急性白血病患者SHP

急性白血病患者SHP【摘要】為了探討造血細(xì)胞磷酸酶基因和原癌基因c-kit在急性白血病患者中的表達(dá)及其與AL的發(fā)生及預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測60例急性白血病患者及33名正常對照者單個核細(xì)胞的SHP-1、c-kitmRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：SHP-1在AML細(xì)胞中表達(dá)陽性率由高至低依次為緩解組、初治組、復(fù)發(fā)組，c-kit表達(dá)陽性率則相反，各組與正常對照組相比有顯著性差異，SHP-1在AML細(xì)胞中表達(dá)陽性率比ALL細(xì)胞高，有顯著性差異，c-kit在AML細(xì)胞中表達(dá)陽性率比ALL細(xì)胞中高，有顯著性差異；SHP-1與c-kit表達(dá)成負(fù)相關(guān)；30例初治AML患者SHP-1＋與SHP-1-的完全緩解率均有顯著性差異，c-kit＋與c-kit-的完全緩解率均有顯著性差異。結(jié)論：SHP-1可能是一個潛在的抑癌基因，它負(fù)性調(diào)節(jié)c-kit基因而抑制腫瘤的發(fā)生，同時監(jiān)測二者的表達(dá)可作為判斷AL治療轉(zhuǎn)歸的預(yù)測指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】急性白血病；SHP-1；c-kit；聚合酶鏈反應(yīng)

ExpressionandClinicalValueofSHP-1andc-kitinAcuteLeukemia

AbstractTheaimofstudyistoinvestigatetheexpressionofhematopoieticcellphosphatase(SHP-1)geneandc-kitpro-oncogeneinacuteleukemia(AL)anditsimpactonprognosisinAL.Semi-quantityreversetranscriptase-polymerasechainreaction(RT-PCR)wasusedtodetecttheexpressionofSHP-1mRNAandc-kitmRNAin60ALpatientsand33normalcontrols(NC).TheresultsshowedthatthepositiveratesofSHP-1expressionfromhightolowlevelwerefoundorderlyincompleteremissiongroup,newlydiagnosedgroupandrelapsedgroup,therewassignificancedifferencebetweeneachgroupandNCgroup.Thepositiveratesofc-kitexpressionwereoppositeorderineachgroupsascomparedwithSHP-1.therewasalsosignificancedifferencebetweeneachgroupandNCgroup.ThepositiverateofSHP-1andc-kitexpressionsinAMLwashigherthanthatinALL,therewasnagativecorrelationbetweenexpressionsofSHP-1andc-kit;ThedifferencebetweenthecompleteremissionrateinSHP-1positiveandinSHP-1negativepatientsfrom30newlydiagnosedAMLpatientswassignificant(P005),thesameresultwasfoundbetweenc-kit+completeremissionandc-kit-completeremission.ItisconcludedthatSHP-1geneisapotentiallyanti-oncogeneandinhibitsthegrowingoftumorbynegativelymodulatingc-kitgene.SimultaneousdetectionofSHP-1andc-kitgenemayactasafactorforpredictingprognosisinAL.

Keywordsacuteleukemia；SHP-1；c-kit；polymerasechainreaction

SHP-1為含SH2域(srchomology-2domain)的酪氨酸磷酸酶-1，主要表達(dá)于造血細(xì)胞，因此又稱為造血細(xì)胞磷酸酶。SHP-1在造血細(xì)胞生成中的作用已經(jīng)由SHP-1突變的motheaten小鼠所證實(shí)，在此模型中由于剪切突變從而影響SHP-1基因的SH2或PTP結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而導(dǎo)致SHP-1的磷酸酶活性部分或全部缺失，在motheaten小鼠和viablemotheaten小鼠引起包括骨髓粒-單核細(xì)胞的過度增殖與積聚的多種造血功能異常，強(qiáng)烈提示motheaten小鼠是由于喪失了SHP-1功能所致。c-kit原癌基因是酪氨酸激酶受體家族Ⅲ類的一個重要成員［1］。c-kit與其配體干細(xì)胞生長因子相結(jié)合對造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞起支持作用，隨著細(xì)胞的分化成熟，逐漸從細(xì)胞表面消失。

c-kit與SCF結(jié)合后和SHP-1偶聯(lián)發(fā)生去磷酸化的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，從而失去SHP-1的負(fù)性調(diào)控作用。為了評價SHP-1和c-kit基因在急性白血病發(fā)病中的作用，我們采用RT-PCR的方法檢測了60例AL患者和33例健康人骨髓標(biāo)本中SHP-1和c-kit基因的表達(dá)情況。

