第一章培養(yǎng)室的基本設(shè)備和

緒論一、概念

植物組織培養(yǎng)（組培）（planttissueculture)，指在無菌條件下，利用人工配制的培養(yǎng)基和合適的光照、溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)、激素等因素對(duì)植物的組織、器官、細(xì)胞和原生質(zhì)體進(jìn)行脫分化誘導(dǎo)形成新的完整植株的一門技術(shù)。

外植體(explant)——用來進(jìn)行組織培養(yǎng)的離體植物接種材料。

根據(jù)所培養(yǎng)的植物材料（外植體）的不同，可把組培分為五種類型：即愈傷組織培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)（胚、花藥、子房、根、莖和葉的培養(yǎng)等）、莖尖分生組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。

脫分化(dedifferentiation)——指已經(jīng)成熟的已分化細(xì)胞（組織）在一定條件的刺激下又恢復(fù)了分生能力的現(xiàn)象。比如成熟組織上形成了愈傷組織。分化(differentiation)——指由具有分生能力的還沒有形態(tài)和功能分化的組織（如分生組織、愈傷組織等）朝著不同的發(fā)育方向發(fā)展，產(chǎn)生了不同的組織和器官的現(xiàn)象。再分化(redifferentiation)——指脫分化的組織再次分化出新的組織或器官的現(xiàn)象。愈傷組織(callus)——指在組織培養(yǎng)中，由外植體長(zhǎng)出來的一團(tuán)無形態(tài)和功能分化的薄壁組織。

細(xì)胞的全能性（totipotent)——任何具有完整的細(xì)胞核的植物細(xì)胞，都擁有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息。二、植物組織培養(yǎng)的發(fā)展歷史

1.探索階段——20世紀(jì)初，在德國(guó)植物學(xué)Schleiden和Schwann的細(xì)胞學(xué)說，德國(guó)植物生理學(xué)家Haberlandt提出了高等植物器官和組織可以不斷分割，直至分到單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn)，并設(shè)想離體細(xì)胞具有再生完整植株的潛力。但沒有成功，直到1934年White培養(yǎng)番茄離體根尖的成功，在此32年中，一直處于探索階段，進(jìn)展不大。2.奠基階段——即20世紀(jì)30年代中至50年代。兩個(gè)重要發(fā)現(xiàn)：一是認(rèn)識(shí)了B族維生素對(duì)植物生長(zhǎng)的重要意義；二是發(fā)現(xiàn)了生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是一種天然的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。3.迅速發(fā)展階段——20世紀(jì)60年代至今。煙草髓部單細(xì)胞獲得完整再生植株；原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破；花藥培養(yǎng)取得顯著成績(jī)；微繁技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。三、組培在農(nóng)、林業(yè)上的應(yīng)用1.快速繁殖2.可獲得去病毒植株3.組培是轉(zhuǎn)基因技術(shù)不可或缺的組成部分，無論是轉(zhuǎn)基因受體的提供，還是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和再生，都需要組培技術(shù)作為支撐。4.克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性5.縮短常規(guī)育種的時(shí)間6.次生代謝物的獲得第一章

