利用尿素酶試驗(yàn)測(cè)定結(jié)核分支桿菌耐藥性的方法學(xué)研究

利用尿素酶試驗(yàn)測(cè)定結(jié)核分支桿菌耐藥性的方法學(xué)研究【摘要】目的：利用尿素酶試驗(yàn)的方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。方法：采用液體結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基加尿素和酚紅指示劑，高壓消毒滅菌，將分離純培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌接種其中,再加入不同濃度的抗結(jié)核分枝桿菌的藥物培養(yǎng)，分別設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。待陰、陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果完全清晰時(shí)，終止培養(yǎng)，觀測(cè)結(jié)果。結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌、在500cfu/mL以上時(shí)，結(jié)果在3d～7d內(nèi)顯現(xiàn);在500條以內(nèi)時(shí),其結(jié)果在培養(yǎng)7d～10d內(nèi)顯現(xiàn)；陽(yáng)性菌株中，通過(guò)加溫處死，其尿素酶試驗(yàn)均為陰性；與傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法比較，差異無(wú)顯著性。結(jié)論：尿素酶試驗(yàn)方法快速、簡(jiǎn)便，將對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)提供一種新方法。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分支桿菌；尿素酶；耐藥性

AbstractObjective:Todeterminatedrugresistanceoftuberclebacillusbyemployingureasetest．Methods:TheobservedpurifiedmycobacteriumwereinoculatedintothespecificautoclavedfluidmycobacteriummediumwithureaandPhenolRed,andincubatedwithdifferentconcentrationofanti-tuberclebacillusdrugsuntilthecorrespondingnegativeandpositiveresultsbecameapparent．Results:Theresultsbecameapparentat3to7dayswhenmountoftheincubatedmycobacteriumismorethan500cfu/mL,and7to10dayswhenmountislessthan500cfu/ml.Toavoidthefakepositivesamples,thepositivemycobacteriumswereheating-killedandalltestedasnegativebyureasetest．Comparedwithtraditionalabsoluteconcentrationmethod,ureasetestmethodhadnostatisticdifferences(χ２=，P＞)。Conclusion:Ureasetestingisaconvenientandrapidmethodtoinspectdrugresistanceofmycobacteriumtuberculosis.

KeywordsMycobacteriumtuberculosis；Urease；Drugresistance

尿素酶是一種胞外酶，多數(shù)細(xì)菌含有該酶，可分解尿素，使環(huán)境變堿，所以，常用尿素酶試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。分枝桿菌多數(shù)菌種含有尿素酶，如結(jié)核分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、胃分枝桿菌均為陽(yáng)性。而這些分枝桿菌是臨床結(jié)核病的主要病原體。

尿素酶的存在是結(jié)核菌具有活性的標(biāo)志之一，如果在培養(yǎng)中加入某種藥，控制了該酶的產(chǎn)生，則說(shuō)明某種藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌有殺菌效果。否則尿素酶繼續(xù)產(chǎn)生，利用該機(jī)制我們?cè)O(shè)計(jì)了結(jié)核分枝桿菌耐藥性的尿素酶測(cè)定試驗(yàn)?，F(xiàn)將我們的研究結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

材料

菌種：本室保存的耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株，臨床標(biāo)本常規(guī)處理后，分離培養(yǎng)鑒定結(jié)核分枝桿菌菌株。對(duì)照菌株購(gòu)自中國(guó)生物藥物鑒定所細(xì)菌室。

培養(yǎng)基：絕對(duì)濃度法采用豆浸液改良羅氏培養(yǎng)基［１］；尿素酶法采用含尿素和酚紅指示劑的結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)基。

抗癆藥物：14種抗癆藥物均購(gòu)自上海醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司信宜制藥總廠，其中利福平(RFP)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、利福定(RFD)、利福噴丁(RFPD)、吡嗪酰胺、立刻肺疾、卷曲霉素(CPM)、環(huán)絲氨酸(CS)取得該廠的純品藥物；而卡那霉素(KM)、對(duì)氨柳酸、丁胺卡那、奧復(fù)星、鏈霉素(SM)使用該廠的注射用瓶裝藥，取得了該廠此批藥物的藥物效價(jià)，并嚴(yán)格按照結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程中,抗結(jié)核藥物溶液配制及稀釋的方法進(jìn)行計(jì)量的折算［１］。

