第五章大腸桿菌基因工程

基因表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)第五章外源基因的表達(dá)一、大腸桿菌基因工程二、酵母桿菌基因工程三、哺乳動(dòng)物基因工程四、高等植物基因工程五、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化一、大腸桿菌基因工程E.coli作為表達(dá)外源基因受體菌的特征外源基因在E.coli中高效表達(dá)的原理E.coli基因工程菌的構(gòu)建策略基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策利用重組E.coli生產(chǎn)人胰島素（一）E.coli作為表達(dá)外源基因受體菌的特征E.coli表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：全基因組已測(cè)序，共有4,405個(gè)開(kāi)放閱讀框架，大部分基因生物學(xué)功能已鑒定；基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善；繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。E.coli表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的翻譯后加工修飾系統(tǒng)，如糖基化、磷酸化；缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能，表達(dá)產(chǎn)物多以無(wú)活性的包涵體形式存在；內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定；細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素，痕量?jī)?nèi)毒素即可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。（二）外源基因在E.coli中高效表達(dá)的原理強(qiáng)化蛋白質(zhì)生物合成抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)物降解恢復(fù)蛋白質(zhì)特異性空間構(gòu)象啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)?？截悢?shù)強(qiáng)化蛋白質(zhì)生物合成1、啟動(dòng)子(promoter,P)啟動(dòng)子：位于結(jié)構(gòu)基因上游，能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，長(zhǎng)40-60bp。因此，E.coli表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子必須是E.coli啟動(dòng)子。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。

E.coli的RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子。位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游35bp處，由10bp組成，5’-TGACA。E.coli啟動(dòng)子是由兩段彼此分開(kāi)且又高度保守的核苷酸序列組成：位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5-10bp處，由6-8bp組成，5’-TATAAT，富含A和T，又稱(chēng)TATA盒。-10區(qū)：-35區(qū)：-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結(jié)合-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近，DNA被解旋成單鏈，RNA聚合酶使第1和2個(gè)核苷酸形成磷酸二酯鍵，并在其作用下向前推進(jìn)，形成新生mRNA鏈。TGACATATAAT-35區(qū)-10區(qū)+1位

轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄-10區(qū)和-35區(qū)的堿基組成及其間隔序列。啟動(dòng)子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的距離。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱取決于：?jiǎn)?dòng)子是控制外源基因轉(zhuǎn)錄的重要元件，mRNA生成速率與其強(qiáng)弱密切相關(guān)。-10和-35區(qū)與保守序列（5’-TATAAT、5’-TGACA）相似度越高，啟動(dòng)子活性越強(qiáng)。-10和-35區(qū)的間距越接近17bp，啟動(dòng)子活性越強(qiáng)。-10區(qū)和-35區(qū)的堿基組成及其間隔序列：大多數(shù)E.coli啟動(dòng)子與所屬基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的距離是6-9bp，但對(duì)外源基因而言，這個(gè)距離范圍未必最佳。啟動(dòng)子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的距離：1）啟純動(dòng)子宋最佳夫距離逃的探威測(cè)目的共基因EEAEE啟動(dòng)卡子A酶切哭開(kāi)Ba窩l3漁1酶解目的謊基因?qū)⒛空b的基戲因插許在一赤個(gè)強(qiáng)倍啟動(dòng)謝子下嫂游，賤若克喘隆菌朱內(nèi)檢皮測(cè)不屬到mR軋NA，有別必要翅考慮祖調(diào)整座啟動(dòng)洽子與融基因搞之間頁(yè)的距站離。2）啟幸動(dòng)子委的篩纏選：探針碧質(zhì)粒pK蟻O1的報(bào)告胸基因：半乳曉糖激用酶基裹因ga辟lK終止撈子Am縮慧pror鄙i無(wú)啟質(zhì)動(dòng)子的ga仿lKpK掩O13.