組培室的基本設(shè)備和一般技術(shù)（一）實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)與要求現(xiàn)以一個(gè)年產(chǎn)4萬～20萬株苗的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室為例，要求有2～3間實(shí)驗(yàn)用房，其總面積不應(yīng)少于40－60m2。房間可劃分為準(zhǔn)備室、培養(yǎng)室和無菌操作室。1.準(zhǔn)備室要求20m2，明亮，通風(fēng)。準(zhǔn)備室的任務(wù)很繁重，要完成器皿洗滌、培養(yǎng)基配制、分裝、包扎、高壓滅菌，還有試管苗的出瓶、清洗與整理工作。本室應(yīng)由1～2名熟練工來操作。（1）100－200L電冰箱1臺(tái)，用以貯存易變質(zhì)、易分解藥品及各種母液。（2）高壓滅菌鍋，手提式需2－3個(gè)，中型立式只需1個(gè)，手提式快捷方便，但容量少，不能滿足大規(guī)模培養(yǎng)，如年產(chǎn)百萬株苗則應(yīng)選大型臥式滅菌鍋。（3）煮培養(yǎng)基的電爐或煤氣爐，不銹鋼鍋或醫(yī)用搪瓷杯。（4）水槽（5）工作臺(tái)（6）藥品柜、擱架，用于存放藥品、玻璃瓶等。（7）干燥箱一個(gè)，用于玻璃器皿的干燥。（8）蒸餾水器（9）酸度計(jì)或pH計(jì)電子天平的正確使用1.不能經(jīng)常搬動(dòng)；2.干燥的環(huán)境；3.平穩(wěn)，水平臺(tái)面4.步驟：清潔——開機(jī)——調(diào)水平——調(diào)零——關(guān)窗——稱量紙或者稱量杯——清潔——保護(hù)（10）1/1000電子天平1部。（11）培養(yǎng)器皿（12）下口杯，用于分裝培養(yǎng)基，注意：1000ml熱培養(yǎng)基應(yīng)定容到約1100ml。（13）試劑瓶1000ml,500ml,250ml棕色瓶各5個(gè)，白色5個(gè)，100ml滴瓶10個(gè)，100ml試劑瓶20個(gè)。（14）移液管10ml，5ml，2ml,1ml各5支。（15）量筒1000ml2只，500ml2只，100ml4只，50ml4只。（16）燒杯1000ml,500ml,250ml,100ml各10只。（17）容量瓶1000ml,500ml,250ml,100ml,各4只（18）試管刷若干（19）膠手套和線手套若干雙(20)大型的塑料果菜籃20個(gè)，用于堆放培養(yǎng)瓶

倒置顯微鏡2.無菌操作室（接種室）如果說準(zhǔn)備室因工作內(nèi)容多，處理事物的數(shù)量大，以至在條件許可時(shí)面積宜大不宜小，那么無菌操作室卻恰好相反了，即在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精細(xì)密閉，以最大限度減少污染。無菌操作室也叫接種室，是進(jìn)行無菌操作的場(chǎng)所，如材料的消毒接種，無菌材料的繼代，如叢生苗的增殖或切割嫩莖插植生根等。

這里是植物組織培養(yǎng)研究或生產(chǎn)工作中的最關(guān)鍵的部分，關(guān)系到培養(yǎng)物的污染率、接種工作效率等重要指標(biāo)。要求地面、天花板及四壁盡可能光潔，不易積染灰塵，易于采取各種清潔和消毒措施。如放1臺(tái)超凈臺(tái)，約7－8m2，2臺(tái)超凈臺(tái)10－12m2即足夠了。

無菌室要干爽安靜、清潔明亮，在適當(dāng)?shù)匚恢玫跹b紫外滅菌燈1－2盞，用以經(jīng)常照射滅菌，使室內(nèi)保持良好的無菌、低密度有菌狀態(tài)。最好安裝空調(diào)機(jī)，在工作時(shí)把無菌室的門窗關(guān)緊，盡量減少與外界的空氣對(duì)流，減少塵埃與微生物侵入。無菌室配拉門，以減少空氣的擾動(dòng)。

無菌室外應(yīng)留有緩沖間，進(jìn)入無菌室前在此更衣?lián)Q鞋，洗手及處理外界采回準(zhǔn)備消毒培養(yǎng)的材料等。最好安裝一盞紫外燈，用以滅菌。緩沖間有2－3m2就夠了，有一個(gè)洗手池，上面安一小擱架，用來放置燒杯采回來的材料等物。墻上設(shè)衣帽鉤，門邊擺拖鞋架（柜）。無菌室內(nèi)的主要設(shè)備是超凈工作臺(tái)1－2臺(tái)。放置待接種培養(yǎng)瓶的擱架，醫(yī)用小推車，用來推送接種好了的培養(yǎng)瓶等。（1）超凈臺(tái)開機(jī)10分鐘以上即可使用。將空氣通過特制的微孔泡沫塑料片層疊合組成“超級(jí)慮清器”后吹送出來，形成連續(xù)不斷地?zé)o塵無菌的超凈空氣層流，去掉≧0.3μm的塵埃、真菌和細(xì)菌孢子等等。超凈空氣的流速為每分鐘24－30m，這已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會(huì)防礙采用酒精燈的灼燒消毒。

