淺論Jagged1蛋白在肌源性干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞過程中的表達(dá)差異

淺論Jagged1蛋白在肌源性干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞過程中的表達(dá)差異【摘要】目的Jagged1蛋白在大鼠肌源性干細(xì)胞(MDSCs)體外增殖分化為神經(jīng)樣細(xì)胞過程中的表達(dá)差異研究。方法大鼠乳鼠骨骼肌消化后體外培養(yǎng)增殖,第5代傳代后細(xì)胞分為2組：對(duì)照組完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)。6d后觀察2組細(xì)胞的形態(tài)變化,并進(jìn)行NSE免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。然后通過免疫熒光觀察Jagged1蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果誘導(dǎo)組細(xì)胞NSE染色陽性，免疫熒光結(jié)果顯示對(duì)照組Jagged1蛋白表達(dá)陽性，實(shí)驗(yàn)組基本不表達(dá)。結(jié)論大鼠肌源性干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞過程中Jagged1蛋白表達(dá)存在明顯差異。

【關(guān)鍵詞】肌源性干細(xì)胞;神經(jīng)樣細(xì)胞;Jagged1蛋白

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheroleofJagged1proteinduringtheproliferationanddifferentiationofmusclederivedstemcells(MDSCs)intoneuron-likecellsinTheskeletalmusclestemcellsderivedfromtheneonateratwereculturedandpurifiedclonallyinvitro.The5thpassagecellsweredividedintothecontrolgroupandtheexperimentalgroup.Morphologicalchangeandimmunocytochemicalidentificationwereobservedsixdaysafterexperimentintervention.ImmunofluorescencewasemployedtoexaminetheexpressiondifferenceofJagged1protein.ResultsNSEpositivecellsweredetectedintheexperimentalgroup.ImmunofluorescenceshowedthatthelevelsofJagged1proteinintheexperimentalgroupweremuchlowerthanthatofthecontrolgroup.ConclusionsThelevelsofJagged1proteinweredecreasedwhentheMDSCsdifferentiateintoneuron-likecellsinvitro.

Keywords:musclederivedstemcells;neuron-likecells;Jagged1protein

肌源性干細(xì)胞(musclederivedstemcells,MDSCs)具有良好的自我更新和增殖能力的干細(xì)胞，具多向分化潛能。它能夠分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,修復(fù)受損傷的神經(jīng),并可使受損的神經(jīng)功能得到恢復(fù)[1]。近來一些研究表明Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能對(duì)肌源性干細(xì)胞干細(xì)胞增殖分化起非常重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)選取Notch通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)Jagged1蛋白的表達(dá)水平作為研究對(duì)象，為進(jìn)一步研究肌源性干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

SD大鼠乳鼠(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);Ⅱ型膠原酶(Sigma)，分散酶，胰蛋白酶(Sigma)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(四季青)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，兔抗鼠Desmin、NSE、Jagged1蛋白抗體(武漢博士德)。

肌源性干細(xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定

SD大鼠乳鼠無菌條件下取骨骼肌，采用混合酶(100mL含有Ⅱ型膠原酶g，Ⅱ型分散酶g，CaCl2g)消化1h，篩網(wǎng)過濾，離心后含有15%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM重懸細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng);記為PP1，分別間隔2、16、24和24h差速貼壁純化細(xì)胞,記為PP2、PP3、PP4、PP5。PP5長滿培養(yǎng)瓶底后，%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。對(duì)傳代細(xì)胞行Desmin免疫細(xì)胞熒光鑒定。

各組細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)前后表面抗體表達(dá)

傳代后細(xì)胞培養(yǎng)離心重懸后，分為2組進(jìn)行培養(yǎng)：1組：對(duì)照組，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);2組：誘導(dǎo)組，以分化培養(yǎng)基(10%FBS,20μg/LNGF,1%青鏈霉素，DMEM)進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)。相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)6d后行NSE免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定和Jagged1蛋白免疫熒光表達(dá)檢測。

免疫細(xì)胞化學(xué)檢測

取生長有細(xì)胞的蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15min，3%BSA封閉30min，加入一抗，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，4℃過夜。避光進(jìn)行以下操作：加入二抗，37℃孵育30min，30μL/mL33258染色8min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

免疫細(xì)胞熒光檢測

將消毒完的蓋玻片放到培養(yǎng)皿中，加入細(xì)胞懸液，5%CO2孵箱培養(yǎng)2～3d，4%多聚甲醛固定30min;%Triton-100作用5min，PBS洗2次，3%H2O2作用20～30min;加封閉液20min，甩去多余液體，不洗，一抗4℃過夜;二抗1：100作用2h;SABC30min;DAB試劑盒作用30min;蘇木素染色min;梯度酒精脫水(75%-85%-95%-100%)，每次4min。二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min。緩沖甘油封片，無熒光指甲油封4周。

2結(jié)果

傳代后細(xì)胞形態(tài)

傳代培養(yǎng)的MDSCs呈不規(guī)則形;隨培養(yǎng)時(shí)間延長及傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列，極易融合，生長呈方向性(圖1)。

