重組DNA技術(shù)的基本工具課件【 知識(shí)精講+備課精思+拓展提升 】 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

2017年版2020年修訂生物課程標(biāo)準(zhǔn)：闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具舊教材：限制性核酸內(nèi)切酶新教材：限制性內(nèi)切核酸酶統(tǒng)稱：限制酶教師解讀注意第3章

基因工程指按照

,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)并通過

DNA重組和

等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的

。由于基因工程是在

上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作

。人們的愿望體外轉(zhuǎn)基因新的生物類型和生物產(chǎn)品DNA分子水平DNA重組技術(shù)操作水平：原理：DNA分子水平基因重組優(yōu)點(diǎn)：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙、

改造生物性狀定向操作環(huán)境：操作對(duì)象：生物體外基因第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具第3章

基因工程非轉(zhuǎn)基因番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲轉(zhuǎn)基因番木瓜利用“分子工具”可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒本節(jié)聚焦：重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具是什么？它

們的作用分別是什么？精準(zhǔn)切割DNA分子“分子手術(shù)刀”將DNA片段再連接起來“分子縫合針”將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞“分子運(yùn)輸車”一.“分子手術(shù)刀”限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱：限制酶）1.來源：主要從

中分離純化出來的。原核生物2.種類：數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）3.作用：能識(shí)別雙鏈DNA分子的

序列，并使每一條鏈中特定部位的

斷開。特定核苷酸磷酸二酯鍵4.特點(diǎn)：專一性大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由

組成，也有少數(shù)為4個(gè)或8個(gè)或其他數(shù)量。6個(gè)核苷酸

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運(yùn)輸車一.“分子手術(shù)刀”限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱：限制酶）5.結(jié)果：產(chǎn)生DNA片段末端（通常有

和

兩種形式）黏性末端平末端EcoRISmaI5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端中軸線從5’→3’方向的識(shí)別序列均為GAATTC，并切斷G和A之間的磷酸二酯鍵從5’→3’方向的識(shí)別序列均為CCCGGG，并切斷C和G之間的磷酸二酯鍵5'5'3'3'且在中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運(yùn)輸車

【推測(cè)】觀察如下限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？在切割位點(diǎn)，DNA一條鏈正向讀的堿基序列與另一條鏈反向讀的堿基序列完全一致。下面哪項(xiàng)不具有限制酶識(shí)別序列的特征（）A．GAATTC

CTTAAG

B．GGGGCCCC

CCCCGGGG

C．CTGCAG

GACGTC

D．CTAAATC

GATTTAG

D反饋練習(xí)【考題鏈接】限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？會(huì)不會(huì)切割自身DNA?

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。

限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，但是不會(huì)切割自身的DNA，以保證自身的安全。二.“分子縫合針”DNA連接酶1.作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的

。磷酸二酯鍵

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運(yùn)輸車【思考】連接的黏性末端需要滿足什么條件？遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則DNA連接酶沒有識(shí)別序列的特異性2.種類：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源________________________功能只縫合____________縫合____________和____________結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的_____________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端（效率低）磷酸二酯鍵

T

A

A

A

T

C--

G

----C

--GATTTADNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵【總結(jié)】幾種相關(guān)酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶

DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對(duì)之間的氫鍵將DNA切成兩個(gè)片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈反饋練習(xí)根據(jù)所學(xué)知識(shí)，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶ba磷酸二酯鍵氫鍵A.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②三.“分子運(yùn)輸車”基因進(jìn)入細(xì)胞的載體1.作用：將外源基因送入受體細(xì)胞,

在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。2.種類：質(zhì)粒動(dòng)植物病毒噬菌體（最常用）

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有

能力的

。自我復(fù)制環(huán)狀雙鏈DNA分子它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大的差別。