無菌室應(yīng)定期用70％或0.5％苯酚噴霧降塵和消毒，用2％的新潔爾滅抹拭臺(tái)面和用具（70％酒精也可）。用福爾馬林（40％甲醛）加少量高錳酸鉀定期密閉熏蒸，配合紫外線滅菌燈（每次開啟15分鐘以上）等等消毒滅菌手段，以使無菌室經(jīng)常保持無菌狀態(tài)。

紫外光開啟時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，可激發(fā)空氣中的氧分子締合成臭氧分子（O3），這種氣體成分有很強(qiáng)的殺菌作用，可以使紫外線沒有直接照射到的角落產(chǎn)生滅菌效果。由于臭氧有礙健康，在進(jìn)入操作前應(yīng)先關(guān)掉紫外燈，關(guān)后10多分鐘即可入內(nèi)。（2）小擱架貯放高壓滅菌過、等待接種的培養(yǎng)瓶用的小擱架。（3）醫(yī)用小平車用來推送瓶子，如果沒有，也可用其它大磁盤等代替。（4）無菌操作的器具按每個(gè)超凈臺(tái)上的用量計(jì)，需酒精燈1只，25cm長(zhǎng)的醫(yī)用鑷子5把以上，4號(hào)解剖刀柄2－4把，21－23號(hào)刀片若干；不同形狀的解剖用剪各1－2把，如平的、膝狀的、弧形的等等。較長(zhǎng)的可伸入瓶?jī)?nèi)剪取材料

500ml廣口瓶數(shù)只，用于存放酒精（70％或95％均可），可浸泡鑷子、刀、剪等。（5）小白瓷碟或培養(yǎng)皿。用于切割材料用。（6）適當(dāng)大小的燒杯或廣口瓶、玻璃棒等。用于新采材料的表面滅菌和清洗。（7）常備的消毒滅菌藥劑及助劑如0.1％升汞、吐溫、漂白粉精片、次氯酸鈉溶液等。（8）無菌水經(jīng)過高壓滅菌的自來水即可。

3.培養(yǎng)室房間應(yīng)盡量安排在樓層較高處，以利采光，減少塵埃和雜菌污染的機(jī)會(huì)。此外應(yīng)考慮清潔干燥，培養(yǎng)室還要講究保溫隔熱。為了減少能源消耗，應(yīng)盡量考慮利用自然光照，除必要的承重結(jié)構(gòu)外，全部安裝落地式雙層大玻璃窗，并在窗外設(shè)置防曬網(wǎng)，室內(nèi)較暗處應(yīng)安裝燈管，人工輔助補(bǔ)充光源，有的公司在屋頂做可調(diào)節(jié)溫度、光照、濕度的玻璃溫室。冬暖夏涼。

本室的主要設(shè)備與用具有：（1）培養(yǎng)架與燈光年產(chǎn)4－10萬株苗需4－6個(gè)架子。一般每個(gè)架子設(shè)6層，總高200cm，每30cm為一層，最下一層離地20cm。架寬50－60cm，架上安裝1－2盞燈管（40w）以人工輔助照光。培養(yǎng)架應(yīng)縱向?qū)χ庠?。?）配電板在培養(yǎng)室內(nèi)應(yīng)安裝1－2個(gè)配電板，其上設(shè)熔斷器（保險(xiǎn)絲盒）和閘刀開關(guān)，用以管理室內(nèi)的電源。（3）電源開關(guān)時(shí)控器（4）空調(diào)機(jī)室溫控制在25℃左右。（5）溫度、濕度計(jì)（二）操作技術(shù)

