淺論P(yáng)PARγ配體羅格列酮對(duì)大鼠擴(kuò)張型心肌病的療效及可能機(jī)制

淺論P(yáng)PARγ配體羅格列酮對(duì)大鼠擴(kuò)張型心肌病的療效及可能機(jī)制【摘要】觀察PPARγ配體羅格列酮對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病的治療作用，并探討可能機(jī)制。方法：30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，等體積生理鹽水灌胃；擴(kuò)張型心肌病組，多柔比星mg·kg-1腹腔注射，每周1次，共8周；擴(kuò)張型心肌?。_格列酮組，羅格列酮mg·kg-1·d-1灌胃治療，共12周。第15周檢測(cè)心肌相關(guān)炎癥因子濃度以及總抗氧化能力、丙二醛濃度；檢測(cè)心功能。結(jié)果：DCM組與CON組相比左室射血分?jǐn)?shù)，+dp/dtmax，-dp/dtmax，TAOC顯著降低。心肌中TNFα，IL1β，IL6，MDA及膠原容積百分?jǐn)?shù)明顯升高，羅格列酮治療后LVEF，TAOC有所改善，TNFα，IL1β，IL6，MDA，CVF有所降低。結(jié)論：PPARγ配體羅格列酮可改善擴(kuò)張型心肌病大鼠的心功能，其機(jī)制可能是提高心肌抗氧化能力、減少炎癥因子的釋放。

【關(guān)鍵詞】過氧化物酶體增殖物激活受體γ擴(kuò)張型心肌病化應(yīng)激炎癥因子

［Abstract］Objective:ToobservetheeffectofadministrationperoxisomeproliferatoractivatedreceptorγagonistRosiglitazoneondilatedcardiomyopathy(DCM)ratsinducedbyadriamycinandits：ThirtymaleSpragueDawleyratswererandomlydividedinto3groupsas)thecontrolgroup(CON,n=10):Thesamedoseofnormalsodiumwasadministeredbydaily)thedilatedcardiomyopathygroup(DCM,n=6):Adriamycinwasadministeredintraperitoneallyfor8)thedilatedcardiomyopathy+Rosiglitazonegroup(DCM+RSG,n=6).concomitantadriamycinandrosiglitazone,rosiglitazoneadministereddailygavageatadoseof3mg·kg-1·d-1for12concentrationofTNFα,IL6,IL1β,TAOC,MDAinmyocardiumwereobtainedat15weeksaftercardiacfunctionwasassessedbyechocardiography,hemodynamicsatthesame：TocomparetheDCMgroupwiththeCONgroup,significantlydecreaseofleftventricularejectionfraction(LVEF),+dp/dtmax,-dp/dtmaxandTAOCwasobserved(P＜),whiletheconcentrationofTNFα,IL1β,IL6,MDAinmyocardium,collagenvolumefraction(CVF)wereallsignificantlyincreased(P＜).LVEF,TAOCwereimproved(P＜)byrosiglitazoneofTNFα,IL1β,IL6,MDAinmyocardiumandCVFweredecreased(P＜)byrosiglitazone：Proliferatoractivatedreceptorγagonistrosiglitazonecanimprovecardiacfunctioninaratmodelofdilatedcardiomyopathyinducedbyadriamycin,andtheantiinflammatory,antioxidativestressmightbetwoofthemechanisms.

［Keywords］PPARγ;dilatedcardiomyopathy;oxidativestress;inflammatoryfactor

擴(kuò)張型心肌病是一種以心臟擴(kuò)大和左心室或全心收縮功能下降為主要特征的常見心肌疾病，其具體的病理生理機(jī)制目前尚不明確。過氧化物酶體增殖物激活受體γ是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，近年研究發(fā)現(xiàn)其在心血管系統(tǒng)有表達(dá)［1］，同時(shí)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均提示PPARγ由配體激活后可以改善心室重構(gòu)［2］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察PPARγ配體羅格列酮對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病大鼠心功能、心室重構(gòu)、氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響，并探討其中的可能機(jī)制。

1材料和方法

材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康8周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量g，由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

藥品及試劑多柔比星；羅格列酮鈉；氯胺酮；心肌組織TNFα，IL1β，IL6放射免疫試劑盒；總抗氧化能力、丙二醛測(cè)定試劑盒；VG染色試劑盒。

實(shí)驗(yàn)儀器AgilentSonos5500彩超儀，S12型高頻超聲探頭；小動(dòng)物電生理記錄儀；超聲波細(xì)胞破碎儀；核酸蛋白定量?jī)x；病理切片機(jī)；顯微照相及圖像分析系統(tǒng)。

