血液代用品醫(yī)學(xué)宣教

Contents概論1血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能2血紅蛋白的化學(xué)修飾4血紅蛋白的制備工藝53血液代用品的類型主要內(nèi)容CompanyLogo1概論血液的功能常規(guī)輸血的憂患血液代用品具有的特點(diǎn)CompanyLogo血液的功能運(yùn)輸氧氣、二氧化碳和營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物，可以調(diào)節(jié)組織的水分、酸堿度、滲透壓和溫度，還可以吞噬細(xì)菌（白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），產(chǎn)生抗體（淋巴細(xì)胞）等CompanyLogo血液血細(xì)胞紅細(xì)胞白細(xì)胞血小板血漿

(細(xì)胞間質(zhì))水血漿蛋白、糖、維生素、激素、代謝產(chǎn)物及無機(jī)鹽等CompanyLogo血細(xì)胞CompanyLogo常規(guī)輸血的憂患輸血時(shí)必須血型相配，延誤治療而造成死亡；血液污染嚴(yán)重，威脅輸血安全；健康供血人群不足，血液嚴(yán)重短缺；血液的保存期短。CompanyLogo血液代用品具有的特點(diǎn)無菌、無病毒、無毒性、無熱源、對(duì)輸入體無免疫原性適合各種血型與人血液所有組分具有相容性，在最大限度上代替人血的生理功能（具備運(yùn)輸氧、二氧化碳的能力，提供緩沖和自由基淬滅能力，可起到血漿擴(kuò)容作用并維持膠體滲透壓)在血管內(nèi)有較長的保留時(shí)間，代謝產(chǎn)物無毒并能經(jīng)過正常的渠道排出儲(chǔ)存時(shí)間長，而所需的條件不高。血液代用品指具有攜帶氧氣和擴(kuò)容功能的溶液。CompanyLogo2血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能；影響血紅蛋白氧親和力的因素。CompanyLogoHb的組成與結(jié)構(gòu)Hb4條珠蛋白鏈：α141×2；β146×2

（共574個(gè)AA）4分子血紅素每條多肽鏈結(jié)合一個(gè)血紅素分子構(gòu)成一個(gè)Hb單位

∴Hb是四聚體，在紅細(xì)胞中占干重的95％Hb的組成CompanyLogo血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點(diǎn)：CompanyLogo血紅蛋白的功能血紅蛋白是一種雙向呼吸載體，主要負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧和二氧化碳；血紅蛋白和氧的結(jié)合與解離主要取決于氧的分壓和血液的pH。血紅蛋白氧飽和分?jǐn)?shù)和氧分壓的關(guān)系呈S形曲線；曲線說明血紅蛋白與氧的結(jié)合隨氧分壓的增高而加快，釋放氧則隨著氧分壓的降低而加快。這樣血紅蛋白可在較窄的氧分壓范圍內(nèi)完成輸氧任務(wù)，使機(jī)體內(nèi)氧水平不致有較大的起伏。CompanyLogo影響血紅蛋白對(duì)氧親和力的因素

P50；影響血紅蛋白氧親和力因素包括紅細(xì)胞內(nèi)的H+、CO2，氧,2,3-DPG以及其他陰離子的濃度等；波爾效應(yīng)；2,3-DPG的影響。CompanyLogo3血液代用品的類型無載氧功能的血管擴(kuò)容劑（第一代紅細(xì)胞代用）；全氟碳化合物、化學(xué)修飾血紅蛋白及基因重組血紅蛋白（第二代血紅蛋白代用品）；模擬天然紅細(xì)胞膜和紅細(xì)胞內(nèi)的生理環(huán)境，用仿生高分子材料將血紅蛋白包裹起來，制備成“人工紅細(xì)胞”。（第三代血液代用品）CompanyLogo全氟碳化合物

全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)國外很早就有人開始血液代用品的研究。1966年，由美國Cincinnati大學(xué)的Clark首創(chuàng)并做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小鼠在含有PFC的飽和氧中能正常生存。1978年Naito等首次將第一代氟碳化合物（FluosolDA)用于臨床實(shí)驗(yàn)。PFC的優(yōu)點(diǎn)是可以直接用化學(xué)方法合成，價(jià)格低廉，而且不受生物來源的影響，避免因異體輸血而造成的交叉感染。