1.洗滌

植物組織培養(yǎng)最重要最基本的要求，就是各項(xiàng)操作都應(yīng)從無毒害、無污染的培養(yǎng)環(huán)境來考慮。培養(yǎng)過程中最經(jīng)常最大量的工作之一，是洗滌培養(yǎng)瓶及其它常用器皿。洗好的瓶子應(yīng)透明，內(nèi)外壁水膜均一，不掛水珠，即表示無污跡存在。通常無需再用蒸餾水涮一遍，直接放入潔凈的大果菜籃中，再置擱架上瀝涼水汽,這可能是最省事最節(jié)約又少占空間的辦法。急需使用時(shí)可用干燥箱（70－80℃）烘干。移液管之類的儀器，可用吸球和熱洗衣粉水吸洗，再放水龍頭下流水沖凈，垂直放置涼干。帶刻度的計(jì)量?jī)x器不宜烘烤，以免玻璃變形，影響計(jì)量的準(zhǔn)確度。

2.滅菌

滅菌工作是極其重要的。初學(xué)組培的人，首先要建立有菌和無菌的概念，即必須明確無誤地認(rèn)識(shí)和了解哪些東西及其一部分是有菌的，否則出了問題也不知出在哪里。有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的（未經(jīng)處理的）物體，曾經(jīng)接觸過自然水源的物體，至少它的表面，毫無例外都是有菌的。它的內(nèi)部在未經(jīng)證實(shí)之前，也應(yīng)以有菌物體看待。

超凈臺(tái)的表面也是有菌的；所有的培養(yǎng)容器無論洗得多么干凈，是有菌的；簡(jiǎn)單煮沸過的培養(yǎng)基是有菌的；人體的整個(gè)外表面和與外界相連通的內(nèi)表面，如整個(gè)消化道、呼吸道的內(nèi)表面等等都是有菌的；我們使用的刀、鑷子、剪等工具在未經(jīng)處理之前，都是有菌的。我們所指的菌包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其它微生物。

微生物的特點(diǎn)是：體積極其微??；繁殖力極強(qiáng)；數(shù)量大，無處不有、無孔不入；生命力強(qiáng)。

無菌的范疇：經(jīng)過高溫灼燒或蒸煮過的物體，經(jīng)其它物理的或化學(xué)的方法處理過后的物體，是無菌的。當(dāng)然，這些方法必須是已經(jīng)證明為有效的，并且嚴(yán)格實(shí)施才能達(dá)到無菌狀態(tài)。常用的滅菌(消毒)（sterilizationordisinfection）方法可分為：物理：干熱（烘烤和灼燒）、濕熱（蒸煮或加壓蒸煮）、射線處理、超聲波、微波、過慮后的流體（空氣、溶液）等

化學(xué)：升汞、福爾馬林、雙氧水、高錳酸鉀、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精等等。

組培對(duì)無菌條件的要求是非常嚴(yán)格的，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，稍不小心即易引起雜菌污染，由于它們繁殖極快，同時(shí)還分泌對(duì)植物組織有毒的代謝廢物，最后便使植物組織死亡或失去使用價(jià)值。

（1）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基在制備過程中帶有各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，至少應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)完成滅菌工作。繼代培養(yǎng)更換下來的瓶子和生根苗種植后剩下的瓶子，其中的舊培養(yǎng)基都極易引起污染，應(yīng)及時(shí)清洗，不應(yīng)讓雜菌滋生，以免傳播擴(kuò)散。

新制備分裝好的培養(yǎng)基，放入高壓滅菌鍋內(nèi)加熱。鍋內(nèi)因密閉而使蒸氣壓力上升，并因壓力上升而使水的沸點(diǎn)升高，在每平方厘米1.1kg的壓力下，鍋內(nèi)溫度就能達(dá)到121℃。