趨9槍kb用同位素32P標(biāo)記ATP，測(cè)定從ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖的32P的放射性強(qiáng)度，可推算galK表達(dá)的半乳糖激酶的量，由此比較啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。3）啟乎動(dòng)子怒的構(gòu)藏建：-3邀5午區(qū)序攀列-1催0俱區(qū)序耗列啟動(dòng)保子核來(lái)煌源Pla懶cPtr節(jié)pPLPre飽cAPta繞cT陜T胃T開(kāi)A戴C丈AT保T辨G拐A概C呈AT京T任G粥A挑C傍AT敬T額G敲A餡T珍AT信T牢G辜A譯C屆AT澤A加T猶A盾A晉TT獨(dú)T呼A傳A淘C答TG媽A袋T冒A婆C區(qū)TT柄A窮T綁A慈A無(wú)TT權(quán)A濟(jì)T猾A雅A請(qǐng)TPta捎c=3Ptr蘿p=11Pla搖c雙Pla陵c串聯(lián)=2.注4Pla險(xiǎn)c乳糖講操作月子色氨巨酸操杏作子噬菌拌體早講期操收作子re爹cA基因Ptr暮p-3溉5區(qū)+Pla羨c-1兆0區(qū)4）啟閃動(dòng)子店的可咳控性卸：外源迅基因權(quán)的全桌程高埋效表廢達(dá)，析會(huì)對(duì)E.功co蠢li的生理祝生化過(guò)程匙造成辦不利祝影響身。外源閱基因仍持續(xù)店高效賠表達(dá)康的重展組質(zhì)酒粒，所在細(xì)勵(lì)胞若蝕干次漲分裂洞后，崇會(huì)部頌分甚鐘至全戴部丟如失，幟導(dǎo)致重組錦菌不穩(wěn)該定。措施主：利用可控耽性啟師動(dòng)子，調(diào)予整外簡(jiǎn)源基倍因的芝表達(dá)虜時(shí)序肯，通單過(guò)啟鑰動(dòng)子范活性獲的定爹時(shí)誘蠅導(dǎo)，蓄將外遣源基辱因的逗轉(zhuǎn)錄菌啟動(dòng)糊限制吵在受四體細(xì)鏡胞生約長(zhǎng)的孫某一青特定佳階段六。目前灑廣泛凡應(yīng)用棍的E.顛co鍬li可控梯性啟邪動(dòng)子炭來(lái)自翻相應(yīng)異的操怎縱子凳，都綱含有貴與阻遏生蛋白特異墳性結(jié)拌合的隔操縱躺子序萍列，變其介迷導(dǎo)的輩外源再基因寺在E.辨co苗li中通謊常以風(fēng)極低財(cái)?shù)幕缀硭奖磉_(dá)際。乳糖元啟動(dòng)桿子Pla潤(rùn)c的可評(píng)控性冶：高效轉(zhuǎn)錄乳糖、IPTG誘導(dǎo)PlacOlac乳糖、IPTG可解除阻遏作用，誘導(dǎo)Plac介導(dǎo)的目的基因表達(dá)。PlacOlac野生型Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起?；姿睫D(zhuǎn)錄阻遏蛋白無(wú)誘導(dǎo)物存在時(shí)，Plac受阻遏蛋白阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底水平表達(dá)。色氨串酸啟偵動(dòng)子Ptr泥p的可象控性撤：PtrpOtrpPtrp受Trp-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底水平?；姿睫D(zhuǎn)錄Trp阻遏蛋白高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp在操作上，去除Trp困難，往往通過(guò)加入IAA，誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目的基因表達(dá)。除去Trp高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp或加入IAA在培養(yǎng)體系中，去除Trp或加入3-吲哚丙烯酸(IAA)，可解除阻遏作用。噬菌智體啟博動(dòng)子PL的可欲控性倍：升溫至42℃時(shí)，cI857失活脫落，解除阻遏作用，PL便可介導(dǎo)目的基因高效表達(dá)。高效表達(dá)PL目的基因42℃PL目的基因基底水平表達(dá)cI857PL受溫度敏感的cI857阻遏蛋白阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底水平。在大睜型發(fā)疫酵罐坦中迅螞速升黨溫困披難，賺常使讓用雙質(zhì)靈粒控制點(diǎn)系統(tǒng)債，間戶(hù)接控黨制目羊的基倚因表策達(dá)。cI857PtrpAIAA去阻遏BPL目的基因阻遏作用B表達(dá)PLPtrpATrp目的基因cI857應(yīng)是跪誘導(dǎo)分型的者，可具通過(guò)淚簡(jiǎn)單患方式芽、使?jié)M用廉泥價(jià)誘蓬導(dǎo)物雖誘導(dǎo)癥，如勵(lì)溫度中誘導(dǎo)減、IP除TG誘導(dǎo)電。最佳浩啟動(dòng)再子必價(jià)須具幻玉備條煮件：必須稍是強(qiáng)彈啟動(dòng)拍子，付能使高外源印基因徑表達(dá)蝕量達(dá)裂細(xì)胞朝總蛋悟白的10酬-3顆0%以上茅；應(yīng)呈臂現(xiàn)低拴水平主的基嘩礎(chǔ)轉(zhuǎn)滋錄；2、終角止子(t揚(yáng)er廉mi并na清to屈r,艇T鳴)強(qiáng)化拐轉(zhuǎn)錄盈終止光的必選要性扶：過(guò)長(zhǎng)億轉(zhuǎn)錄佳物的鑒產(chǎn)生們會(huì)影竟響外怕源基錢(qián)因的落表達(dá)蔑。外源燈基因央在強(qiáng)穗啟動(dòng)硬子控工制下酒表達(dá)沖，易書(shū)發(fā)生建轉(zhuǎn)錄揮過(guò)頭鴉現(xiàn)象泄，RN隆A聚合僚酶滑尤過(guò)終禿止子礦，繼刷續(xù)轉(zhuǎn)覆錄鄰掀近序房誠(chéng)列，偷形成盟長(zhǎng)短釘不一墾的mR埋NA混合純物。過(guò)長(zhǎng)疾轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物產(chǎn)影響搏外源冤基因口表達(dá)筆的原爬因：1）轉(zhuǎn)芽錄產(chǎn)汪物越專(zhuān)長(zhǎng)，RN推A聚合葡酶轉(zhuǎn)帝錄一橡分子mR迷NA所需許的時(shí)組間就攝相應(yīng)耕增加賭，外宣源基燦因轉(zhuǎn)日錄效畢率下冠降。2）若熊外源存基因娃下游赤緊接第載體治的重動(dòng)要功件能基燦因，史則RN率A聚合咳酶在亭此處微的轉(zhuǎn)歲錄，央可能貧干擾兄其生醉物功晨能，豪甚至現(xiàn)導(dǎo)致川其不壯穩(wěn)定繩性。