DB14T 2290-2021實驗動物 貓微生物等級與監(jiān)測

山西省市場監(jiān)督管理局山西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布ICS65.020.30CCSB44山西省地14方標準DB14/T2290—2021前言 R IDB14/T2290—2021前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由山西省科學技術(shù)廳提出、歸口并監(jiān)督實施。本文件起草單位：山西醫(yī)科大學。本文件主要起草人：宋國華、軒瑞晶、陳朝陽、高繼萍、劉茂林、續(xù)國強、王曉堂、肖蘭飛。DB14/T2290—2021實驗動物貓微生物等級與監(jiān)測1范圍本文件規(guī)定了實驗動物貓(以下簡稱實驗貓)微生物等級與監(jiān)測的術(shù)語和定義、等級分類、檢測要求、檢測程序、檢測規(guī)則、檢測方法、結(jié)果判定及報告。本文件適用于普通級和SPF級實驗貓微生物等級與監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T14926.1實驗動物沙門菌檢測方法GB/T14926.4實驗動物皮膚病原真菌檢測方法GB/T14926.14實驗動物金黃色葡萄球菌檢測方法GB/T14926.46實驗動物鉤端螺旋體檢測方法GB/T14926.56實驗動物狂犬病病毒檢測方法NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。實驗貓experimentalfeline經(jīng)人工飼育，對其攜帶的病原微生物和寄生蟲實行控制，遺傳背景明確或者來源清楚，用于科學研究、教學、生產(chǎn)和檢定以及其他科學實驗的貓。普通級貓conventional(CV)feline不攜帶重要人獸共患病和貓烈性傳染病病原的實驗貓，簡稱普通貓。無特定病原體級貓specificpathogenfree(SPF)feline除普通級貓應(yīng)排除的病原外，不攜帶所主要潛在感染或條件致病和對科學實驗干擾大的病原的實驗貓，簡稱無特定病原體貓。4等級分類實驗貓分為普通級與無特定病原體級。5檢測要求1DB14/T2290—2021臨床觀察對實驗貓的精神狀態(tài)、行為、被毛、分泌物進行檢查，觀察有無異常。微生物檢測項目各等級實驗貓病原微生物指標見表1。表1各等級實驗貓微生物檢測項目動物等級病原微生物檢測項目檢測要求無特定病原體級普通級貓泛白細胞減少癥病毒Felinepanleukopeniavirus貓皰疹病毒I型Felineherpesvirustype1貓杯狀病毒Felinecalicivirus貓狂犬病毒Felinerabiesvirus沙門菌Salmonellaspp.貓巴爾通體Bartonella致病性鉤端螺旋體Leptospira檢測項目分類微生物檢測項目分為必須檢測項目和必要時檢查項目。必須檢測項目是指在進行實驗貓質(zhì)量評價時必須檢檢測項目分類微生物檢測項目分為必須檢測項目和必要時檢查項目。必須檢測項目是指在進行實驗貓質(zhì)量評價時必須檢測的項目。必要時檢查項目是指從省外或國外引進實驗貓，懷疑有寄生蟲流行感染或申請生產(chǎn)許可證或?qū)嶒炋厥庑枰獣r必須檢測的項目。6檢測程序檢測程序按圖1執(zhí)行。在采樣時，結(jié)合臨床癥狀和實驗室檢查結(jié)果，需要進一步確證的，可取特定樣本進行檢測。2●●●●●●●○貓傳染性腹膜炎病毒Felineinfectiousperitonitisvirus金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus貓免疫缺陷病毒Felineimmunodeficiencyvirus貓白血病病毒Felineleukosisvirus●●○○○必要時檢查項目。DB14/T2290—2021檢測程序7檢測規(guī)則檢測頻率3DB14/T2290—2021普通級與無特定病原體級貓群至少每6個月檢測1次。采樣7.2.1方式選擇成年實驗貓用于檢測(也可根據(jù)需求抽樣)，隨機抽樣。新鮮糞便樣本應(yīng)在飼養(yǎng)單元中選取至少4個點隨機取樣。血液采樣量每只動物至少1mL。7.2.2數(shù)量根據(jù)實驗貓群體大小，抽樣數(shù)量見表2。表2實驗貓抽樣量群體大小(只)抽樣數(shù)量小于100不少于5只100~500不少于10只大于500不少于15只7.2.3方法采采樣方法遵守NY/T541第3章樣品的采集。受檢動物應(yīng)當日采樣，可按病毒、細菌、真菌及寄生蟲檢測要求聯(lián)合采樣。送檢要求樣本要求有明顯標識，包裝完好，送檢單應(yīng)寫明檢品名稱、品系、等級、數(shù)量及檢測項目等內(nèi)容，安全送達送檢單位。8檢測方法貓泛白細胞減少癥病毒和貓皰疹病毒I型采用多重PCR方法檢測，見附錄A。貓杯狀病毒采用RT-PCR方法檢測，見附錄B。狂犬病病毒按GB/T14926.56的規(guī)定進行。沙門氏菌按GB/T14926.1的規(guī)定進行。貓巴爾通體采用PCR方法檢測，見附錄C。鉤端螺旋體按GB/T14926.46的規(guī)定進行。皮膚病原真菌按GB/T14926.4的規(guī)定進行。貓傳染性腹膜炎病毒采用巢式RT-PCR方法檢測，見附錄D。金黃色葡萄球菌按GB/T14926.14的規(guī)定進行。貓免疫缺陷病毒采用巢式RT-PCR方法檢測，見附錄E。貓白血病病毒采用巢式RT-PCR方法檢測，見附錄F。9結(jié)果判定4DB14/T2290—2021在檢測的各等級動物中，如有某項指標不符合該等級標準指標要求，則判為不符合該等級標準。10報告檢測結(jié)束出具報告，報告應(yīng)包括檢測結(jié)果、檢驗結(jié)論等內(nèi)容。55DB14/T2290—2021附錄A(規(guī)范性)貓泛白細胞減少癥病毒和貓皰疹病毒I型的多重PCR檢測方法采用PCR方法，特異性擴增貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)的NS基因序列和貓皰疹病毒I型(FHV-I)的TK基因序列，用于貓泛白細胞減少癥病毒和貓皰疹病毒I型的檢測。ADNA提取按照病毒DNA提取試劑盒操作方法進行，提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆?。