在121℃的蒸氣溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及它們高度耐熱的芽孢，這些芽孢在100℃的沸水中能生存好幾個(gè)小時(shí)。一般少量的液體只要20分鐘就能達(dá)到徹底滅菌，如果滅菌的液體量大，就應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌的時(shí)間。特別要指出，只有完全排除鍋內(nèi)的空氣，使鍋內(nèi)全部是蒸氣的情況下，1.1kg/cm2的壓力才對(duì)應(yīng)121℃，否則滅菌便不能徹底。滅菌的功效主要靠溫度，而不是壓力。（2）不耐熱的物質(zhì)采用過慮滅菌一些生長(zhǎng)因子，如赤霉素（GA3）、玉米素、脫落酸、尿素和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理。通常采用過慮滅菌方法。先將除去了不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基其它成分經(jīng)高壓滅菌后放置無菌場(chǎng)所，當(dāng)其冷卻至40℃左右，瓊脂將要凝結(jié)之前，加入經(jīng)過慮滅菌的各項(xiàng)不耐熱成分的溶液，然后混勻放置，待冷涼備用。如果是液體培養(yǎng)基，沒有凝固這個(gè)問題，則可在冷卻到室溫后再立即加入。

防細(xì)菌慮膜其孔徑小于或等于0.45μm。過慮滅菌的原理，是溶液通過慮膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和孢子等因大于慮膜孔徑而被阻。慮膜的吸附作用力也不容忽視，往往小于慮膜孔徑的細(xì)菌等亦不能透過。在需要過慮滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽慮裝置；液體量小時(shí)可用注射過慮器，它由注射器、濾器（可更換）、持著部分和針管等幾部分組成。注射器不必先經(jīng)高壓滅菌，而后面幾部分要預(yù)先用鋁箔或牛皮紙等包扎好

最好放在有螺絲蓋的玻璃罐中，經(jīng)高壓滅菌，濾器滅菌不應(yīng)超過121℃。在使用前按無菌操作要求將注射過慮滅菌器的幾個(gè)部分裝配在一起，把吸有需要過慮滅菌溶液的注射器插入細(xì)菌過慮器與之相配合的插接口，推壓注射器活塞桿，將溶液壓過慮膜，從針管部分滴出的溶液就是無菌溶液了。但是慮膜不能阻擋病毒粒子通過。假如需經(jīng)過慮滅菌的溶液，帶有沉淀物，那么在過慮滅菌之前可先預(yù)過慮。（3）用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌在準(zhǔn)備作無菌操作時(shí)，把解剖刀、鑷子、剪刀等浸入95％酒精中。用之前取出在酒精燈上灼燒滅菌，然后架放在滅過菌的支架上，放涼后立即使用。通常刀、鑷子等都用2-3把輪流灼燒使用。我們?cè)趯?shí)踐中采用500ml的廣口瓶，放入95％的工業(yè)酒精，在操作前將各種器械泡入其中（使用端，占器械總長(zhǎng)度約50－70％）。操作中反復(fù)浸泡、灼燒、放涼、使用，操作完畢器械應(yīng)擦拭干凈。

（4）布制品采用高壓滅菌如布手套、帽子、套袖、工作服、口罩等，洗凈涼干，用牛皮紙包好，經(jīng)高壓滅菌備用。吸水紙等也要高壓滅菌。（5）其它桌面、乳膠手套、墻面等可用70％酒精反復(fù)涂擦作表面滅菌。注意有機(jī)玻璃不能擦酒精。（6）植物材料的表面消毒最初從室內(nèi)外采來的材料，都不同程度帶有各種微生物，因此必須經(jīng)過仔細(xì)表面消毒處理。把處理好的材料經(jīng)無菌操作手續(xù)放置到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種（inoculate），接種的植物材料叫做外植體（explant）。

刷洗、沖洗是材料處理的第一步。

第二步是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并攪動(dòng)，洗衣粉可按每100ml水加1－2角匙的量配制，即濃度較高為好。這是進(jìn)一步減少污染的處理。大約浸攪5分鐘，然后再用自來水沖洗干凈。第三步是材料的表面滅菌（消毒），要在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)操作。