4）過(guò)依長(zhǎng)的mR踢NA往往村不能濃形成國(guó)理想登的二疲級(jí)結(jié)寫(xiě)構(gòu)，寸大大墊降低讀翻譯概效率破。3）過(guò)蓋長(zhǎng)的mR潑NA往往皺產(chǎn)生蹄大量慨無(wú)用碼的蛋吊白質(zhì)悅，增咸加工腹程菌婚無(wú)謂哭的能塌量消勺耗。pC贏P1Am靠pror奪iTcr篩選Am惰pr、Tcs的轉(zhuǎn)壩化子也可女通過(guò)探針?lè)嘿|(zhì)粒篩選璃，鞭唯一犁的克歉隆位盈點(diǎn)處來(lái)于啟岸動(dòng)子物和報(bào)告周基因的翻堆譯起忍始密疏碼子列之間宮，當(dāng)絡(luò)終止編子插至入該旺位點(diǎn)瓶時(shí)，誘由啟柿動(dòng)子森介導(dǎo)燭的報(bào)史告基虎因轉(zhuǎn)集錄被針?lè)忾]數(shù)，從壯而減報(bào)少或警阻斷然報(bào)告辭基因掌的表枕達(dá)。PT強(qiáng)終桑止子雁的選橫擇與赤使用界：對(duì)終身止作秒用較輸弱的譯終止歌子，穩(wěn)可采隙用二聚唉體終止乓子串歸聯(lián)的股特殊獅結(jié)構(gòu)郊，以丘增強(qiáng)要轉(zhuǎn)錄葵終止柱作用查。常用賣(mài)終止致子來(lái)鞠自E.裕co犬lirR去NA操縱珍子上膽的rr御nT1鄭T2、T7噬菌且體DN母A上的T。E.辯co昏li偏愛(ài)謊使用隙終止賢密碼總子UA毯A，當(dāng)叨其后泥連上無(wú)一個(gè)U而形解成四閘聯(lián)核遙苷酸惱時(shí)，聰轉(zhuǎn)譯節(jié)終止頁(yè)效率民會(huì)得儉到進(jìn)牙一步旨加強(qiáng)恭。3、核于糖體子結(jié)合狀位點(diǎn)外源棍基因可在E.兵co浮li中的復(fù)高效唱表達(dá)皂不僅古取決摔于轉(zhuǎn)若錄啟彼動(dòng)的愛(ài)頻率疲，還察與mR浮NA的翻譯笛起始傳效率密切佳相關(guān)帥。結(jié)構(gòu)伯不同得的mR鑄NA分子腔具有窄不同洋的翻諒譯效勞率，弟差別爛高達(dá)茫數(shù)百萌倍。mR鍋NA的翻抗譯起贈(zèng)始效尋率主溫要由精其5’端的魚(yú)結(jié)構(gòu)晝序列夸決定何，即核糖捏體結(jié)月合位磁點(diǎn)(r間ib喬os遇om聚al洋b籮in叉di奸ng尚s請(qǐng)it船e,RB友S)。1）SD序列欄：E.戰(zhàn)co編liRB隆S的結(jié)嗚構(gòu)：識(shí)別警核糖華體小潮亞基箭中1液6S票rR蜜NA原3揉’端區(qū)悉域3’-鬧AU拘UC量CU扣CC迫-5僚’，并掛與之炮專(zhuān)一擦性結(jié)顫合，呼將mR債NA定位塔于核純糖體猜上，企啟動(dòng)緊翻譯汽。位于盲翻譯障起始嚇密碼菜子上財(cái)游的丙6-盾8個(gè)枯核苷廊酸序列：5’叔-UA鬧AG校GA胃GG-3興’。2）翻梨譯起胞始密怖碼子圈：E.佛co洽li絕大雹部分桃基因義以AU吼G作為娘翻譯喇起始酷密碼重子，歐但有頁(yè)些基栗因也繭使用GU雕G或UU場(chǎng)G作為惜翻譯掀起始濟(jì)密碼逆子。RB鄰S對(duì)外幟源基蹄因表稈達(dá)的夕影響氧：1、SD序列后的影于響：mR蹲NA與核異糖體偽結(jié)合泉越強(qiáng)蠶，翻象譯起西始效談率越隨高，簽結(jié)合會(huì)程度階取決吳于SD序列(5’-UA銅AGG科AGG-3制’)與1制6S紹rR談NA的堿掠基互礙補(bǔ)性住。以GG慌AG尤為朝重要水，4個(gè)堿啊基中連任何1個(gè)換喇成C或T，均會(huì)鹿導(dǎo)致擠翻譯宅效率捐大幅紗度下遠(yuǎn)降。2、翻緩譯起獎(jiǎng)始密寬碼子劃的影拿響：E.慕co薯li起始tR惰NA可同是時(shí)識(shí)弱別AU濃G、G敗UG和UU城G三種即起始督密碼愁子，偽但識(shí)光別頻掏率不艷同：GU話G為AU功G的5懷0%課、UU齒G為AU咬G的2剃5%歐。3、SD序列遣與起他始密尊碼子磚之間臭距離醋的影園響：SD序列哲與起津始密榮碼子瘡之間豪的精宰確距姨離保里證mR數(shù)NA在核稍糖體鼓上定廣位后亂，AU膊G正好瘋處于P位，霸這是熱翻譯駛啟動(dòng)洪的前舒提。通常SD序列禍位于AU朗G前約7b儀p處，在前此間性隔中汪少1個(gè)或慰多1個(gè)堿觀基，勵(lì)均導(dǎo)賣(mài)致翻旁譯起脹始效儲(chǔ)率不賤同程嶺度的撈降低蘇。4、SD序列識(shí)與起煮始密盟碼子潤(rùn)之間貌序列篇的影羊響：SD序列吼下游際堿基為AA嚇AA或UU帽UU時(shí)，智翻譯喚效率腥最高符；為CC露CC或GG冤GG時(shí)，界翻譯拳效率麗是最庫(kù)高值財(cái)?shù)?篇0%幅和2搶5%瀉。如：-半乳務(wù)糖苷減酶mR共NA，在甘此位旦置上稻的最惜佳堿廉基是UA波U或CU爺U(kuò)，如用UU帖C、簽UC壇A或AG鈔G取代村之，狹酶的字表達(dá)死水平獵下降辜20疫倍。緊鄰AU傘G的前3個(gè)堿糖基也會(huì)影響采翻譯劈燕起始澆效率雄。5、起郊始密取碼子館后續(xù)淋若干恒密碼斬子的藍(lán)影響州：從AU嘆G開(kāi)始列的前惜幾個(gè)憂密碼顫子的傲堿基月序列院也至沸關(guān)重牢要，亡這一聯(lián)序列議不能謊與mR咸N(yùn)A的5西’端旅非編物碼區(qū)潛形成液莖環(huán)閣結(jié)構(gòu)卵，否袖則會(huì)止嚴(yán)重晶干擾mR禾N(yùn)A在核明糖體減上的司準(zhǔn)確勸定位仆。目前見(jiàn)廣泛保使用掠的E.逐co五li表達(dá)拘型質(zhì)盼粒均鄰含有遵與啟牲動(dòng)子尺來(lái)源用相同智的RB賽S，序投列和正間隔差是最們佳的植。4、密墊碼子生物讀體對(duì)盞密碼主子的譜偏愛(ài)妻性：不同窯生物鵝、甚上至同旗種生羞物不艷同的糟蛋白杰質(zhì)編飾碼基仍因，筋對(duì)簡(jiǎn)蘿并密瘦碼子袖的使念用頻分率不士同，議具有沈一定憐的偏毯愛(ài)性樸。生物消體對(duì)豎密碼途子偏押愛(ài)性煤的決罩定因趟素：生物飛基因倒組中額的堿折基含籌量；密碼檔子與盤(pán)反密件碼子吃相互脹作用液的自表由能灣；細(xì)胞更內(nèi)tR團(tuán)NA的含豎量。1、生臣物基盾因組愿中的慰堿基朱含量黨：在富姓含AT的生凱物（歐如單陵鏈DN債A噬菌鈔體X1揭74迫）基因摘組中拉，密啦碼子附第3位上U和A出現(xiàn)帆頻率育較高超。在GC豐富新的生絲式物（割如鏈前霉菌仍）基鹿因組由中，竿第3位上評(píng)含G或C的簡(jiǎn)治并密繳碼子理占9余0%跪以上糟。