方法

動(dòng)物分組與給藥正常對(duì)照組，生理鹽水ml·kg-1·d-1灌胃，共12周；第5周起使用生理鹽水ml·kg-1腹腔注射，每周1次，至第12周；擴(kuò)張型心肌病組，生理鹽水灌胃同CON組，第5周起使用多柔比星mg·kg-1腹腔注射，每周1次，至第12周；擴(kuò)張型心肌病+羅格列酮組，羅格列酮鈉mg·kg-1·d-1灌胃，共12周，多柔比星腹腔注射同DCM組。多柔比星注射完畢后觀察2周，于第15周進(jìn)行心臟彩超和血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，留取標(biāo)本檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

心臟超聲檢測(cè)氯胺酮腹腔注射全身麻醉大鼠，測(cè)定體質(zhì)量，采用S12型探頭，頻率5～12MHz，取左室短軸切面，在二維影像指導(dǎo)下用M超測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑，左室收縮末內(nèi)徑，左室射血分?jǐn)?shù)，左室短軸縮短率。所有指標(biāo)均在3個(gè)連續(xù)的心動(dòng)周期中由2名觀察者分別觀測(cè)，取平均值。

血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)大鼠頸部正中切口，分離出右頸總動(dòng)脈，將軟質(zhì)導(dǎo)管自右頸總動(dòng)脈插入左心室，尾部連接Powerlab八通道生理記錄儀的壓力傳感器，觀察并同步記錄壓力容積曲線，測(cè)算左心室壓峰值、收縮期dp/dtmax、舒張末期dp/dtmax(-dp/dtmax)。

心室質(zhì)量及指數(shù)測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)完成后開胸，取出心臟，以4℃肝素生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱取含室間隔的左心室實(shí)際質(zhì)量、右心室實(shí)際質(zhì)量，分別除以體質(zhì)量后得出左室質(zhì)量指數(shù)和右室質(zhì)量指數(shù)。

心肌組織TNFα，IL1β，IL6，TAOC，MDA檢測(cè)取心尖部心肌組織約100mg，充分勻漿，4℃3000r/min離心15min，取上清BCA法行蛋白定量，于-80℃保存，按放免試劑盒測(cè)定步驟測(cè)定TNFα，IL1β，IL6；按試劑盒說明比色法測(cè)定TAOC和MDA。

組織病理學(xué)檢測(cè)心臟標(biāo)本置4%中性甲醛液固定，取左室中段心肌組織2～3mm厚，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色；按VG染色試劑盒操作步驟行VG染色，用LeicaQWIN3圖像分析系統(tǒng)在400倍下行圖像分析，每張切片選取4個(gè)不重疊視野，計(jì)算每個(gè)視野中膠原組織所占百分比，取平均數(shù)代表CVF。

統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較用SNK法，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

死亡率

CON組大鼠無死亡。DCM組共死亡4只，死亡率為40%。DCM+RSG組死亡2只，死亡率為20%，較DCM組明顯降低。

心臟超聲測(cè)定結(jié)果

與CON組相比，DCM組LVEDD，LVESD增高，LVFS，LVEF均顯著降低；羅格列酮治療后，LVESD，LVEDD，LVFS，LVEF均有明顯改善。見表1。表1各組大鼠超聲心動(dòng)圖及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果

DCM組LVSP，+dp/dtmax，-dp/dtmax顯著低于CON組，LVEDP高于CON組；使用羅格列酮治療后LVSP，+dp/dtmax，-dp/dtmax均有所升高，LVEDP有所降低，但未恢復(fù)正常。見表1。

心室質(zhì)量及指數(shù)

DCM組LVAW，RVAW，LVWI和RVWI均明顯高于CON組，羅格列酮可以使LVAW，RVAW，LVWI，RVWI得到改善，但仍高于CON組。見表2。表2各組大鼠心室質(zhì)量及心室質(zhì)量指數(shù)檢測(cè)結(jié)果