將一干凈燒杯（大小視材料多少而定）或廣口瓶?jī)?nèi)、外表面用70％或75％酒精棉球擦拭作表面消毒，放一經(jīng)同樣處理的玻璃棒，置于超凈臺(tái)（已開機(jī)10分鐘以上）或已滅好菌的接種箱內(nèi)，再把處理好的植物材料置入，同時(shí)已準(zhǔn)備好了消毒溶液、無菌水、待用培養(yǎng)基等。工作人員換上潔凈的工作服，戴上帽子，防止頭發(fā)散落塵屑。用肥皂洗手時(shí)至肘部，用潔凈毛巾擦干，戴或不戴乳膠手套，用70％酒精棉擦手。

坐到超凈臺(tái)前，附近應(yīng)放有座鐘或表，把瀝干水的植物材料轉(zhuǎn)放入消過毒的燒杯或廣口瓶中，看好時(shí)間，倒入消毒溶液，加消毒助劑吐溫-80（tween-80）數(shù)滴，在持續(xù)消毒的時(shí)間內(nèi)不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)或蓋上廣口瓶蓋輕輕搖動(dòng)，以促進(jìn)植物材料各部分與消毒液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。

在快到預(yù)定時(shí)間之前1分鐘，即開始把消毒溶液倒入另一準(zhǔn)備好的大燒杯中，要注意勿使材料倒出。傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。表面滅菌（消毒）的時(shí)間是倒入消毒液開始，到倒入無菌水時(shí)為止，加以記錄，以便今后比較消毒效果，積累經(jīng)驗(yàn)。無菌水涮洗每次3分鐘左右，視采用的消毒溶液種類不同，涮洗的次數(shù)變動(dòng)在3－10次之間。

涮洗完畢，植物材料的表面消毒就做完了，這時(shí)的材料就可以接種了。為什么要用無菌水涮呢？這是因?yàn)楦鞣N消毒劑不但能殺滅微生物，也能殺傷植物細(xì)胞，所以消毒的時(shí)間要考慮選定，消毒后又要盡量將消毒劑對(duì)植物的影響壓縮到最低限度。

植物材料的表面消毒劑有好幾種，在不同的情況下選用其中一二種即可。例如次氯酸鈉或次氯酸鈣在大多數(shù)情況下都能獲得令人滿意的消毒效果。如用次氯酸鈉0.3－0.6％溶液，消毒15－30分鐘，對(duì)許多植物組織效果都很好。今年來發(fā)展使用2種甚至2種以上的滅菌劑來處理外植體。多數(shù)人提倡在倒入正式的滅菌劑之前，用70％酒精作短暫滅菌，

一般在10－30秒左右，這在材料較多時(shí)頗難掌握，70％酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞。在做此項(xiàng)處理時(shí)，預(yù)先準(zhǔn)備好，操作者動(dòng)作要麻利，酒精傾出后立即倒入無菌水，亦可在70％酒精處理10秒左右后，向其中倒入大量無菌水，使酒精濃度降低，再作進(jìn)一步處理。

有一些特殊材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，主要取用內(nèi)部的材料，也可只用70％酒精（處理稍長(zhǎng)時(shí)間）處理。處理完的材料放在無菌條件下，等酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。

異丙醇也可用于表面消毒，但不能用甲醇。也有用９５％酒精處理，并灼燒表面的處理方式。主要看材料適合哪種方式，工作經(jīng)驗(yàn)越豐富，越能靈活運(yùn)用，較快地獲得多量的無菌外植體。材料消毒操作，是初學(xué)者的第一關(guān)，弄不好，則引起接種污染，導(dǎo)致組織培養(yǎng)失敗。要根據(jù)植物材料對(duì)滅菌劑的敏感性來選用不同的藥劑，確定適宜的處理時(shí)間和水洗的次數(shù)。