CompanyLogo全氟碳化合物

—定義及性質(zhì)

PFC是將碳氧化合物中的氫原子全部用氟原子取代而產(chǎn)生的一類環(huán)狀或直鏈狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物。PFC隨溫度變化而可成固、液、氣態(tài)，常溫下PFC為液態(tài)，但不溶于水，需要經(jīng)過乳化變?yōu)榭扇苄匀閯?。PFC氧離曲線與氧分壓呈直線相關(guān)，不受pH值影響，其溶解氧的能力約為血液的2倍、水的20倍

CompanyLogo全氟碳化合物全氟萘烷CompanyLogo全氟碳化合物

優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)不依賴于過期的人血或者其他生物來源的血液，能夠大批量生產(chǎn)，而且純度可以很好的控制；對(duì)于不愿意接受別人血液或者血液替代品的宗教信仰者?？墒褂眠@種化學(xué)合成物；

缺點(diǎn)：使用時(shí)必須呼吸70%-100%的氧；有效時(shí)間短；存放需要合適的溫度和條件；流感樣癥狀。CompanyLogo血紅蛋白類血液代用品天然血紅蛋白；血紅蛋白類血液代用品；

1）血紅蛋白的制備；

2）血紅蛋白的化學(xué)修飾。CompanyLogo天然血紅蛋白比全氟碳化合物更符合人體生理需要，來源廣泛；20世紀(jì)30年代，Amberson將制備的血紅蛋白輸送給動(dòng)物進(jìn)行研究，結(jié)果表明這種血紅蛋白能有效地輸送氧氣，但是對(duì)腎臟的毒性大。其原因主要是溶血質(zhì)中存在少量膜基質(zhì)及雜蛋白；無基質(zhì)血紅蛋白（stromafreehemoglobin,SFH)。

1）失去DPG的變構(gòu)調(diào)解作用（放氧和載氧降低）；

2）易解聚為αβ二聚體，氧傳遞能力下降，容易從腎臟濾出，形成血尿，其代謝產(chǎn)物還會(huì)在腎臟小管腔內(nèi)產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

3）在體內(nèi)保留時(shí)間短。CompanyLogo血紅蛋白類血液代用品血紅蛋白的制備CompanyLogo樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理：蛋白質(zhì)提取和分離步驟操作過程可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來分離血紅蛋白(1)紅細(xì)胞的洗滌:①洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。②洗滌操作：1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。CompanyLogo初次離心后的結(jié)果CompanyLogo次洗滌后的結(jié)果CompanyLogo(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯

，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：

①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。CompanyLogo(4)透析：

①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。CompanyLogo透析過程動(dòng)畫演示CompanyLogo利用透析袋透析CompanyLogo凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。CompanyLogo（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。CompanyLogo裝配好的凝膠柱CompanyLogo

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高CompanyLogo（3）樣品加入與洗脫

①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。CompanyLogo（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。CompanyLogo收集得到的純化后的蛋白CompanyLogo血紅蛋白類血液代用品血紅蛋白的化學(xué)修飾目的：穩(wěn)定血紅蛋白4聚體結(jié)構(gòu)，增加蛋白相對(duì)分子量，以達(dá)到降低毒性的作用。原理：表面有許多可修飾的功能基團(tuán)類型：分子內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白、多聚血紅蛋白、共軛血紅蛋白、脂質(zhì)體包封血紅蛋白；基因重組血紅蛋白CompanyLogo分子內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白血紅蛋白的化學(xué)修飾血紅蛋白肽鏈間的交聯(lián)，降低氧的親和力。試劑：含有負(fù)電基團(tuán)并能結(jié)合在血紅蛋白中心腔位置，如雙阿司匹林類化合物（3，5-二溴水楊基雙延胡索酸酯），吡哆醛類化合物。產(chǎn)品：美國Baxter公司的DCLHb、加拿大

Hemosol公司的HemolinkCompanyLogoDCLHb血紅蛋白的化學(xué)修飾

diaspirincross-linkedhemoglobin。用3，5-二溴水楊基雙延胡索酸酯對(duì)脫氧的無基質(zhì)血紅蛋白進(jìn)行分子內(nèi)修飾生成α鏈間交聯(lián)產(chǎn)物。相對(duì)分子量65000。。臨床：患者出現(xiàn)皮膚黃染、無癥狀血尿、腸梗阻發(fā)生率顯著提高，三期臨床死亡率增加，于1999年終止臨床試驗(yàn)。CompanyLogoHemolink血紅蛋白的化學(xué)修飾

