重組DNA技術(shù)的基本工具課件【 知識精講+備課精思+拓展提升 】 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

2017年版2020年修訂生物課程標(biāo)準(zhǔn)：闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具舊教材：限制性核酸內(nèi)切酶新教材：限制性內(nèi)切核酸酶統(tǒng)稱：限制酶教師解讀注意第3章

基因工程指按照

,進行嚴(yán)格的設(shè)計并通過

DNA重組和

等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的

。由于基因工程是在

上進行設(shè)計和施工的，因此又叫作

。人們的愿望體外轉(zhuǎn)基因新的生物類型和生物產(chǎn)品DNA分子水平DNA重組技術(shù)操作水平：原理：DNA分子水平基因重組優(yōu)點：克服遠緣雜交不親和障礙、

改造生物性狀定向操作環(huán)境：操作對象：生物體外基因第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具第3章

基因工程非轉(zhuǎn)基因番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲轉(zhuǎn)基因番木瓜利用“分子工具”可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒本節(jié)聚焦：重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具是什么？它

們的作用分別是什么？精準(zhǔn)切割DNA分子“分子手術(shù)刀”將DNA片段再連接起來“分子縫合針”將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細胞“分子運輸車”一.“分子手術(shù)刀”限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱：限制酶）1.來源：主要從

中分離純化出來的。原核生物2.種類：數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）3.作用：能識別雙鏈DNA分子的

序列，并使每一條鏈中特定部位的

斷開。特定核苷酸磷酸二酯鍵4.特點：專一性大多數(shù)限制酶的識別序列由

組成，也有少數(shù)為4個或8個或其他數(shù)量。6個核苷酸

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運輸車一.“分子手術(shù)刀”限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱：限制酶）5.結(jié)果：產(chǎn)生DNA片段末端（通常有

和

兩種形式）黏性末端平末端EcoRISmaI5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端中軸線從5’→3’方向的識別序列均為GAATTC，并切斷G和A之間的磷酸二酯鍵從5’→3’方向的識別序列均為CCCGGG，并切斷C和G之間的磷酸二酯鍵5'5'3'3'且在中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運輸車

【推測】觀察如下限制酶所識別的序列有什么特點？在切割位點，DNA一條鏈正向讀的堿基序列與另一條鏈反向讀的堿基序列完全一致。下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（）A．GAATTC

CTTAAG

B．GGGGCCCC

CCCCGGGG

C．CTGCAG

GACGTC

D．CTAAATC

GATTTAG

D反饋練習(xí)【考題鏈接】限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？會不會切割自身DNA?

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。

限制酶就是細菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，但是不會切割自身的DNA，以保證自身的安全。二.“分子縫合針”DNA連接酶1.作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的

。磷酸二酯鍵

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運輸車【思考】連接的黏性末端需要滿足什么條件？遵循堿基互補配對原則DNA連接酶沒有識別序列的特異性2.種類：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源________________________功能只縫合____________縫合____________和____________結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_____________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端（效率低）磷酸二酯鍵

T

A

A

A

T

C--

G

----C

--GATTTADNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點模板作用對象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵【總結(jié)】幾種相關(guān)酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶

DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對之間的氫鍵將DNA切成兩個片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈反饋練習(xí)根據(jù)所學(xué)知識，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶ba磷酸二酯鍵氫鍵A.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②三.“分子運輸車”基因進入細胞的載體1.作用：將外源基因送入受體細胞,

在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制。2.種類：質(zhì)粒動植物病毒噬菌體（最常用）

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有

能力的

。自我復(fù)制環(huán)狀雙鏈DNA分子它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大的差別。

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運輸車三.“分子運輸車”基因進入細胞的載體3.運載體需具備的條件：①有一個至多個限制酶切點便于插入（攜帶）目的基因④有某些標(biāo)記基因（便于鑒定和篩選篩含有重組DNA分子的細胞）③對受體細胞無害，不會影響受體細胞正常的生命活動（以質(zhì)粒為例）②能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存（自我復(fù)制或者插入到受體DNA同步復(fù)制）真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。

分子手術(shù)刀

分子縫合針

分子運輸車環(huán)狀DNA【拓展】標(biāo)記基因?qū)χ亟MDNA的鑒定和選擇原理重組DNA導(dǎo)入受體細胞不是100%，而且導(dǎo)入率較低如:綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)標(biāo)記基因通常有:①抗生素的抗性基因如:抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)②熒光蛋白基因存活不存活重組DNA分子用EcoRI限制酶切割下列兩段DNA序列:5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'5'-TCCTAGAATT

CTCGGTATGAATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'5'5'3'3'【思考與討論】5'-ATAGCATGCTATCCATG3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC-3'GCCGTATG-5'AATT

CTCGGTATGGAGCCATACTTAA【思考】要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個切口？

可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？5'-TCCTAGAATTC................GAATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAAG................CTTAAGGTATG-5'AATT

C................GG................CTTAA要切

切口，產(chǎn)生

黏性(平)末端。2個4個5'-TCCTAG3'-AGGATCTTAAAATTCCATAC-3'GGTATG-5'粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端目的基因1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？【討論】剪刀代表限制酶，透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互相配對？

如果不能，可能是什么原因造成的？

可能是剪切位點或連接位點的選擇不對（也可能是其他原因）。比如在書寫將要重組的兩個DNA分子時，一般要求有同一種限制酶的識別和切割位點，這樣切割后才會露出相同的黏性末端，否則黏性末端不同，堿基就無法配對。3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？

不能。真正的基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段，且含有幾百至幾千個不等的堿基對?！咎骄颗c實踐】DNA的粗提取與鑒定材料用具1.選材：DNA含量

的生物組織，相對較高如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中

沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）2.試劑：①研磨液——破壞細胞，釋放出細胞內(nèi)的物質(zhì)②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精——析出DNA③2mol/L的NaCl溶液——溶解DNA④二苯胺試劑——鑒定DNA（要現(xiàn)配現(xiàn)用）⑤蒸餾水（洗滌劑和食鹽）方法步驟1.破碎細胞——稱取

，切碎，放入研缽，倒入

，

研磨。洋蔥研磨液充分【思考】如果研磨不充分會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？研磨不充分，會使DNA分子不能從細胞核中釋放出來，從而使研磨液中的DNA含量較低，影響最終提取的DNA量。2.去除雜質(zhì)——在漏斗中墊上

過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取

；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取

。紗布上清液上清液【思考】過濾能否用濾紙代替紗布？不可以。因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。方法步驟3.DNA的粗提取——【思考】此步驟獲得的上清液中可能含有哪些細胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等。在上清液中加入體積相等的

溶液,靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的

就是粗提取的DNA。預(yù)冷的酒精白色絲狀物【思考】此步驟的目的是？使蛋白質(zhì)等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出?！就卣埂款A(yù)冷的酒精的優(yōu)點①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。析出DNA方法步驟析出DNA3.DNA的粗提取——用玻璃棒沿

攪拌，卷起

，并用濾紙吸去上面的水分：或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中離心，取

晾干。一個方向沉淀物【思考】為什么要用玻璃棒沿一個方向緩慢攪拌？避免破壞DNA4.DNA的鑒定——取

20mL的試管，各加入

的NaCl的溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中加入4mL的

試劑。混合均勻后，將試管置于

中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中顏色的變化。實驗組對照組2mol/L二苯胺沸水絲狀物兩支結(jié)果分析與評價1.如果提取出來的不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。2.DNA與二苯胺試劑呈