2、密狐碼子潤(rùn)與反蟲(chóng)密碼域子相議互作覽用的污自由傻能：適中排的作目用強(qiáng)凡度有利狡于蛋娃白質(zhì)督生物至合成傅的迅固速進(jìn)繩行。弱配扮對(duì)作錢(qián)用可拘能使是氨酰春基tR趟NA進(jìn)入毯核糖煩體A位需復(fù)要花簡(jiǎn)費(fèi)更擇多的靠時(shí)間扎。強(qiáng)配聰對(duì)作量用則陷可能艦使轉(zhuǎn)尼肽后誕核糖柔體在P位逐炊出空英載tR大NA分子輕耗費(fèi)啊更多忌的時(shí)姥間。如：GG霉G、鄰CC削C、輝GC逢G、杰GG獎(jiǎng)C、擱AA項(xiàng)A、許UU淘U、桑AU度A、澆UA氧U等使故用少壩。GU傘G、萬(wàn)CA袖C、釘U(kuò)C鋤G、皺AG制C、截AC潔A、祥UG健U、盛AU譯C、舊UU暈G等使殺用多幼；3、細(xì)籠胞內(nèi)tR王NA的含恰量簡(jiǎn)并穴密碼緒子使系用頻私率與驢相應(yīng)tR企NA的豐度呈正突相關(guān)犯。表達(dá)亦量高業(yè)的基閘因含店有較哈少種蹲類(lèi)的顏密碼畏子，前這些圾密碼即子又霉對(duì)應(yīng)稀于高畏豐度勸的tR爭(zhēng)NA分子己，以嘴便細(xì)腐胞能孟以更墓快的占速度雙合成撕需求到量大爸的蛋檔白質(zhì)赤。密碼證子偏保愛(ài)性柄對(duì)外漆源基睜因表準(zhǔn)達(dá)的威影響抵：原核摧生物觸和真級(jí)核生壯物基素因組幻玉中密壩碼子勻的使恥用頻榜率有舟較大許差異速，因給此哺肯乳動(dòng)嚼物基你因在E.歐co液li中高埋效翻執(zhí)譯的袍一個(gè)資重要罩因素貨是密匆碼子拿的正繪確選狂擇。使外筍源基延因上開(kāi)的密育碼子艷在E.若co猾li中獲譯得最程佳表膝達(dá)的策略：外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因1、外塘源基額因全靈合成按E.倆co震li密碼越子的偏愛(ài)筑性規(guī)律雄，更比換外柿源基列因中姑不適江宜的錦簡(jiǎn)并別密碼管子。如：重組以人胰俱島素臂、干憂擾素辟、生鼓長(zhǎng)激棋素在E.孔co該li中的顆高效禽表達(dá)濫均采光用了僅這種誓方法握。可將學(xué)這兩算個(gè)tR譯NA編碼燦基因澡克隆凳在另逗一高因效表斃達(dá)質(zhì)蚊粒上即，構(gòu)鈴建雙質(zhì)凍粒表僑達(dá)系尋統(tǒng)。2、同絕步表焰達(dá)相穗關(guān)tR醉NA編碼壟基因如：人尿激酶原基因的412個(gè)密碼子中，有22個(gè)Arg密碼子，其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA，而E.coli中tRNAAGG和tRNAAGA豐度較低。5、質(zhì)郊?？绞棕悢?shù)質(zhì)粒排拷貝劉數(shù)對(duì)效細(xì)菌紛生長(zhǎng)雄代謝潑的影唐響：表達(dá)慨型質(zhì)域粒在非每個(gè)E.形co枝li細(xì)胞狐中達(dá)蹤蝶數(shù)百急甚至工上千閑個(gè)拷記貝，靠質(zhì)粒問(wèn)的擴(kuò)麥增過(guò)葉程常齊發(fā)生尺在受型體細(xì)款胞對(duì)數(shù)獎(jiǎng)生長(zhǎng)開(kāi)期，而沈此時(shí)喝正是報(bào)細(xì)菌左生理堤代謝撈最旺亞盛的臟階段政。質(zhì)粒榴的過(guò)威度增印殖、糾目的尤基因減的高獅效表具達(dá)會(huì)梁影響全受體伴細(xì)胞靈的生劇長(zhǎng)代杏謝，涂進(jìn)而屑導(dǎo)致黑重組瞧質(zhì)粒反的不悶穩(wěn)定刪性、映目的分基因驗(yàn)表達(dá)災(zāi)水平錦下降圓。措施準(zhǔn)：將重繪組質(zhì)路粒的策擴(kuò)增們納入可控壇制的軌像道。質(zhì)粒誦擴(kuò)增講時(shí)序諷的控歸制：pC俗P3擁有估溫度剖可誘雅導(dǎo)的驗(yàn)復(fù)制拆子。pCP3PLMCSoriAmpr28影℃時(shí)籍，每獵個(gè)細(xì)緩胞的積質(zhì)粒睡拷貝叼數(shù)為芹60隔；42削℃時(shí)，斗拷貝此數(shù)迅首速增雅至3次00-6紡00，受耀體細(xì)噸胞表嚇達(dá)的錫溫度回敏感稱(chēng)型阻遏愧蛋白CI群85四7失活，外浸源基射因表素達(dá)。用溫黑度可壇同時(shí)晴控制堡質(zhì)粒肅拷貝贈(zèng)數(shù)和示外源鈔基因抵表達(dá)份。（三散）大張腸桿交菌基泰因工岔程菌岡的構(gòu)巾建策到略包涵宜體型度表達(dá)分泌肌型表響達(dá)融合例型表罰達(dá)寡聚槳型表森達(dá)整合愧型表吳達(dá)蛋白教酶抗石性或搬缺陷坦型表德達(dá)系賴(lài)統(tǒng)的保構(gòu)建1、包長(zhǎng)涵體學(xué)型表豬達(dá)E.玩co搭li表達(dá)襯的蛋嚴(yán)白質(zhì)戶(hù)在細(xì)愿胞內(nèi)惑凝集環(huán)，形隱成無(wú)來(lái)活性送、不溶帆于水的固雨體顆燙粒，稱(chēng)為包涵來(lái)體(I等nc錯(cuò)lu毯si羽on深B憂od殿ie上s,IB)。包涵術(shù)體的萬(wàn)性質(zhì)蓮：大部鉛分存艱在細(xì)圍胞質(zhì)隊(duì)中，士基本恰上由早蛋白耀質(zhì)組量成。少量DN當(dāng)A、柏RN晝A、脂建多糖值等非感蛋白即分子聰。E.必co茄li本身符表達(dá)稈的蛋蘿白(如RN私A聚合忠酶、疏外膜未蛋白)、載拘體蛋宮白(如標(biāo)鍛記基究因表記達(dá)產(chǎn)艱物)。50球%以上咱是外源急基因協(xié)表達(dá)任產(chǎn)物，氨推基酸換序列欠正確散，但字空間躺構(gòu)象呼往往北錯(cuò)誤予，無(wú)殺生物就活性友。包涵迫體表?yè)爝_(dá)形呀式的吩?xún)?yōu)點(diǎn)匙：1、簡(jiǎn)滾化表隆達(dá)產(chǎn)困物的集分離禮操作包涵意體不院溶于磚水、模密度肝遠(yuǎn)大訪于細(xì)醫(yī)胞碎覆片和鋪其它處細(xì)胞玻成分孩，菌舒體經(jīng)階超聲仙波裂轟解后凳，通掠過(guò)高策速離來(lái)心，扔即可民分離終出來(lái)逝。2、保掠持表征達(dá)產(chǎn)謠物的追結(jié)構(gòu)捎穩(wěn)定形成馳包涵瓣體后帳，E.供co免li的蛋盯白酶結(jié)降解雕作用嶼對(duì)外品源蛋霞白的歐穩(wěn)定豆性構(gòu)尤不成爺威脅廳。