心肌組織TNFα，IL1β，IL6測(cè)定值

DCM組心肌組織中TNFα，IL1β，IL6的表達(dá)均明顯增高。羅格列酮治療后心肌組織中上述因子的表達(dá)水平均有所降低,見表3。

心肌組織TAOC，MDA測(cè)定值

DCM組TAOC降低，MDA增高，使用羅格列酮后MDA水平有降低，TAOC改善明顯,見表3。表3各組大鼠心肌組織中TNFα，IL1β，IL6，TAOC，MDA測(cè)定值

組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

大鼠心肌HE染色顯示DCM組心肌細(xì)胞片狀變性壞死，心肌細(xì)胞明顯腫脹、間隙增寬、心肌纖維局限性斷裂，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生；DCM+RSG組心肌細(xì)胞僅僅有點(diǎn)狀變性壞死，心肌細(xì)胞腫脹及淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)均有改善，見圖1。大鼠心肌VG染色顯示在病灶部位出現(xiàn)紅色膠原染色，在病灶局部膠原結(jié)締組織增生，間質(zhì)纖維化，CON組僅見少許膠原，DCM組可見膠原大量增生，兩組CVF分別為(±)%和(±)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DCM+RSG組CVF為(±)%，顯著低于DCM組。見圖2。

3討論

羅格列酮是PPARγ的特異性配體之一，兩者結(jié)合后通過與某些基因上游特異的DNA反應(yīng)元件相互作用及非DNA結(jié)合依賴模式調(diào)控基因表達(dá)，參與病理生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)［3］。在對(duì)心肌缺血/再灌注、心肌梗死、壓力負(fù)荷性心衰動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)PPARγ配體對(duì)心功能產(chǎn)生了有益作用，但其對(duì)擴(kuò)張型心肌病的作用尚不明確。

本研究采用多柔比星腹腔注射致大鼠擴(kuò)張型心肌病模型，其LVEDD，LVESD，LVWI，RVWI均擴(kuò)大，LVEF，+dp/dtmax，-dp/dtmax下降明顯，與人類臨床擴(kuò)張型心肌病特征基本相符［4］。臨床研究顯示，多柔比星在應(yīng)用早期就可以通過促進(jìn)炎癥因子的釋放和氧化應(yīng)激通路導(dǎo)致心功能下降［5］，相關(guān)炎癥因子在心衰早期即可被激活，而且比經(jīng)典的神經(jīng)內(nèi)分泌因子激活更早［6］。因此，我們采用PPARγ配體羅格列酮預(yù)處理的方法，使得有效的血藥濃度覆蓋了DCM病理生理變化的整個(gè)過程，能在DCM早期進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，羅格列酮預(yù)處理有效改善了DCM大鼠的心室擴(kuò)張程度和心室重構(gòu)，使心功能和生存率得到提高。

臨床發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病患者心肌細(xì)胞能夠分泌TNFα［7］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示超氧化物在擴(kuò)張型心肌病的敘利亞地鼠中明顯升高［8］，PPARγ的缺乏可以導(dǎo)致大鼠心肌抗氧化能力的下降，最終進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病而死亡［9］。PPARγ配體可以有效提高其心室中PPARγ蛋白含量，抑制心室肥大、改善心室重構(gòu)、提高心功能［10,11］，PPARγ共活化物的缺乏可以導(dǎo)致心功能的進(jìn)一步惡化［12］。本組DCM大鼠心肌組織中IL1β，IL6，TNFα均明顯升高，總抗氧化能力下降，心肌壞死明顯并伴有大量膠原增生。PPARγ配體羅格列酮預(yù)處理后DCM大鼠心肌中IL1β，IL6，TNFα濃度降低，總抗氧化能力提高，心肌細(xì)胞壞死減少，心室纖維化得到改善。