方法

含尿素結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基的制備：成分：天門冬酸g,枸櫞酸g,k2HpO4g,MgSO4·7H2Og，%酚紅25mL,枸櫞酸鐵銨g,甘油60mL,蒸餾水1000mL，尿素12g(%)［１］，另外采用固體方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，培養(yǎng)基可選擇改良羅氏培養(yǎng)基。其制備方法略有不同。

制備方法：將上述成分混合于蒸餾水中，加溫溶解，調(diào)pH為，過(guò)濾，分裝三角燒瓶，每瓶裝99mL，℃15min，高壓滅菌，4℃～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

瓊脂絕對(duì)濃度法培養(yǎng)基的制備與藥物的濃度：絕對(duì)濃度法嚴(yán)格根按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)，結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程的方法操作［1］。

試驗(yàn)菌液的配制：將試驗(yàn)菌接種于豆浸液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)20d，待生長(zhǎng)至培養(yǎng)基斜面的1/3以上時(shí)，刮取菌落，粘磨，并用硫酸鋇比濁管比濁，用Teen-80生理鹽水配成5×105/mL～5×106/mL菌懸液，采用10倍遞次稀釋，待用。

藥敏試驗(yàn)的操作方法：將分離培養(yǎng)、鑒定，并稀釋配置成5×103cfu/mL的濃度的結(jié)核分枝桿菌，分別接種在已分裝好的,含有藥物的14管培養(yǎng)基中，每管接種mL，使每管培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度約為500cfu/mL，每種藥物分別作高低兩種濃度的試驗(yàn)，設(shè)空白對(duì)照各1管,尿素酶陽(yáng)性菌株對(duì)照1管，37℃培養(yǎng)7d～10d,以陽(yáng)性菌株的培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色,為終止培養(yǎng)的判定終點(diǎn)。同時(shí)用傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌耐藥測(cè)定法-絕對(duì)濃度法，進(jìn)行接種作為對(duì)照，觀測(cè)其該方法與傳統(tǒng)法在耐藥性檢測(cè)中的相符性或有無(wú)顯著的差異。

結(jié)果判斷：培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色為耐藥，培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色為敏感，培養(yǎng)基呈現(xiàn)淡紅色為中度敏感。

質(zhì)控方式：每次均用結(jié)核分枝桿菌H37RV藥物敏感株作對(duì)照，進(jìn)行質(zhì)量控制。

數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)：采用配對(duì)資料的卡方檢驗(yàn)以及符合率的計(jì)算。

2結(jié)果

兩種方法檢測(cè)臨床鑒定結(jié)核分枝桿菌耐藥性的結(jié)果分析，見(jiàn)表1～表4。表1兩種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)14種抗癆藥物耐藥結(jié)果從表1的結(jié)果分析，尿素酶法檢出耐藥菌株173株，總耐藥率%；傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法檢出耐藥菌株180株，總耐藥率%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，尿素酶檢測(cè)法與傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法，在對(duì)上述結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)中，差別無(wú)顯著性。說(shuō)明尿素酶法在對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)方面具有可靠性，其檢出結(jié)果與傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法具有可比性，兩種方法無(wú)顯著性差異。表2兩種方法檢測(cè)167株結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福定耐藥性結(jié)果的比較表2的結(jié)果分析若以傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法檢測(cè)的結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則尿素酶法檢測(cè)RFD耐藥性符合率為%。表3尿素酶法檢測(cè)50株對(duì)吡嗪酰胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果比較

對(duì)臨床分離鑒定的并用絕對(duì)濃度法測(cè)定的50株耐吡嗪酰胺的結(jié)核分枝桿菌，用尿素酶進(jìn)行了耐吡嗪酰胺的重復(fù)性試驗(yàn)，首次檢測(cè)耐藥菌株數(shù)48株，敏感2株；再次檢測(cè)，敏感菌株為1株，耐藥菌株49株，符合率94%。

武延雋等.利用尿素酶試驗(yàn)測(cè)定結(jié)核分支桿菌耐藥性的方法學(xué)研究表4兩種方法檢測(cè)5種規(guī)定必作藥敏結(jié)果

藥物尿素酶法測(cè)定結(jié)果傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法測(cè)定結(jié)果敏感株耐藥株符合率(%)異煙肼敏感株350耐藥株015100乙胺丁醇敏感株450耐藥株05100鏈霉素敏感株52耐藥株04396對(duì)氨柳酸敏感株355耐藥株01090利福平敏感株350耐藥株51090