包涵哨體表猜達(dá)形智式的中缺點(diǎn)瓶：表達(dá)徹的目橋的蛋馳白無(wú)節(jié)生物枕學(xué)活伸性，舉必須醒通過(guò)最有效梁的變性、復(fù)性，才寫(xiě)能獲斤得正純確空值間構(gòu)專(zhuān)象。變/復(fù)性惕效率犬對(duì)目柴標(biāo)產(chǎn)強(qiáng)物的躬收率謎至關(guān)償重要元，也是一技術(shù)辦難題俱。尤譯其目固的蛋龍白分棉子中Cy晶s殘基營(yíng)較多雄時(shí)，睡復(fù)性鐵成功竊率相針當(dāng)?shù)图?，一踏般不宴超過(guò)偽30梯%。外源益基因銅在E.稠co謎li中的域表達(dá)嶄量占滅細(xì)胞稠總蛋京白20擊%以上此時(shí)，舟表達(dá)屑產(chǎn)物愛(ài)傾向萬(wàn)形成右包涵接體。以包杜涵體暗形式螞表達(dá)送目的辱基因化，關(guān)轉(zhuǎn)鍵是聲選擇舌高效慨表達(dá)攏載體捎，高表去達(dá)率也是類(lèi)包涵誤體法犯的優(yōu)泊勢(shì)所罰在。包涵勇體的跑變性戲與復(fù)夢(mèng)性操晝作蛋白欲質(zhì)變美性復(fù)路性的壁動(dòng)力斃學(xué)原礦理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXA1A2AnA集聚的中間狀態(tài)A：集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì)U：變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)I：有效變/復(fù)性過(guò)程的中間狀態(tài)N：天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)C：共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)X：脫離有效變/復(fù)性過(guò)程而進(jìn)入共價(jià)弄修飾和集聚折狀態(tài)的蛋拿白質(zhì)弓不能綢進(jìn)入選復(fù)性奔過(guò)程滔，成持為無(wú)效活性察的蛋簽白質(zhì)刊。包榨涵體庸中的寺蛋白番質(zhì)即姿屬于紛這兩兆種狀芹態(tài)，挑需在賠體外霸進(jìn)行鎮(zhèn)變性鏡（解朝除共小價(jià)修比飾和照驅(qū)散腳集聚縱體）巡壽、復(fù)奪性操償作。C1C2CnCUI1InNX1X2XnXA1A2AnA包涵殿體的飛變性扔溶解信：用強(qiáng)亡變性友劑如鞠尿素肉、鹽藏酸胍叔，通拒過(guò)離墾子間鵲相互斑作用另，打壇斷包涵唐體蛋白腫質(zhì)分恭子內(nèi)需和分誰(shuí)子間擺的各槽種化樓學(xué)鍵步，使賓多肽條伸展繡。便宜駱，但鴉溶解精能力湖弱、攝且尿素虧分解丑的異氰胳酸鹽棚能導(dǎo)粉致多隱肽鏈哪的氨窄基甲矛?；s。溶解題能力鉗強(qiáng)，敘但價(jià)榨格昂墓貴。常用盯的變膚性劑咱：7M鹽酸闖胍：8M尿素映：包涵測(cè)體的叮復(fù)性：緩慢郵去除頁(yè)變性死劑，螞使目匠的蛋斗白從蹈變性有的完磨全伸賭展?fàn)钊缿B(tài)恢臘復(fù)到恰正常索的折想疊結(jié)鉛構(gòu)，糧同時(shí)池去除顛還原比劑，碗使二烏硫鍵膽正常伏形成則。尿素碼：濃度鄙降至4M時(shí)，擱復(fù)性嚼過(guò)程粗開(kāi)始朱；降至2M時(shí)復(fù)忘性結(jié)戶(hù)束。鹽酸壘胍：濃度醬降至4M時(shí)，估復(fù)性誦過(guò)程予開(kāi)始低；降至1.責(zé)5M時(shí)復(fù)必性結(jié)網(wǎng)束。二硫巖鍵形煮成：在包享涵體楊變性治體系柏中，劇始終奴存在還原戰(zhàn)劑(如DT撇T、-ME蘿)，使蓄多肽垮鏈中團(tuán)的巰倚基保晌持還貝原狀片態(tài)，悔防止鼓二硫艙鍵錯(cuò)計(jì)配導(dǎo)子致嚴(yán)邪重的毀集聚望。變性盒結(jié)束捉后，翠游離較的巰逆基必甚須重灑新配乖對(duì)形與成二櫻硫鍵鉛，多酸肽鏈袖重新悼折疊立。形成的二硫劃鍵的乖主要己方式菊：1）化輸學(xué)氧恐化法溫：HSHSSS+2e+2H+需電則子受跡體，污最廉連價(jià)的布電子誘受體鑄為空厲氣，狗二硫櫻鍵形爭(zhēng)成是感隨機(jī)暮的，借重折眨疊效夜果差聾。2）二加硫鍵答交換呀：需氧醉化型逆和還彼原型傳谷胱趙甘肽(G窄SS烏G和GS柔H)，二粉硫鍵年形成煙相對(duì)鉤特異選，重黃折疊壁效果捏好。HSHS+G-S-S-GSS2G-SH+包涵玩體復(fù)具性的晨方法糞：稀釋例復(fù)性透析脫復(fù)性超濾爽復(fù)性柱上扇復(fù)性缺點(diǎn)伯：體積黎增加吹較大膊，變法性劑送稀釋所速度叉快、不易陳控制跳。直接健加入傭緩沖格液或富復(fù)性躬液，碌放置喘過(guò)夜附。一次稀釋梯度稀釋連續(xù)稀釋稀釋脹復(fù)性爬：透析糞復(fù)性版：優(yōu)點(diǎn)懂：不增狀加體累積，停通過(guò)觀逐漸范降低翁透析快液濃沒(méi)度、召控制做變性泉?jiǎng)┤ゾ艹偌榷?。缺點(diǎn)使：易形柳成無(wú)政活性饅蛋白泰質(zhì)聚袋體，產(chǎn)不適筑合規(guī)寫(xiě)?；忌a(chǎn)差。超濾溜復(fù)性剝：缺點(diǎn)抓：樣品搖量少狀時(shí)不讓適用榜，有籍些蛋佳白質(zhì)徹在超升濾過(guò)紅程中客會(huì)發(fā)目生不攝可逆摧變性句。優(yōu)點(diǎn)攪：透析錄速度務(wù)易控恰制，櫻適合柄規(guī)模犁化生捕產(chǎn)。柱上匹復(fù)性稈：包涵獵體變般性后粱，在芝色譜垂柱上寨復(fù)性叢。優(yōu)點(diǎn)規(guī)：復(fù)性耳回收桌率高，凳達(dá)90憑%以上約；快撐速；工藝統(tǒng)易放樣大；距樣品夕稀釋暈倍數(shù)屆小。疏水柱復(fù)性凝膠柱復(fù)性2、分求泌型末表達(dá)以可純?nèi)苄灾一虿话袢苄詫?zhuān)包涵槐體狀灑態(tài)存陰在于細(xì)胞鏟質(zhì)。通過(guò)熄運(yùn)輸幼或分爽泌，贊定位繭于細(xì)胞歐周質(zhì)（內(nèi)喘外膜濤間的睬空隙雕），核甚至創(chuàng)穿過(guò)征外膜趙進(jìn)入豈培養(yǎng)盜基中劣。在E.頭co哄li中表鵲達(dá)的宿外源規(guī)蛋白紀(jì)，按條其在執(zhí)細(xì)胞的中的員定位呆，分獅為兩重種形精式：蛋白書(shū)質(zhì)的撓分泌湖機(jī)制囑：E.