(yǎng)系統(tǒng)非生長(zhǎng)耦聯(lián)性次級(jí)代謝產(chǎn)物(如產(chǎn)物的合成需要某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或前體)利用營(yíng)養(yǎng)突變體的系統(tǒng)(過量加入營(yíng)養(yǎng)物只能使菌體迅速生長(zhǎng)，而目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量會(huì)減少。而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物嚴(yán)重缺乏時(shí)，菌體生長(zhǎng)受抑制，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也會(huì)減小)

營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)目前十頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)二、如何進(jìn)行流加發(fā)酵操作？1.流加發(fā)酵類型2.采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問題？3.流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定4.合適的流加發(fā)酵類型的確定5.流加方式的應(yīng)用目前十一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)1.流加發(fā)酵類型流加發(fā)酵的分類類別流加方式無反饋控制反饋控制恒流量流加、變流量流加和間歇流加直接控制流加、間接控制流加定值控制流加、程序控制流加、最優(yōu)控制流加

目前十二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)2.采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問題(1)流加什么物質(zhì)？①補(bǔ)充微生物能源和碳源，如在發(fā)酵液中添加葡萄糖、飴糖、液化淀粉。作為消泡劑的天然油脂，有時(shí)也能同時(shí)起到補(bǔ)充碳源的作用②補(bǔ)充菌體所需要的氮源，有機(jī)氮或氨水③加入某些微生物生長(zhǎng)或合成需要的微量元素或無機(jī)鹽④加入酶合成誘導(dǎo)物或前體物質(zhì)目前十三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)(2)如何流加？

a.底物流加速率

b.流加開始時(shí)間及總流加時(shí)間

c.需控制的底物濃度目前十四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)3.流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定最佳底物濃度的確定

(包括菌體生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物合成階段)b.底物的消耗速率c.菌體比生長(zhǎng)速率()d.菌體對(duì)底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yx/s)

及產(chǎn)物對(duì)底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yp/s)目前十五頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)4.合適的流加發(fā)酵類型的確定a.恒速流加(包括單一速率和分階段恒速流加)b.指數(shù)速率流加c.底物在線測(cè)定后的反饋流加(如葡萄糖反饋流加)d.pH-state.DO-stat目前十六頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)5.流加方式的應(yīng)用(1)恒速流加采用恒流速流加培養(yǎng)時(shí)，可得到如下的物料平衡方程式：細(xì)胞平衡：碳平衡：產(chǎn)物平衡：體積平衡：目前十七頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)恒流速流加過程中的流量F的確定：預(yù)試驗(yàn)中所得出的流加時(shí)刻菌體對(duì)所流加基質(zhì)的消耗速率發(fā)酵液中殘留基質(zhì)濃度流加后需要控制的發(fā)酵液中的基質(zhì)濃度目前十八頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)(2)指數(shù)速率流加在菌體生長(zhǎng)階段采用指數(shù)速率流加法的幾點(diǎn)假設(shè)如下：(a)發(fā)酵罐內(nèi)為理想混合；(b)葡萄糖為唯一限制性碳源；(c)殘留菌體對(duì)葡萄糖的產(chǎn)率系數(shù)(YX/s)為常數(shù)；(d)菌體生長(zhǎng)遵循Monod方程。目前十九頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)對(duì)底物葡萄糖進(jìn)行衡算，則：

F為體積流加速率(L/h)，S0為流加液中基質(zhì)濃度(g/L)，Yx/s為菌體對(duì)底物的產(chǎn)率系數(shù)(g/g)，ms為細(xì)胞比維持系數(shù)(g/g/h)，X為菌體濃度(g/L)，V為培養(yǎng)液體積(L)，μ為菌體比生長(zhǎng)速率(h-1)。

目前二十頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)對(duì)菌體量的變化進(jìn)行物料衡算，則：假定為常數(shù)，則上式積分可得：

目前二十一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)

由于生長(zhǎng)符合Monod方程

μ是S的函數(shù)，要使μ恒定，S必須恒定，則有：

目前二十二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)其中tF為開始指數(shù)速率流加的時(shí)間，t≥tF，XF和VF分別為tF時(shí)刻的菌體濃度和發(fā)酵液體積