用兩種方法檢測(cè)50株臨床分離鑒定的結(jié)核分支桿菌對(duì)5種必作藥物的耐藥性，結(jié)果見(jiàn)表4。檢測(cè)異煙肼藥敏結(jié)果相符50株。不符0株；檢測(cè)乙胺丁醇藥敏結(jié)果相符50株，不符0株；檢測(cè)鏈霉素藥敏結(jié)果相符48株，不符2株；檢測(cè)對(duì)氨柳酸藥敏結(jié)果相符45株，不符5株；檢測(cè)利福平藥敏結(jié)果相符45株，不符5株。

3討論

尿素酶試驗(yàn)是鑒定性試驗(yàn)，應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)，主要是通過(guò)恢復(fù)性試驗(yàn)，觀測(cè)尿素酶檢測(cè)結(jié)果的敏感試驗(yàn)管和耐藥試驗(yàn)管中細(xì)菌的存活情況，本文結(jié)果顯示，在耐藥試驗(yàn)管中的結(jié)核分枝桿菌，在無(wú)藥的豆浸液羅氏培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而敏感試驗(yàn)管中的結(jié)核分枝桿菌在該培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。特異試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，處死菌尿素酶試驗(yàn)均為陰性，而未處死菌均為陽(yáng)性，表明通過(guò)尿素酶方法所檢出的藥敏試驗(yàn)的特異性。

在對(duì)結(jié)核分支桿菌的耐藥性檢測(cè)中，用兩種方法檢測(cè)異煙肼、乙胺丁醇相符率為100%；檢測(cè)鏈霉素相符率為96%；檢測(cè)PAS和利福平相符率90%。尿素酶檢測(cè)法與傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法差別無(wú)顯著性；說(shuō)明尿素酶法與傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法檢出的結(jié)果具有可比性。然而，尿素酶法是利用細(xì)菌生理狀態(tài)的改變，來(lái)確定細(xì)菌對(duì)某種藥物的敏感性的，這種方法比絕對(duì)濃度法時(shí)間短，絕對(duì)濃度法的結(jié)果需要30d的時(shí)間，而尿素酶法最長(zhǎng)時(shí)間10d；尿素酶法在培養(yǎng)基的制備，具體的操作上都比較容易，有利于臨床推廣使用。

應(yīng)當(dāng)指出的是：因有些分枝桿菌的尿素酶均為陰性，如戈氏分枝桿菌，蟾蜍分支桿菌，鳥(niǎo)分枝桿菌以及胞內(nèi)分枝桿菌，尿素酶方法不能用于這些分枝桿菌株的耐藥性的檢測(cè)；該方法的靈敏度與噬菌體生物裂解法有一定的近似性，在500cfu/mL時(shí)以上時(shí)，結(jié)果在3d內(nèi)顯現(xiàn);在500cfu/mL內(nèi)時(shí),其結(jié)果在培養(yǎng)7d～10d內(nèi)顯現(xiàn)，所以當(dāng)標(biāo)本中菌數(shù)較少時(shí)一般不要做直接的尿素酶法的耐藥性測(cè)定，直接對(duì)標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行耐藥性測(cè)定的條件有待進(jìn)一步研究；該試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基的pH值對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果有一定的影響，所以用弱酸弱堿處理過(guò)的試驗(yàn)菌一定要進(jìn)行pH值的調(diào)整，應(yīng)將pH值調(diào)整至，否則影響試驗(yàn)結(jié)果。在試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中不可用天門冬素，有該藥的培養(yǎng)基經(jīng)高壓消毒滅菌后Ｌ-天門冬酰胺可破壞產(chǎn)生胺可使培養(yǎng)基的pH值改變，顯示紅色。

總之，盡管有多種因素可影響該試驗(yàn)的結(jié)果，但因本方法操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，有一定的特異性和敏感性，所以將對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)提供一種新方法。

【參考文獻(xiàn)】

［１］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)．結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程．中國(guó)防癆雜志，1996，18：28．

［２］李舍花，武延雋．豆浸液培養(yǎng)基快速培養(yǎng)結(jié)核分支桿菌的研究．中國(guó)防癆雜志，１998,20：135．

［３］張卓然．臨床微生物學(xué)和微生物檢驗(yàn)．第3版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2003，509～511.

［４］屠得華．耐藥結(jié)核病及防治對(duì)策．中國(guó)防癆雜志，1997,19:140～