勸co渴li周質(zhì)際中含辱有多富種分子近伴侶，可勺阻止框分泌壘蛋白湯隨機(jī)塊折疊，分泌其在周姥質(zhì)或些培養(yǎng)己基中捕的重赤組蛋隱白很歐少形牢成分熄子間燙二硫榆鍵。胞內(nèi)胞外信號(hào)肽剪切酶內(nèi)膜外膜胞壁信號(hào)肽目標(biāo)蛋白周質(zhì)與包亡涵體消相比棟，分村泌型竊重組倚蛋白山有較拒高比渡例的累正確被構(gòu)象躍，生蔽物活淡性的奶回收承率高東，且部對(duì)蛋蛇白酶跡不敏訊感。蛋白阿產(chǎn)物N端信號(hào)爹肽序列巷的存照在是披蛋白飄質(zhì)分威泌的債前提瞇。分泌冶表達(dá)后形式孕的優(yōu)塌點(diǎn)：2）目尾的蛋涉白易生于分亮離1）目的蛋白穩(wěn)定性高重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，其穩(wěn)定性是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍。多數(shù)歐真核造生物徐成熟淋蛋白N端不磚含甲越硫氨學(xué)酸殘兼基，蜜當(dāng)其糕基因呀在E.蓮co聰li中表哲達(dá)時(shí)進(jìn)，N端的伐甲硫壯氨酸熱殘基膠往往歉不能菜被切恥除。3）目獎(jiǎng)的蛋浮白末賀端完沙整：將外距源基上因與E.屠co帶li信號(hào)吉肽序炊列重僑組，即一旦楊分泌砍型表等達(dá)，N端的甲硫環(huán)氨酸殘基挽便可秋在信鄭號(hào)肽斯剪切腐過(guò)程約中被多去除坐。分泌偽表達(dá)聾形式箭的缺蜻點(diǎn)：1）E.牽co反li的蛋擾白分廁泌機(jī)數(shù)制不悲健全冬，真妥核基觀因很俱難在E.厲co機(jī)li中分渡泌型斥表達(dá)橡。2）少龜數(shù)外龍?jiān)椿兑蚣疵κ鼓芨穹置谥帘磉_(dá)攻，表述達(dá)率柱也比皆包涵獻(xiàn)體方灰式低冒得多碧。分泌斑型表貍達(dá)系墊統(tǒng)的鑰構(gòu)建這一邪過(guò)程艇嚴(yán)格譯依賴(lài)民于細(xì)菌柄素釋睬放蛋恭白，它杠激活膝定位可于內(nèi)席膜上麗的磷院酸酯唇酶，旱導(dǎo)致饞細(xì)菌裁內(nèi)外嗓膜的貢通透殃性增俯大。絕大穴多數(shù)E.挽co悄li不能鞠將蛋蹄白質(zhì)門(mén)直接筒分泌憤到胞液外，舉但有艇些能煤將抗輕菌蛋皂白(細(xì)菌叛素)分泌圈到培陡養(yǎng)基票中。將細(xì)菌艦素釋朗放蛋吳白編碼織基因碰克隆綁在一爛質(zhì)粒冶上，踩與另萄一攜潤(rùn)帶E.霸co碰li信號(hào)丙肽編碼序列埋和目避的基祥因的細(xì)表達(dá)矮質(zhì)粒素共轉(zhuǎn)爛化E.似co缺li細(xì)胞風(fēng)，可摸實(shí)現(xiàn)餅?zāi)康募钡鞍琢?xí)的分展泌。3、融菌合型持表達(dá)除直粘接表上達(dá)外對(duì)，還查可將樓目的誘基因奇與受舟體菌扁自身竊的蛋緞白質(zhì)滑編碼肺基因巡壽拼接辭在一蹤蝶起，佩作為瓜一個(gè)棵開(kāi)放乒型閱鳴讀框辯架進(jìn)辮行表輕達(dá)，吹由這社種雜矛合基巡壽因表宅達(dá)的有蛋白扇質(zhì)稱(chēng)暖為融合逆蛋白。在融焰合蛋集白結(jié)維構(gòu)中擁，通碌常受刺體菌嚼的蛋及白位披于N端，栗外源壞蛋白話位于C端。通過(guò)晶在DN襯A水平新，引醒入蛋白堪酶切哭割位紛點(diǎn)或化學(xué)險(xiǎn)試劑款特異博性斷古裂位盤(pán)點(diǎn)，可同在體捏外從榜純化練的融緒合蛋鄙白分圖子中邊回收捕外源跌蛋白創(chuàng)。融合犧型表欄達(dá)的役優(yōu)點(diǎn)國(guó)：1）目襪的蛋秧白穩(wěn)收定性宗高：對(duì)分響子量野較小秧的多綿肽效幫果更券佳。2）目的蛋白易于分離：利用受體蛋白成熟的抗體、配體等，進(jìn)行親和層析，可快速獲得高純度的融合蛋白。3）目偽的蛋彼白表氏達(dá)率警高：與受裂體蛋略白共潔用一華套完慌善的方表達(dá)礙元件層。4）目的蛋白溶解性好：由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性。目的伐蛋白儉需要添回收娘：融合詠蛋白修需裂敵解和棋進(jìn)一版步分珠離，虜才能太獲得察目的蹄蛋白叮。融合仍型表燙達(dá)的快缺點(diǎn)裂：融合嗽型表湖達(dá)系女統(tǒng)的閱構(gòu)建構(gòu)建氣原則互：1）受文體基沙因能鄰高效肚表達(dá)眠，表拋達(dá)產(chǎn)避物可見(jiàn)通過(guò)吹親和買(mǎi)層析蓮純化禁。2）外終源基蔽因應(yīng)賴(lài)裝在收受體貿(mào)基因國(guó)下游青，為屠融合歸蛋白背提供橡終止?fàn)幟艽a絞子。3）兩型基因廟拼接員位點(diǎn)翁處的需序列聾設(shè)計(jì)召十分騾重要杯，直播接決從定融記合蛋總白的言裂解浙工藝伐。4）兩務(wù)基因板應(yīng)保危持一女致的基翻譯立閱讀柳框架健。用于層融合盞蛋白都構(gòu)建界的受撓體蛋餓白：谷胱摘甘肽逐轉(zhuǎn)移拌酶(GS曲T)：維鑰持良愈好空續(xù)間構(gòu)呀象硫氧坡化還吧原蛋難白(Tr蛛xA)：維影持良僵好空糠間構(gòu)假象泛素惜蛋白(Ub展i)：維扣持良漁好空吸間構(gòu)抓象麥芽杯糖結(jié)止合蛋胸白(MB層P)：促猜進(jìn)分曠泌外膜妹蛋白(Om鐘pF)：促最進(jìn)分伯泌金黃療色葡惜萄球誕菌蛋縣白A(SP釣A)：免德疫親牌和層梯析-半乳役糖苷洪酶(La食cZ)：免括疫親勸和層擦析目的矮蛋白叛的回窩收：生產(chǎn)命藥用讀目的天蛋白緩時(shí)，織將受鑄體蛋魂白部癥分完紗整除酷去是輸必不哪可少自的工產(chǎn)序。融合瞧蛋白配中的洗受體瓦蛋白毀會(huì)影派響目編的蛋秧白的細(xì)空間養(yǎng)構(gòu)象床和生其物活腔性，啟用于宜人體招還會(huì)紀(jì)導(dǎo)致僚免疫龍反應(yīng)閱。融合屢蛋白積的位康點(diǎn)專(zhuān)睛一性奸斷裂京方法走：化學(xué)斷裂法酶促裂解法蛋白泥位點(diǎn)尿?qū)Ｒ晃沸曰簩W(xué)斷朽裂的墊最佳跳試劑只為溴化有氰(CN缺Br)，與刊多肽崇鏈中甲硫澆氨酸殘基側(cè)鏈旺的硫挑醚基挎反應(yīng)廚，生碼成溴拼化亞懇氨內(nèi)蟻酯，尋后者然在水辣的作但用下慶肽鍵具斷裂眾，形趟成兩曉個(gè)肽伏段，脖上游罰肽段中的甲喊硫氨帥酸殘倉(cāng)基轉(zhuǎn)乒化為雷高絲攏氨酸愉殘基杜，下鵲游肽袋段N端的追第一僚個(gè)氨夏基酸滾殘基宏保持版不變瞇?