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運(yùn)輸車三.“分子運(yùn)輸車”基因進(jìn)入細(xì)胞的載體3.運(yùn)載體需具備的條件：①有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)便于插入（攜帶）目的基因④有某些標(biāo)記基因（便于鑒定和篩選篩含有重組DNA分子的細(xì)胞）③對(duì)受體細(xì)胞無害，不會(huì)影響受體細(xì)胞正常的生命活動(dòng)（以質(zhì)粒為例）②能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存（自我復(fù)制或者插入到受體DNA同步復(fù)制）真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運(yùn)輸車環(huán)狀DNA【拓展】標(biāo)記基因?qū)χ亟MDNA的鑒定和選擇原理重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞不是100%，而且導(dǎo)入率較低如:綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)標(biāo)記基因通常有:①抗生素的抗性基因如:抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)②熒光蛋白基因存活不存活重組DNA分子用EcoRI限制酶切割下列兩段DNA序列:5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'5'-TCCTAGAATT

CTCGGTATGAATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'5'5'3'3'【思考與討論】5'-ATAGCATGCTATCCATG3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC-3'GCCGTATG-5'AATT

CTCGGTATGGAGCCATACTTAA【思考】要想獲得某個(gè)特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？

可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？5'-TCCTAGAATTC................GAATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAAG................CTTAAGGTATG-5'AATT

C................GG................CTTAA要切

切口，產(chǎn)生

黏性(平)末端。2個(gè)4個(gè)5'-TCCTAG3'-AGGATCTTAAAATTCCATAC-3'GGTATG-5'粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端目的基因1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？【討論】剪刀代表限制酶，透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互相配對(duì)？

如果不能，可能是什么原因造成的？

可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)的選擇不對(duì)（也可能是其他原因）。比如在書寫將要重組的兩個(gè)DNA分子時(shí)，一般要求有同一種限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)，這樣切割后才會(huì)露出相同的黏性末端，否則黏性末端不同，堿基就無法配對(duì)。3.你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？

不能。真正的基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段，且含有幾百至幾千個(gè)不等的堿基對(duì)?！咎骄颗c實(shí)踐】DNA的粗提取與鑒定材料用具1.選材：DNA含量

的生物組織，相對(duì)較高如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。（注意：不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中

沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）2.試劑：①研磨液——破壞細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精——析出DNA③2mol/L的NaCl溶液——溶解DNA④二苯胺試劑——鑒定DNA（要現(xiàn)配現(xiàn)用）⑤蒸餾水（洗滌劑和食鹽）方法步驟1.破碎細(xì)胞——稱取

，切碎，放入研缽，倒入

，

研磨。洋蔥研磨液充分【思考】如果研磨不充分會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？研磨不充分，會(huì)使DNA分子不能從細(xì)胞核中釋放出來，從而使研磨液中的DNA含量較低，影響最終提取的DNA量。2.去除雜質(zhì)——在漏斗中墊上

過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取

；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取

。紗布上清液上清液【思考】過濾能否用濾紙代替紗布？不可以。因?yàn)镈NA會(huì)被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。方法步驟3.DNA的粗提取——【思考】此步驟獲得的上清液中可能含有哪些細(xì)胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等。在上清液中加入體積相等的

溶液,靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的

就是粗提取的DNA。預(yù)冷的酒精白色絲狀物【思考】此步驟的目的是？使蛋白質(zhì)等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出?！就卣埂款A(yù)冷的酒精的優(yōu)點(diǎn)①可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；②抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。析出DNA方法步驟析出DNA3.DNA的粗提取——用玻璃棒沿

攪拌，卷起

，并用濾紙吸去上面的水分：或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中離心，取

晾干。一個(gè)方向沉淀物【思考】為什么要用玻璃棒沿一個(gè)方向緩慢攪拌？避免破壞DNA4.DNA的鑒定——取

20mL的試管，各加入

的NaCl的溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中加入4mL的

試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于

中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中顏色的變化。實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組2mol/L二苯胺沸水絲狀物兩支結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.如果提取出來的不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。2.DNA與二苯胺試劑呈