MDSCs傳代后Desmin免疫熒光鑒定

采用Desmin一抗對(duì)MDSCs進(jìn)行鑒定,細(xì)胞質(zhì)Desmin染色為陽性細(xì)胞。觀察500個(gè)細(xì)胞,陽性率達(dá)到90%(圖2)。

誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)觀察

經(jīng)誘導(dǎo)6d后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，出現(xiàn)長突起，類似神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞突起之間似發(fā)生聯(lián)系，變化呈漸進(jìn)性，分化率較高，此時(shí)細(xì)胞無明顯增殖現(xiàn)象，未見神經(jīng)球形成(圖3)。

誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞NSE(神經(jīng)元特異性烯醇化酶)表達(dá)

誘導(dǎo)6d后神經(jīng)樣細(xì)胞的胞體和突起NSE染色呈強(qiáng)陽性，而未分化的細(xì)胞為陰性(圖4)。

誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞Jagged1蛋白表達(dá)

誘導(dǎo)6d后神經(jīng)樣細(xì)胞的胞體和突起Jagged1蛋白表達(dá)陽性，而未分化的細(xì)胞基本不表達(dá)(圖5、6)。

3討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，由于內(nèi)在的再生能力差和外在的微環(huán)境的抑制，損傷軸突不能再生。然而近年的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后采用組織工程方法，將有活性的種子細(xì)胞移植治療脊髓損傷，能促進(jìn)損傷軸突修復(fù)、再生和恢復(fù)脊髓部分神經(jīng)功能。

MDSCs是不同于衛(wèi)星細(xì)胞的一類成體干細(xì)胞，后者只有單一分化潛能,而且MDSCs具有長時(shí)間強(qiáng)大的自我更新能力,在特定刺激下，可在體外分化為神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等系的細(xì)胞，且來源豐富，可離體分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，移植后細(xì)胞存活率顯著高于衛(wèi)星細(xì)胞，有較好的同種異體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)能力，為自體干細(xì)胞治療遺傳缺陷性或退行性疾病及組織器官損傷的修復(fù)提供理想的種子細(xì)胞。

Notch基因是發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)的一種特定的突變形式,這種突變可以影響果蠅翅、眼、剛毛的形成。1940年發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因在果蠅屬胚胎細(xì)胞發(fā)育時(shí)可以發(fā)生基因突變，而它的缺失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的過度分化。1985年通過分子克隆技術(shù)證實(shí)果蠅中Notch基因編碼一種膜蛋白受體，鄰近細(xì)胞上的Delta配體也是一種膜蛋白。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，存在4個(gè)Notch受體(Notch1-Notch4)和五個(gè)結(jié)構(gòu)類似的Notch配體(Delta-likel，Delta-like3，Delta-like4，Jaggedl和Jagged2)。

Jagged1是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上Notch受體的主要配體之一，為單次跨膜糖蛋白，表達(dá)于骨髓、胎兒肝基質(zhì)細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞等多種組織，參與調(diào)控許多組織的生長發(fā)育。Jaggedl在造血、肌肉形成、神經(jīng)和血管發(fā)生等過程中起重要作用?？扇苄头强缒さ腏aggedl在血管瘤形成中能夠影響成纖維細(xì)胞的。Jaggedl的突變可以導(dǎo)致一種常染色體顯性遺傳的多臟器發(fā)育異常性疾病，即Alagilie綜合征。

本文通過在研究中我們注意到，在肌源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的過程中，Jagged1蛋白的表達(dá)顯著下降。這說明在體外誘導(dǎo)分化過程中，Jagged1蛋白發(fā)揮了重要作用，其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證明。

【參考文獻(xiàn)】

[1]KangSB,LeeHN,LeeJY,etal.Sphinctercontractilityaftermuscle-derivedstemcellsautograftintothecryoinjuredanalsphinctersofrats[J].DisColonRectum，2008,51(9):1367-1373.

MatsumotoT,CooperGM,GharaibehB,etal.Cartilagerepairinaratmodelofosteoarthritisthroughintraarticulartransplantationofmuscle-derivedstemcellsexpressingbonemorphogeneticprotein4andsolubleFlt-1[J].ArthritisRheum，2009,60(5):1390-1405.

TetsuroTamaki,YoshinoriOkada,YoshiyasuUchiyama，etal.SynchronizedreconstitutionofmuscleWbers,peripheralnervesandbloodvesselsbymurineskeletalmuscle-derivedCD34-/45-cells[J].HistochemCellBiol，2007,128:349–360.

PoulsonDF.TheeffectsofcertainX-chromosomedeficienciesontheembryonicdevelopmentofDrosophilamelanogaster[J].JExpZool,1940,83:271–325.

BuasMF,KabakS,KadeschT.InhibitionofmyogenesisbyNotch:evidenceformultiplepathways[J].JCellPhysiol,2009,218(1):84-93.

LiuT,HuB,ChoiYY，etsignalinginFIZZ1inductionofmyofibroblastdifferentiation[J].AmJPathol,2009,174(5):1745-1755.

SunD,LiH,ZolkiewskaA.Therol