；瘜W(xué)刊斷裂矮法特點(diǎn)當(dāng)：前提伐：回收刃率高幼（達(dá)揉85揀%以萍上）啄；專(zhuān)巾一性格強(qiáng)；欺產(chǎn)生損的目捷的蛋疑白N端不須含甲吃硫氨拋酸，季與真寨核生捐物中森的成炭熟表潔達(dá)產(chǎn)糧物接貴近。目的康蛋白胸分子撇內(nèi)部濁不能添含甲基硫氨版酸殘?zhí)突Ｃ复兖^裂解錯(cuò)法-單殘卷基位桐點(diǎn)蛋白坦內(nèi)切踐酶切割駐位點(diǎn)梭菌封蛋白部酶Ar派g葡萄盞球菌劈燕蛋白遷酶Gl改u假單緊孢菌突蛋白叢酶Ly權(quán)s豬胰辮蛋白廳酶Ar翼gLy搬s特點(diǎn)筐：NCAr竄gCN受體什蛋白目的擊蛋白1）斷冷裂效夕率高逐。2）每疤種蛋產(chǎn)白酶刃都有米相應(yīng)襯的斷裂噸位點(diǎn)。幾既種斷遞裂位霜點(diǎn)專(zhuān)供一性駁最強(qiáng)頂?shù)纳搪悠坊P蛋白鴿酶分烏別在雨多肽增鏈中Ar然g、Gl威u或Ly跟s殘基C末端拒切開(kāi)倦酰胺蟻鍵，誕形成谷不含透上述滴殘基梨的下差游肽船段。前提道：外源癥蛋白想內(nèi)部刊不能言含Ar定g、Gl末u或Ly揭s殘基研。大分子外源蛋白內(nèi)部，這3種氨基酸殘基出現(xiàn)的頻率相當(dāng)高。---應(yīng)用局限。問(wèn)題：酶促尊裂解梨法--多殘嫌基位鳳點(diǎn)在受佛體蛋應(yīng)白編絕碼序呈列與六外源黎基因凝之間株加裝批一段劉寡肽變編碼監(jiān)序列許（Il豬e異亮隔氨酸-Gl服u-冤Gl茅y甘氨旗酸-Ar述g），該是寡肽劑為具虛蛋白貨酶活垂性的凝血襪因子X(jué)a的識(shí)利別和尸作用笛序列昂，其編斷裂旱位點(diǎn)遠(yuǎn)在Ar勺g的C末端。純化堵后的轎融合甲蛋白妄用Xa處理卻，即而可獲量得不燭含上古述寡評(píng)肽序氣列的湊目的袋蛋白泊。凝血萄因子X(jué)a的識(shí)臉別序殼列由4個(gè)氨渠基酸搬殘基繳（Il許e-著Gl配u-筋Gl魂y-儀Ar補(bǔ)g）組成膜，大延多數(shù)品蛋白李質(zhì)中置出現(xiàn)歡這種框寡肽壓序列懶的概亮率極謹(jǐn)?shù)汀?-忘-應(yīng)用廣泛。酶促代裂解曉法：P受體基因接頭目的基因ArgLysGluIle-Glu-Gly-Arg表達(dá)親和層析ArgLysGluIle-Glu-gly-Arg酶解回收4、寡誼聚型堂表達(dá)通過(guò)談增加圍質(zhì)粒蓬拷貝帝數(shù)，磚以提捏高外莖源蛋掛白產(chǎn)叛量往黎往不揮能取殊得滿概意效猛果。隨質(zhì)幻玉?？剿关悢?shù)鳥(niǎo)不斷澤增加曠，受團(tuán)體細(xì)剪胞內(nèi)著的大蓮部分宿能量軋和原民料被幟用于窗合成奪質(zhì)粒謎編碼賊蛋白潮，使觀細(xì)胞忍正常攻生長(zhǎng)圓代謝咱受到紹影響維。重組練質(zhì)粒致除含床外源車(chē)基因恒外，粘還攜右?guī)浣扑上D(zhuǎn)錄狀基因榜（如潤(rùn)抗生除素抗籌性基蛾因）民。構(gòu)建賺寡聚仍串聯(lián)守型異什源蛋詞白表奮達(dá)載暗體，決將多拷諷貝外貫源基省因克隆頁(yè)在一然個(gè)低拷祝貝質(zhì)淋粒上，甚以取漢代單串拷貝綢外源便基因減在高鐵拷貝做載體猶上表磁達(dá)，辮可增磁加外俯源基餅因劑數(shù)量，斷提高貴目標(biāo)博蛋白紗產(chǎn)量大。寡聚稱(chēng)型表育達(dá)的航優(yōu)點(diǎn):1）目附的蛋斤白高信效表酬達(dá)：在不快提高予質(zhì)粒擋拷貝倍數(shù)的橫前提緊下，村增加況目的項(xiàng)基因喚的拷壯貝數(shù)穩(wěn)，可電在一拌定程災(zāi)度上忙提高宋表達(dá)凝量。2）穩(wěn)供定表爐達(dá)小支分子毛短肽場(chǎng)：短肽暴由于栽缺乏素有效挽的空笛間結(jié)晨構(gòu)，摟在細(xì)鴉菌細(xì)膊胞中控的半視衰期晌較短輕。串聯(lián)豎短肽綁具有統(tǒng)與蛋留白質(zhì)炸相似辜的長(zhǎng)榜度和絞空間燙結(jié)構(gòu)飯，抗樓蛋白妥酶降除解的訊能力鹽大幅牽度提墾高。寡聚倦型表里達(dá)的警缺點(diǎn):目的賺產(chǎn)物渣回收芒困難耽：寡聚撞短肽識(shí)需裂敗解和梯進(jìn)一坡步分愈離，任才能載獲得向最終樂(lè)分子混，裂買(mǎi)解后舅的短逮肽分畜子易身出現(xiàn)障序列賣(mài)不均逼一性幼。寡聚奇型表距達(dá)系水統(tǒng)的傭構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1T2基本茄戰(zhàn)略負(fù)：溴化氰(CNBr)mRNA轉(zhuǎn)錄H2NCOOHMetMetMetMet翻譯5、整斷合型怖表達(dá)將外指源基掙因直沃接整逢合在承受體運(yùn)細(xì)胞計(jì)染色敘體DN顛A的特增定位集置上退，使駝之成唉為染南色體DN鏈A的組喘成部陪分，刊增加眨其穩(wěn)技定性稼。整合醬型表命達(dá)的花優(yōu)點(diǎn)答：目的悼基因兔隨受勇體細(xì)避胞染侍色體DN鴉A的復(fù)蛛制而即復(fù)制撓，非災(zāi)常穩(wěn)食定，鴨多用藝于改良降物種族的遺辯傳性綱狀。目的正基因裝穩(wěn)定止表達(dá)介：整合堆型表?xiàng)l達(dá)的甩缺點(diǎn)婆：目的弱基因先表達(dá)狀率低較：?jiǎn)慰綇R貝整仗合的怖目的倚基因串表達(dá)陽(yáng)率低吵，可帽通過(guò)伏強(qiáng)化沖表達(dá)獵元件候補(bǔ)償外。6、蛋匹白酶雄抗性娘或缺搬陷型罵表達(dá)吳系統(tǒng)燒的構(gòu)夜建無(wú)論遮是在樂(lè)真核講還是腥在原匪核細(xì)辟胞中豬，外伯源蛋嶄白表堆達(dá)后定都面色臨被肢降解炕的命畜運(yùn)，穩(wěn)定吃性甚至魚(yú)不如睬半衰考期較佳短的厘受體共細(xì)胞禾內(nèi)源密蛋白士。多數(shù)修情況篇下，劑外源今蛋白登不穩(wěn)連定性繩歸結(jié)努為對(duì)甩受體吼細(xì)胞蛋白核酶系統(tǒng)的敏栽感性遣。外源著蛋白皂的半廁衰期隸可通捐過(guò)外尋源蛋乒白序候列的希人工系設(shè)計(jì)切、受輔體細(xì)甚胞的炮改造森控制舌。在蛋樣白質(zhì)C端引孤入As雪p天門(mén)蘇冬氨侍酸殘基歡，則祝穩(wěn)定倦性顯墳著提殿高，輝且As互p殘基配離C端越即近，門(mén)蛋白扮質(zhì)的障穩(wěn)定蜻性越彈好。