A.2PCR反應(yīng)引物A.2.1貓泛白細胞減少癥病毒PCR反應(yīng)引物上游引物序列(5'-3')：ATGGTTGGTGACTCTTTGTTT下游引物序列(5'-3')：TACATTTGATTGACACTTCCCA.2.2貓皰疹病毒I型PCR反應(yīng)引物上游引物序列(5'-3')：GACGTGGTGAATTATCAG下游引物序列(5'-3')：CAACTAGATTTCCACCAGGAA.3PCR反應(yīng)條件94℃變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。A.4PCR產(chǎn)物A.4.1檢測方法1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。A.4.2產(chǎn)物大小貓泛白細胞減少癥病毒目的片段大小為392bp；貓皰疹病毒I型目的片段大小為290bp。6DB14/T2290—2021附錄B(規(guī)范性)貓杯狀病毒RT-PCR檢測方法采用PCR方法，特異性擴增貓杯狀病毒(FCV)的ORF2基因序列，用于貓杯狀病毒的檢測。A按照病毒RNA提取試劑盒操作方法進行，提取的RNA于-20℃保存?zhèn)溆?。B.2反轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對所提RNA進行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。B.3PCR反應(yīng)引物上游引物序列(5'-3')：AACCTGCGCTAACGTGCTT下游引物序列(5'-3')：CAGTGACAATACACCCAGAAB.4PCR反應(yīng)條件94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。BB5PCR產(chǎn)物B.5.1檢測方法1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。B.5.2產(chǎn)物大小貓杯狀病毒目的片段大小為922bp。7DB14/T2290—2021附錄C(規(guī)范性)貓血巴爾通體PCR檢測方法采用PCR方法，特異性擴增貓血巴爾通體16SrDNA基因片段，用于貓血巴爾通體的檢測。C.1DNA提取按照DNA提取試劑盒操作方法進行，提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩.2PCR反應(yīng)引物上游引物序列(5'-3')：TCACAATGGACGAAAGTCTG下游引物序列(5'-3')：CCAAACATCTCAAGACACGAGC.3PCR反應(yīng)條件95℃預變性2min；95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。C.4PCR產(chǎn)物C.4.1檢測方法11%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。C.4.2產(chǎn)物大小貓血巴爾通體目的片段大小為711bp。8DB14/T2290—2021附錄D(規(guī)范性)貓傳染性腹膜炎病毒巢式RT-PCR檢測方法采用RT-PCR方法，特異性擴增貓傳染性腹膜炎病毒ORF1b基因片段，用于貓傳染性腹膜炎病毒的檢測。A按照病毒RNA提取試劑盒操作方法進行，提取的RNA于-20℃保存?zhèn)溆?。D.2反轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對所提RNA進行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。D.3PCR反應(yīng)引物上游引物序列(5'-3')：GTGATGCTATCATGACTAG下游引物序列(5'-3')：CAGTGACAATACACCCAGAAD.4PCR反應(yīng)條件95℃預變性95℃預變性2min；95℃變性30s，48℃退火35s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。D5PCR產(chǎn)物D.5.1檢測方法1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。D.5.2產(chǎn)物大小貓傳染性腹膜炎病毒目的片段大小為417bp。9DB14/T2290—2021附錄E(規(guī)范性)貓免疫缺陷病毒巢式RT-PCR檢測方法采用巢式RT-PCR方法，特異性擴增貓免疫缺陷病毒pol基因片段，用于貓免疫缺陷病毒的檢測。按照病毒RNA提取試劑盒操作方法進行，提取的RNA于-20℃保存?zhèn)溆?。E.2反轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對所提RNA進行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。E.3PCR反應(yīng)引物E.3.1第一次反應(yīng)引物上游引物序列(5'-3')：TGGCCWYTAWCWAATGAAAARATWGAAGC下游引物序列(5'-3')：GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCCE.3.2第二次反應(yīng)引物上游引物序列上游引物序列(5'-3')：TGAAAARATWGAAGCHTTAACAGAMATAG下游引物序列(5'-3')：GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCCE.4PCR反應(yīng)條件E.4.1第一次PCR反應(yīng)條件以制備的cDNA為模板，進行第一次PCR反應(yīng)，條件如下：95℃預變性2min；95℃變性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。E.4.2第二次PCR反應(yīng)條件以第一次PCR產(chǎn)物為模板，進行第二次PCR反應(yīng)，條件如下：95℃預變性2min；95℃變性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。EPCR產(chǎn)物E.5.1檢測方法1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。E.5.2產(chǎn)物大小貓免疫缺陷病毒目的片段大小為578bp。DB14/T2290—2021附錄F(規(guī)范性)貓白血病病毒巢式RT-PCR檢