諸多相關(guān)研究提示：IL1β，IL6，TNFα的增加促進(jìn)了大鼠心室中成纖維細(xì)胞的活動(dòng)［13］；增強(qiáng)了基質(zhì)金屬蛋白酶活性，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增生［14］；TNFα亦促進(jìn)了心肌壞死［15］；機(jī)體內(nèi)氧自由基相對(duì)或絕對(duì)產(chǎn)生過多，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，心肌的總抗氧化能力明顯下降，心肌出現(xiàn)壞死；這些作用使心臟最終走上病理性重塑。PPARγ配體對(duì)心肌的保護(hù)機(jī)制可能是：①通過NFκB，AP1，JNK等細(xì)胞通路減少心衰時(shí)相關(guān)炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)［16］，同時(shí)，對(duì)炎癥因子的抑制作用也間接抑制了超氧化物的產(chǎn)生；②通過促進(jìn)和激活Cu/Zn-SOD的表達(dá)來減少超氧化物的生成和抑制NADPH氧化酶亞單位p22phox的表達(dá)來干預(yù)氧化應(yīng)激反應(yīng)［17］；③也可以通過誘導(dǎo)型氧化亞氮合酶的表達(dá)產(chǎn)生抗氧化作用［18］，從而調(diào)控MMP2，MMP3，MMP9的表達(dá)，抑制心室纖維化。綜上可見，多柔比星導(dǎo)致的擴(kuò)張型心肌病和其他擴(kuò)張型心肌病的病理生理過程有相似之處，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生發(fā)展中起著極為重要的作用，而PPARγ配體預(yù)處理可以通過抑制炎癥因子的分泌和增強(qiáng)心肌的抗氧化能力對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，從而改善心室重構(gòu)，提高心功能。

在本研究中，羅格列酮對(duì)LVEDD改善不如LVESD明顯，但LVEF明顯改善，不排除PPARγ配體對(duì)心肌收縮力的影響，其機(jī)制尚待研究。多柔比星導(dǎo)致的擴(kuò)張型心肌病中，PPARγ配體通過哪種通路干預(yù)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，以及對(duì)心肌細(xì)胞凋亡、電生理重構(gòu)等的影響尚不甚清楚，有待進(jìn)一步研究以明確。

【參考文獻(xiàn)】

［1］BishopBaileyproliferatoractivatedreceptorsinthecardiovascularsystem［J］.BrJPharmacol,2000,129(5):823-834.

［2］StaelsB,Fruchartrolesofperoxisomeproliferatoractivatedreceptoragonists［J］.Diabetes,2005,54(8):2460-2470.

［3］KaplanJM,CookJA,HakePW,etDeoxydelta(12,14)prostaglandinJ(2)(15DPGJ(2)),aperoxisomeproliferatoractivatedreceptorgammaligand,reducestissueleukosequestrationandmortalityinendotoxicshock［J］.Shock,2005,24(1):59-65.

［4］白潔,陳蓉,盛佳.SD大鼠擴(kuò)張型心肌病模型的建立［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2006，16(3)：210-212

［5］MercuroG,CadedduC,PirasA,etepirubicininducedmyocardialdysfunctionrevealedbyserialtissueDopplerechocardiography:correlationwithinflammatoryandoxidativestressmarkers［J］.Oncologist,2007,12(9):1124-1133.

［6］KosarF,AksoyY,OzguntekinG,etbetweencytokinesandtumourmarkersinpatientswithchronicheartfailure［J］.EurJHeartFail,2006,8(3):270-274.

［7］TsutamotoT,WadaA,OhnishiM,etincreaseintumornecrosisfactoralphaandleftventricularenddiastolicvolumeinpatientswithdilatedcardiomyopathy［J］.EurJHeartFail,2004,6(2):173-180.

［8］MollnauH,OelzeM,AugustM,etofincreasedvascularsuperoxideproductioninanexperimentalmodelofidiopathicdilatedcardiomyopathy［J］.ArteriosclerThrombVascBiol,2005,25(12):2554-2559.

［9］GuoliangD,MinguiF,QianhongQ,etperoxisomeproliferatoractivatedreceptorγisessentialinprotectingcardiomyocytesfromoxidativedamage［J］.CardiovascularResearch,2007,7(3)：6269-6279

［10］HendersonBC,SenU,ReynoldsC,etofsystemichypertensionassociatedcardiacremodelinginchronicpressureoverloadmyocardiumbyciglitazone［J］.IntJBiolSci,2007,3(6):385-392.

［11］ShiomiT,TsutsuiH,HayashidaniS,et,aperoxisomeproliferatoractivatedreceptorgammaagonist,attenuatesleftventricularremodelingandfailureafterexperimentalmyocardialinfarction［J］.Circulation,2002,106(24):3126-3132.

［12］AranyZ,NovikovM,ChinS,etaorticconstrictionleadstoacceleratedheartfailureinmicelackingPPARgammacoactivator1alpha［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(26):10086-10091.

［13］MitchellMD,LairdRE,BrownRD,et1stimulatesratcardiacfibroblastmigrationviaMAPkinasepathways［J］.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2007,292(2):H1139-1147.

［14］SiwikDA,ChangDL,