O-棉籽糖交聯(lián)血紅蛋白，由各種相對(duì)分子量的聚合、非聚合成分組成，含交聯(lián)Hb大于95%。臨床：三期已在美國、英國和加拿大開展。不良反應(yīng)是血壓升高，但在48-72小時(shí)內(nèi)恢復(fù)對(duì)肝腎功能無影響。CompanyLogo多聚血紅蛋白血紅蛋白的化學(xué)修飾分子間修飾主要是形成分子聚合物，從而防止血紅蛋白四聚體的快速解離，延長在血管中的停留時(shí)間。交聯(lián)劑主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。與血紅蛋白反應(yīng)時(shí)無特異的結(jié)合位點(diǎn)，屬于多位點(diǎn)修飾，形成相對(duì)分子量不等的交聯(lián)聚合體，從而減少溶液中分子數(shù)目，溶液滲透壓和黏度也隨之降低。產(chǎn)品：美國Biopure公司的Hemopure和NorthfieldLaboratories公司生產(chǎn)的PolyhemeCompanyLogo共軛血紅蛋白血紅蛋白的化學(xué)修飾血紅蛋白與天然或者合成的可溶性高分子反應(yīng)，形成共軛結(jié)合物，可以大大增加Hb的穩(wěn)定性，有效地防止四聚體解離；同時(shí)包裹在Hb周圍的高分子鏈覆蓋了抗原位點(diǎn)，起到了降低免疫原性，提高存留時(shí)間；而且，分子穩(wěn)定性好，能在循環(huán)中維持較高氧含量，并降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，較少可能的過敏和免疫反應(yīng)?？墒故а?0-50%的狗在兩周內(nèi)無死亡現(xiàn)象，體重、食物攝入量均正常，無明顯毒性反應(yīng)，尿液分析和血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)也無明顯變化。CompanyLogo化學(xué)修飾存在的問題血紅蛋白的化學(xué)修飾產(chǎn)品是非均一性混合物；病原微生物尚未解決；大分子的聚合體使某些蛋白溶液引起許多病癥；終產(chǎn)物不穩(wěn)定性，導(dǎo)致交聯(lián)Hb間的重新排列；重現(xiàn)率低。CompanyLogo脂質(zhì)體包封血紅蛋白血紅蛋白的化學(xué)修飾模擬天然紅細(xì)胞膜和紅細(xì)胞內(nèi)的生理環(huán)境，用仿生高分子材料將血紅蛋白包裹起來，制備成“人工紅細(xì)胞”優(yōu)點(diǎn)：1）血紅蛋白不直接暴露于內(nèi)環(huán)境；2）可將紅細(xì)胞所屬的各種酶類包括在人工細(xì)胞內(nèi)，避免四聚體的解離而產(chǎn)生的腎毒性；3）脂質(zhì)體不與血型抗體反應(yīng)，延長其循環(huán)時(shí)間；4）血紅蛋白未經(jīng)過化學(xué)修飾，保證其正常生理功能；5）包裹天然紅細(xì)胞內(nèi)的高鐵血紅蛋白還原系統(tǒng)；6）包封入DPG，可降低Hb氧結(jié)合力，增加傳遞氧的能力。CompanyLogo脂質(zhì)體包封血紅蛋白血紅蛋白的化學(xué)修飾制備的兩個(gè)基本條件：

1）制備過程中確保極易被氧化的血紅蛋白不被氧化；2）脂質(zhì)體包封血紅蛋白及其輔助成分在制備和保存過程中有足夠的穩(wěn)定性，并使脂質(zhì)體包封血紅蛋白的循環(huán)存留時(shí)間延長工藝發(fā)展CompanyLogo脂質(zhì)體包封血紅蛋白工藝的發(fā)展血紅蛋白的化學(xué)修飾第一代脂質(zhì)體：從雞蛋、大豆中提取的不飽和脂肪酸、膽固醇以及維生素E等造成：1）、半衰期短；2）、不飽和脂質(zhì)在血漿中的氧化使血紅蛋白被氧化成