材料和方法

研究對象

60例AL系我院2004年3月至2005年1月住院治療患者，均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)和免疫表型檢測確診。在60例中急性髓細(xì)胞白血病52例，急性淋巴細(xì)胞白血病8例。60例中男33例，女27例，中位年齡34歲(14-70歲)。33名健康志愿者作為正常對照。初治AML患者采用標(biāo)準(zhǔn)DA方案誘導(dǎo)緩解。復(fù)發(fā)AML患者采用IA化療方案。M3患者采用全反式維甲酸或ATRA與三氧化二砷合用或以ATRA為主聯(lián)合應(yīng)用小劑量HA方案治療。對于ALL患者采用VITP方案治療。

細(xì)胞分離及總RNA的提取

取骨髓2ml，肝素抗凝，生理鹽水稀釋3-4倍，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液4ml，2500×g離心16分鐘，分離出單個核細(xì)胞，然后用TRI-REAGENT提取細(xì)胞總RNA。

逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

用隨機(jī)六聚引物合成cDNA。1μg總RNA，在20μl反應(yīng)體積中，37℃60分鐘反轉(zhuǎn)錄，95℃5分鐘終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)體積25μl，含cDNA1μl，MgCl2mmol/L，200μl的4種dNTP，μmol/L的引物，U的Taq酶。SHP-1寡核苷酸引物由日本基因研究實(shí)驗(yàn)室提供，序列資料獲自GenBank(獲取號M27273)，c-kit引物由美國Cybersyn公司合成。SHP-1正義引物：5′-GGGCAGGCAGAGACGCT-3′；反義引物；5′-CTTCTTGAAATGCTCCACCA-3′。c-kit正義引物：5′-GTGGTTAAAGGAAACGCTCG-3′；反義引物：5′-CATACATTTCAGCAGGTGCG-3′；GADPH正義引物：5′-CGGGAAGCTTGTCATCAATGG-3′；反義引物：5′-GGCAGTGATGGCATGGACTG-3′。SHP-1擴(kuò)增片段長度為238bp,c-kit擴(kuò)增片段長度為232bp，GADPH擴(kuò)增片段長度為358bp。擴(kuò)增條件為：SHP-1：94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；c-kit：95℃變性45秒，50℃退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；GADPH：94℃變性60秒，60℃退火55秒，72℃延伸60秒，22個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。產(chǎn)物分析：取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物，1g/100ml瓊脂糖凝膠電泳(90Ｖ，40分鐘),溴化乙錠染色，紫外透射儀上觀察結(jié)果并照相。

統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Excel建庫，所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS軟件處理，兩樣本均數(shù)的比較采用兩個獨(dú)立樣本非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，組間率比較行四格表卡方檢驗(yàn)。P≤為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

正常對照、AML患者、ALL患者(其中包括初治組、復(fù)發(fā)組)SHP-1、c-kit基因表達(dá)水平和陽性率，以相應(yīng)標(biāo)本中三磷酸甘油醛脫氫酶作陽性對照，將SHP-1/GADPH≥定為SHP-1基因表達(dá)陽性，將c-kit/GADPH≥定為c-kit基因表達(dá)陽性。

SHP-1表達(dá)