指數(shù)速率流加的速率F的表達(dá)式為:目前二十三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)指數(shù)速率流加方式在實(shí)際過程中的注意事項(xiàng)：方程中各參數(shù)要預(yù)先求知應(yīng)用時(shí)流加速率F可采用階梯遞增方式進(jìn)行設(shè)定目前二十四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)微生物的高細(xì)胞密度培養(yǎng)目前二十五頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)概述發(fā)酵研究和工業(yè)的一個(gè)主要目標(biāo)是使體積生產(chǎn)率（g/L?h）最大化，即在給定體積中和一定時(shí)間內(nèi)獲得盡可能多的產(chǎn)品數(shù)量。高細(xì)胞密度培養(yǎng)是高生產(chǎn)效率的要求。歷史上，高細(xì)胞密度培養(yǎng)首先建立在酵母上，用以生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白、乙醇和菌體。目前二十六頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)后來，建立起其它的嗜溫菌的高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)各種類型產(chǎn)品。甲基營(yíng)養(yǎng)生物的高密度培養(yǎng)導(dǎo)致了聚羥基烷酸的高效生產(chǎn)。如今，微生物的高細(xì)胞密度培養(yǎng)的范疇已包括細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物（酵母）。概述目前二十七頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)微生物DCW（g/l）細(xì)菌

Methylobacteriumextorquens233Escherichiacoli190180148145Bacillussubtilis184AlcaligeneseutrophusNCIMB11599184Streptomyceslaurentii157Lactococcuslactis141PseudomonasputidaBM01100古細(xì)菌

MarinococcusM52132Sulfolobushibatae114真核

Candidabrassicae268Saccharomycesserevisiae208235Pichiapastoris100HCDC中各種微生物的最大細(xì)胞密度概述目前二十八頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，利用大腸桿菌或其它微生物為宿主表達(dá)重組蛋白（如干擾素、白介素等）在分子和策略上已沒有問題。但為了提高過程的經(jīng)濟(jì)性必需開發(fā)高效的培養(yǎng)和發(fā)酵技術(shù)。對(duì)大腸桿菌的分子生物學(xué)和生理學(xué)知識(shí)的熟識(shí)，使得它成為高細(xì)胞密度培養(yǎng)的先鋒微生物。

概述目前二十九頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)反應(yīng)器生理狀態(tài)μ

代謝流向能量狀況產(chǎn)物目的產(chǎn)物副產(chǎn)物尾氣細(xì)胞條件DO溫度pH培養(yǎng)基攪拌壓力控制微生物HCDC過程示意圖概述目前三十頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)Markl等計(jì)算出，填塞滿長(zhǎng)3μm，直徑1μm細(xì)胞的培養(yǎng)液中，只有25％的空間是培養(yǎng)基。考慮到細(xì)胞干重是濕重的20～25%，細(xì)胞的最大密度應(yīng)該是160～200g(DCW)L。

高細(xì)胞密度帶來的問題：底物對(duì)生長(zhǎng)的限制或抑制產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的抑制CO2和熱量粘度增加、混合不充分氧的限制當(dāng)細(xì)胞濃度超過200g(DCW)L-1時(shí)，培養(yǎng)液的粘度迅速增加，在220g(DCW)L-1幾乎失去流動(dòng)性。

概述目前三十一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)反應(yīng)器HCDC的生物反應(yīng)器類型包括：具有底物流加裝置的通用式攪拌罐反應(yīng)器帶有各種內(nèi)置或外置細(xì)胞維持裝置的攪拌罐反應(yīng)器膜透析反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器陶瓷膜搖瓶目前三十二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)透析反應(yīng)器反應(yīng)器目前三十三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)HCDC問題的解決HCDC遇到的主要問題有：產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的積累對(duì)生長(zhǎng)的抑制氧的限制HCDC中培養(yǎng)基粘度不斷增加，引起混合不充分CO2和熱量的高釋放率下面以大腸桿菌為例，來探討如何解決HCDC中的問題。目前三十四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)大腸桿菌HCDC中乙酸的形成乙酸是大腸桿菌流入中心代謝途徑的碳超過生物合成的需要和產(chǎn)生能量超過細(xì)胞的容量時(shí)產(chǎn)生的。高濃度的乙酸（如pH7，超過5gL-1）會(huì)降低HCDC的生長(zhǎng)速率、生物量和可獲得的最大細(xì)胞密度。乙酸毒害作用的機(jī)理還未被闡明。很有可能是因?yàn)橐种艱NA、RNA、蛋白質(zhì)和脂肪的合成。HCDC遇到的問題目前三十五頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)控制比生長(zhǎng)速率在產(chǎn)生乙酸的臨界值以下