次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋或帶螺旋蓋的其它廣口器皿較好。過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌。這３種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗３-４次就可以了。而用升汞溶液滅菌的材料，因升汞的殘毒較難去除，應(yīng)當(dāng)用無菌水涮洗８-1０次，每次不少于３分鐘，以盡量去除殘毒。我們?cè)诠ぷ髦卸际遣捎蒙?dāng)增加無菌水涮洗的次數(shù)之后效果很好。

用洗衣粉（洗潔精）浸洗過的材料，可以除去輕度附著在上面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌溶液的直接接觸。酒精除殺菌作用外，也有使材料表面易被浸濕的作用。近年來普遍提倡在滅菌溶液中加添吐溫-80或TritonＸ。

這是一些表面活性劑，主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸潤(rùn)到要滅菌的材料表面，因此加用吐溫后消毒劑活力大為提高，但對(duì)材料的傷害也在增加，應(yīng)仔細(xì)摸索其用量和滅菌時(shí)間。一般每100ml加1-2滴。

吐溫-80，英文商品名Tween-80，又叫polysorbata（聚山梨醇酯），為淺粉紅色油狀液體，有脂肪氣味，用于氣相色譜固定液等。漢語系統(tǒng)命名為聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇酐單油酸酯。此外吐溫-2０（聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇單月桂酸酯），吐溫-4０（聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇單棕?cái)R酸酯）也同樣可用。3．無菌操作技術(shù)先用酒精或者新潔爾滅擦洗兩遍手。（１）將初步洗滌及切割好的植物材料放入廣口瓶或帶螺旋蓋的瓶中，置超凈臺(tái)上，最好轉(zhuǎn)移到一個(gè)經(jīng)過高溫滅菌的帶有蓋子的玻璃瓶中，看好時(shí)間并記錄，倒入加有表面活性劑的消毒溶液，蓋上瓶蓋，并輕搖數(shù)次。預(yù)定時(shí)間到了，開蓋倒出消毒液（在預(yù)備的大燒杯或瓷杯中）。（2）立即倒入無菌水，蓋上蓋子，輕搖，3分鐘后將水倒去再加適當(dāng)量無菌水，反復(fù)涮洗３-４次或８-１０次。最后瀝去水分，用灼燒放涼的鑷子將滅好菌的材料放置在滅過菌的紗布（濾紙）上。小紗布包應(yīng)有４層厚度，可多預(yù)備幾包。

（3）通常小紗布包（濾紙）放在滅過菌的小白瓷碟（培養(yǎng)皿、不銹鋼盤子）上，上面再放材料。然后一手拿解剖刀（剪刀），一手拿鑷子，使材料在紗布（吸水紙）上吸干，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?，有時(shí)材料也可在消毒前全部切好。注意刀和鑷子每使用片刻就應(yīng)擦干凈放入7５％的酒精中，并灼燒放涼備用。常２把交換使用，可提高工作效率，并防止連續(xù)（也稱為交叉污染）

污染的發(fā)生。如鑷子夾了沒有消毒好的材料，再夾其它材料，從而造成污染。又如刀或鑷子碰到臺(tái)面、管（瓶）的外壁，棉塞、包頭紙，以及手拿的部位過近，未能充分灼燒等，連續(xù)使用過久，都易引起交叉污染。工具要多幾份以降低交叉污染的概率。經(jīng)常灼燒操作器械便可打斷這種污染，即便污染也是一個(gè)個(gè)獨(dú)立發(fā)生的，不會(huì)連續(xù)成片地污染。材料洗凈吸干水分也有防止連續(xù)污染的意義。（４）外植體植入培養(yǎng)基表面用上述灼燒消毒過的器械，將切割好的外植體插植到培養(yǎng)基表面上。具體操作是左手拿試管，解開拿走包頭紙，將試管幾乎水平拿著，靠近酒精燈焰，將管口外部在燈焰上燎數(shù)秒鐘，因?yàn)?/p>