SHP-1在33例健康人標(biāo)本中全部表達(dá)陽性，SHP-1mRNA表達(dá)水平為(，)。30例初治AML患者SHP-1的陽性率為%，其表達(dá)水平為0(0，)，表達(dá)水平與正常對照組比較差別具有顯著性；4例復(fù)發(fā)AML患者SHP-1全部表達(dá)陰性，與正常對照組比較差別有顯著性，與初治AML組相比表達(dá)水平低，有統(tǒng)計學(xué)意義；18例緩解AML患者表達(dá)陽性率為%，表達(dá)水平為，與初治AML組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。8例ALL患者SHP-1的表達(dá)均為陰性，因例數(shù)較少缺乏分型比較意義。52例AML患者SHP-1的表達(dá)陽性率為%，表達(dá)水平為0；8例ALL患者均無SHP-1的陽性表達(dá)，兩者的表達(dá)水平比較結(jié)果有顯著性差異。Table1.ExpressionofSHP-1inALpatientsandnormalcontrols

c-kit表達(dá)

c-kitmRNA在33例正常人中表達(dá)陽性率為%，表達(dá)水平為0。初治AML組c-kitmRNA的陽性率為%，表達(dá)水平為，與正常對照組比較有顯著性差異。復(fù)發(fā)的4例AML患者中c-kitmRNA表達(dá)陽性者為4例，表達(dá)水平為，與初治AML組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。18例緩解患者c-kitmRNA的陽性表達(dá)率為%和表達(dá)水平為0，與初治AML組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。ALL患者因例數(shù)較少缺乏分型比較意義。在AML中，c-kitmRNA的陽性率為%，其表達(dá)水平為，ALL中的表達(dá)陽性率為%和表達(dá)水平為0，有統(tǒng)計學(xué)差異。Table2.Expressionofc-kitmRNAinALpatientsandnormalcontrolsTable3.ExpressionofSHP-1、c-kitmRNAinAMLandALLpatients

SHP-1、c-kitmRNA表達(dá)與AL相關(guān)性分析

AL患者SHP-1、c-kitmRNA表達(dá)水平的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)兩者的mRNA水平成負(fù)相關(guān)。

初治AL患者SHP-1、c-kit表達(dá)與療效的關(guān)系

根據(jù)電泳的結(jié)果，將30例初治的AML患者分為SHP-1＋/SHP-1-、c-kit＋/c-kit-組。SHP-1＋組緩解率高于SHP-1-組緩解率，χ2檢驗(yàn)差別有顯著性。c-kit＋組的緩解率低于c-kit-的緩解率，χ2檢驗(yàn)差別有顯著性。在5例SHP-1＋c-kit＋雙陽性組的緩解率為40%，SHP-1-c-kit＋組的緩解率為%,兩組之間的緩解率無統(tǒng)計學(xué)差異。Table4.CRrateofSHP-1、c-kitinpositiveandnegativepatientsofAML