一般可通過控制限制性底物濃度控制比生長(zhǎng)速率。比生長(zhǎng)速率臨界值：在復(fù)合和半合成培養(yǎng)基中，約為為0.2h-1和0.35h-1；在合成培養(yǎng)基中，為0.14h-1。

HCDC遇到的問題減少乙酸合成的方法目前三十六頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)選擇合適的培養(yǎng)基

例如，甘油比葡萄糖吸收進(jìn)入細(xì)胞的速度要慢，可能會(huì)減少流入糖酵解途徑的碳，這會(huì)極大的減少乙酸的合成。HCDC遇到的問題此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸），可減輕乙酸的毒害作用。使用酸和堿調(diào)節(jié)pH而積累下來的鹽會(huì)使乙酸的毒害作用加強(qiáng)。目前三十七頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)大腸桿菌葡萄糖PtaAck乙酸去往其它產(chǎn)物（乙醇、乙醛等）TCA循環(huán)中過剩的碳乙酸代謝過程示意圖磷酸轉(zhuǎn)移酶體系修飾截?cái)嗉訌?qiáng)代謝工程的方法減少乙酸合成CoA目前三十八頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)氧的限制氧經(jīng)常是高細(xì)胞密度培養(yǎng)的限制因素。因?yàn)檠醯娜芙舛群艿汀?5℃、1大氣壓下，水中飽和溶解氧濃度為7mgL-1。HCDC遇到的問題

提高溶氧的方法有：提高通氣速率和攪拌速度富氧空氣和純氧在加壓環(huán)境下培養(yǎng)目前三十九頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)混合的限制HCDC的另一個(gè)物理限制。發(fā)酵罐體積越大問題越明顯?？拷M(jìn)料口部分的細(xì)胞暴露在高濃度營(yíng)養(yǎng)物中。而其它位置的細(xì)胞則處于饑餓狀態(tài)。HCDC遇到的問題有必要研究發(fā)酵罐中的攪拌模型，找到改善攪拌的方法。目前四十頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)二氧化碳和放熱的影響HCDC中高細(xì)胞密度培養(yǎng)中的二氧化碳會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。高CO2分壓（>0.3atm）會(huì)降低生長(zhǎng)速率并刺激乙酸的生成。放熱也是高細(xì)胞密度培養(yǎng)的一個(gè)問題。這些問題可通過降低細(xì)胞比生長(zhǎng)速率而部分的解決。熱量的主要來源是攪拌產(chǎn)生的機(jī)械熱和細(xì)胞代謝產(chǎn)生的熱量。HCDC遇到的問題目前四十一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)溫度的影響把培養(yǎng)溫度從37℃降到26－30℃，會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)速度，因此會(huì)減少有毒副產(chǎn)物和代謝產(chǎn)生的熱量。降低溫度也能減少細(xì)胞對(duì)氧的需求。降低重組細(xì)胞溫度也有可能減少包含體形式的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。以上這些優(yōu)點(diǎn)說服了許多研究者使用低溫，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行高細(xì)胞密度培養(yǎng)。HCDC遇到的問題目前四十二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)流加控制策略有兩種主要的營(yíng)養(yǎng)流加控制策略：開環(huán)（無反饋）控制閉環(huán)（反饋）控制補(bǔ)料方式是高細(xì)胞密度培養(yǎng)取得成功的關(guān)鍵因素。它不僅影響最大可獲得細(xì)胞的濃度，而且影響細(xì)胞的產(chǎn)率。產(chǎn)物形成會(huì)受各種補(bǔ)料策略的影響。高細(xì)胞密度培養(yǎng)通常在營(yíng)養(yǎng)（碳）限制的條件下進(jìn)行。目前四十三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)條件預(yù)設(shè)參數(shù)開環(huán)（無反饋）控制流加控制策略DO溫度pH培養(yǎng)基攪拌壓力流加控制目前四十四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(diǎn)無反饋控制的流加策略恒速流加——以預(yù)先決定的（恒定的）速率流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，比生長(zhǎng)速率逐漸降低。加速流加——以逐漸增加的速率流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?？裳a(bǔ)償一些比生長(zhǎng)速