外源床蛋白胳序列悠的設(shè)臣計(jì)1）C端氨識(shí)基酸俯序列井對(duì)穩(wěn)乳定性保的影葬響：N端含Pr杏o、Gl視u、Se姜r、Th家r的蛋循白質(zhì)嬸半衰覺(jué)期通緒常很娃短，屋尤其Pr宗o-Gl插u-辮Se東r-容Th礎(chǔ)r序列(PE刃ST序列)，是感胞內(nèi)核蛋白盤(pán)酶的秤超敏鋤感區(qū)帝。2）N端氨色基酸煉序列壞對(duì)穩(wěn)砌定性荒的影面響：蛋白晨質(zhì)N端含卷高比工例的Al敗a丙氨靠酸、As督n天冬訴酰胺、Gl想n谷氨敬酰胺、Cy央s、Hi靠s，則傍穩(wěn)定海性顯惱著提勾高。受體爐細(xì)胞腔的改歷造1）lo駕n基因瓣缺陷員的E.右co劉li受體游（lo窮n-）：多數(shù)山外源托蛋白利是被E.層co云li中的巷蛋白袖酶La和Ti降解遷的，縱二者肅分別物由lo癢n和cl黃p基因獅編碼。采用lo手n-的突肆變株移，可盼提高曉蛋白渡穩(wěn)定奇性。熱休尼克基抽因dn餐aK、dn刮aJ、gr堡oE剪L、gr幕pE，以及真環(huán)境用壓力緊特異老性因子峰編碼政基因ht候pR的突據(jù)變株駛均呈雹現(xiàn)出危對(duì)異南源蛋月白降窗解作循用的請(qǐng)嚴(yán)重璃缺陷申。2）ht者pR基因?yàn)跞毕菝C的E.義co序li受體客（ht拘pR-）：E.翼co演li中的唱熱休賠克蛋伙白家曬族對(duì)蜘外源牌蛋白歷的降含解有舌重要懶作用脆，機(jī)赤理是房誠(chéng)脅迫京外源樹(shù)蛋白駛形成鄰對(duì)蛋竭白酶收識(shí)別賞和降貿(mào)解有門(mén)利的撞空間機(jī)構(gòu)象冰。lo列n-ht朋pR-雙缺捏陷細(xì)以胞株酸非常刷適合悶高效或表達(dá)消各種廢不穩(wěn)肌定的陶外源鄉(xiāng)豐蛋白悼。（四籍）基蓬因工縱程菌搖的遺彈傳不羨穩(wěn)定殺性及鞭對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略基因泛工程好菌遺廢傳不盒穩(wěn)定語(yǔ)性的儲(chǔ)表現(xiàn)亂與機(jī)乎制工程摔菌遺汪傳不認(rèn)穩(wěn)定叉性主唯要表儲(chǔ)現(xiàn)為重組竹質(zhì)粒器的不傲穩(wěn)定敵性。結(jié)構(gòu)胳不穩(wěn)洽定性防：重組DN每A分子洞上某足一區(qū)策域缺稅失、狠重排狀，導(dǎo)梳致其叔生物費(fèi)學(xué)功樂(lè)能喪僵失。分配秋不穩(wěn)蓋定性債：整個(gè)悟重組DN篇A分子溉從受磨體細(xì)掩胞中魚(yú)逃逸西。工程位菌遺漲傳不劃穩(wěn)定旋性的磁產(chǎn)生辰機(jī)制雕：受體譜細(xì)胞拿中的弟限制迎修飾捉系統(tǒng)清對(duì)外巡壽源DN叢A的降魂解。外源箭基因沾的高重效表慢達(dá)嚴(yán)睜重干附擾受鎖體細(xì)問(wèn)胞正擁常的毀生長(zhǎng)牢代謝右。重組上質(zhì)?；脑谑懿w細(xì)給胞分偵裂時(shí)藍(lán)的不調(diào)均勻娛分配趟。受體泳細(xì)胞蓋的內(nèi)硬源性飽轉(zhuǎn)座唯元件拳促進(jìn)瓣重組DN孤A的缺團(tuán)失、鼠重排侵。改善揮基因怕工程策菌不卵穩(wěn)定賞性的抬策略1、改宇進(jìn)載叛體-受體旦系統(tǒng)薯：1）將R1質(zhì)粒末的pa達(dá)rB基因撐引入銀質(zhì)粒案，其蓬表達(dá)索產(chǎn)物疼可選發(fā)擇性冶殺死管因分澡配不墾均勻事產(chǎn)生作的無(wú)渾質(zhì)粒臉細(xì)胞總。2）正拌確設(shè)愁置載沿體的MC著S，防吉止外帶源基誦因插挎入穩(wěn)察定區(qū)陰。3）將E.片co保li的ss秒b基因夏克隆俯在質(zhì)它粒上盒，受禽體菌ss貸b-，ss賽b編碼容的蛋惕白是DN摩A復(fù)制添和細(xì)尿胞生點(diǎn)存必諒需的娛，則國(guó)丟失拆質(zhì)粒許的細(xì)索胞無(wú)益法增屆殖。2、施虛加選爛擇壓鑰力1）根樸據(jù)載婚體上幻玉的抗藥馬性標(biāo)報(bào)記，向靜培養(yǎng)諒系統(tǒng)買(mǎi)中添司加相液應(yīng)的鞭抗生總素。2）根疫據(jù)載榜體上柔的營(yíng)養(yǎng)向缺陷趟型標(biāo)哪記，使揭培養(yǎng)輸系統(tǒng)站中缺箱失相悉應(yīng)的膚營(yíng)養(yǎng)刃組份大。3、控筒制目鏈的基頌因的憤過(guò)量因表達(dá)1）使訴用可控焰型啟肆動(dòng)子，控欺制目于的基婦因的辣定時(shí)院表達(dá)糞及表欣達(dá)程鏈度。2）使己用可控譜型復(fù)東制子，控汪制質(zhì)除粒的企定時(shí)輪增殖島或降酒低質(zhì)貪粒的魯拷貝半數(shù)。4、優(yōu)溉化基耗因工拆程菌歲的培曲養(yǎng)工舉藝1）培哭養(yǎng)基沉組成腳：限制糕培養(yǎng)遭基比彼豐富陣培養(yǎng)稼基更牲有利福于穩(wěn)潤(rùn)定。2）培維養(yǎng)溫越度：較低貢的培跌養(yǎng)溫恭度有伙利于暖重組舉質(zhì)粒播的穩(wěn)鮮定。（六扶）利社用重細(xì)組大牢腸桿服菌生際產(chǎn)人猜胰島曠素胰島孫素的飲結(jié)構(gòu)半及其趣生物虧合成人胰箏島素匹的生保產(chǎn)方階法重組爹人胰譯島素植的大付腸桿度菌工印程菌袍的構(gòu)彈建胰島拐素的穴結(jié)構(gòu)淹及其漸生物遮合成信號(hào)賀肽B肽C肽A肽NC前胰步島素述原信號(hào)肽酶B肽C肽A肽SSSSSSCN胰島素原特異性肽酶SSSSSSNNCCB肽A肽成熟胰島素19以69蝴C壞ro牲wf逆oo衛(wèi)t-飽Ho密dg舊ki澡n確定騎了胰瞧島素坑的空箭間結(jié)聾構(gòu)；19景79Ru點(diǎn)tt伴erW和Do嗽od朋ma還nH克隆閉了胰挨島素叔基因毅；加拿大科學(xué)家FrederickBanting和JohnJamesRichardMacleod發(fā)現(xiàn)胰島素NobelPrizeinPhysiologyandMedicine,19231923Banting和Macleod發(fā)現(xiàn)了胰島素；英國(guó)生物化學(xué)家FrederickSanger

測(cè)定了胰島素序列NobelPrizeinChemistry,19581955Sanger首次報(bào)道了胰島素的氨基酸序列；Li饞ll遷y公司槍獲美預(yù)國(guó)FD頁(yè)A許可蠻，將銳重組近人胰逮島素推向必市場(chǎng)20巴06輝瑞蜜公司減的胰尺島素吸入襖劑(Ex擁ub拾er局a)獲準(zhǔn)丸上市--讓-第一廊個(gè)非彈注射巷給藥籮的胰膨島素棍劑型人胰保島素要的生