討論

SHP-1是一個68kD的胞漿蛋白，在造血細(xì)胞發(fā)育［2］、增殖和受體介導(dǎo)的促有絲分裂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中表達(dá)［3］，在一系列促生長受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用，這些受體包括酪氨酸激酶受體如c-kit、CSF-1、TrkA和EGF受體，細(xì)胞因子受體如IL-3、IFN-α/β和EPO受體以及免疫細(xì)胞受體如CD22和FcγRⅡB［4］。SHP-1對受體酪氨酸激酶的抑制作用是通過直接作用于受體而使其脫磷酸化完成的，而對細(xì)胞因子受體的抑制作用則是通過與受體的非催化亞單位結(jié)合使相關(guān)的Janus家族酪氨酸激酶脫磷酸化實(shí)現(xiàn)的。人類SHP-1基因定位于12p13，白血病細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶能特異地對細(xì)胞內(nèi)磷酸化的酪氨酸殘基去磷酸化，與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)，而增殖分化障礙正是腫瘤細(xì)胞的特征之一［5］。SHP-1與造血細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、增殖以及受體介導(dǎo)的有絲分裂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中主要起負(fù)調(diào)控作用，抑制細(xì)胞增殖，與腫瘤的形成及生長呈負(fù)相關(guān)［6，7］。本研究結(jié)果顯示，正常對照組和緩解組SHP-1表達(dá)陽性率和表達(dá)水平顯著高于初治組和復(fù)發(fā)組，后兩者與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，表明SHP-1的低表達(dá)或不表達(dá)與AL的發(fā)病密切相關(guān)，說明SHP-1作為一個抑癌基因在AL中發(fā)揮著重要作用。Oka等［6］應(yīng)用RT-PCR方法檢測NK/T細(xì)胞淋巴瘤時發(fā)現(xiàn)SHP-1基因的表達(dá)顯著減少，這一結(jié)果強(qiáng)烈提示SHP-1作為一個抑癌基因在白血病、NK/T細(xì)胞淋巴瘤及其他惡性淋巴瘤中發(fā)揮著重要作用。此外，AML患者SHP-1的表達(dá)陽性率和表達(dá)水平高于ALL患者，推測SHP-1在髓細(xì)胞白血病較易于表達(dá)，SHP-1的不表達(dá)與臨床上成人ALL完全緩解率低且復(fù)發(fā)率高有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)ALL例數(shù)較少，需要進(jìn)一步增加例數(shù)證實(shí)。對30例初治AML患者SHP-1mRNA的表達(dá)情況研究發(fā)現(xiàn)，SHP-1表達(dá)陽性者經(jīng)治療后完全緩解率高，與SHP-1陰性表達(dá)者的完全緩解率有統(tǒng)計學(xué)差異。由此初步得出結(jié)論：SHP-1在初治AML中的表達(dá)可能是其預(yù)后良好的指標(biāo)，從而證實(shí)SHP-1作為一個抑癌基因在AML中發(fā)揮著重要作用。c-kit原癌基因是酪氨酸激酶受體家族Ⅲ類的一個重要成員。SHP-1與c-kit間有一定關(guān)系。SHP-1通過它的SH2功能集團(tuán)與c-kit受體結(jié)合，通過直接脫磷酸化而起到對c-kit的負(fù)性調(diào)節(jié)作用［8］，c-kit基因是促使細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子，大量研究表明c-kit是一腫瘤基因。不論是SHP-1基因SH2功能集團(tuán)的突變還是c-kit基因上與SHP-1基因的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，都可導(dǎo)致SHP-1基因?qū)-kit基因的負(fù)性調(diào)節(jié)作用喪失，而表現(xiàn)出c-kit基因促使細(xì)胞有絲分裂增加等腫瘤基因特性。同時，丟失了SHP-1的作用還可增加c-kit的信號而導(dǎo)致細(xì)胞生存期的延長。運(yùn)用非參數(shù)相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)SHP-1與c-kit的mRNA水平成負(fù)相關(guān)，且SHP-1+/c-kit+患者緩解率高于SHP-1-/c-kit+患者，這可能與機(jī)體內(nèi)同時存在SHP-1的不表達(dá)，丟失了SHP-1的負(fù)調(diào)控作用，從而增加了c-kit的信號而導(dǎo)致細(xì)胞生存期的延長有關(guān)。研究證實(shí)了SHP-1可負(fù)性調(diào)節(jié)c-kit基因而抑制腫瘤的發(fā)生，今后將增加試驗(yàn)例數(shù)以進(jìn)一步檢驗(yàn)該結(jié)論。此外，Bene等［9］檢測1937例AML中的表達(dá)率為63%-69%；陳驊等［10］檢測58例AML中的表達(dá)率為%，且提示c-kit在粒細(xì)胞系白血病更易于表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，AML患者c-kitmRNA表達(dá)陽性率和表達(dá)水平顯著高于ALL患者，差別有顯著性，與文獻(xiàn)報道相符。此外，對30例初治AML患者c-kit表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)c-kit表達(dá)陽性者CR率低于陰性者，說明監(jiān)測AML患者c-kit的表達(dá)可作為又一個判斷預(yù)后的獨(dú)立的因素，支持c-kit和SHP-1一樣可作為AL治療轉(zhuǎn)歸的預(yù)測指標(biāo)。

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