協(xié)和腫瘤科中文評(píng)估有126shp1paper peng

RelationbetweenSHP-1mediatedcellcycleredistributionandtheradiosensitivityofnasopharyngealcarcinomacells SHP-1SHP-1敏感性改變的分子機(jī)制。方法：X同時(shí)檢測(cè)親代與子代細(xì)胞系SHP-1/2p16/CDK4/CyclinD1siRNASHP-1表達(dá)，研究SHP-1沉默后鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性和細(xì)胞周期分布的變化，以及SHP-1/p16/CDK4/CyclinD1通路中各因子的蛋白質(zhì)表達(dá)水平改變。結(jié)果：通過(guò)X（子代）CNE-2S1CNE-2S1細(xì)胞SCNE-2，G1，G2-MSHP-1、CDK4CylinD1CNE-2S1調(diào)，p16CNE-2siRNASHP-1CNE2CNE-2S*，SG1增多，SG1CNE-2p16CNE-2S*CDK4CylinD1CNE-2S*細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下調(diào)。結(jié)論：SHP-1/p16/CDK4/CyclinD1SHP-1CNE2p16/CDK4/CyclinD1G1/SG1S部復(fù)發(fā)。近年來(lái),由于功能影像學(xué)的發(fā)展和放射治療技術(shù)的改進(jìn),如調(diào)強(qiáng)放療(intensity-modulatedradiationtherapy,IMRT)、圖像引導(dǎo)的調(diào)強(qiáng)放療(image-guidedradiationtherapy,IGRT)等取得了巨大的進(jìn)展，晚期鼻咽癌、的差異受細(xì)胞耗氧水平、輻射致DNA損傷后的修復(fù)能力細(xì)胞數(shù)量、凋亡以、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶SHP-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平的關(guān)鍵性調(diào)控因子,聚化，與受體耦聯(lián)的JAK激酶通過(guò)相互的酪氨酸磷酸化而相互激活，同時(shí)SHP-1SH2結(jié)構(gòu)域直接與受體上磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合而被激活，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制細(xì)胞增殖[6-11]SHP-2SHP-1具有相似的明SHP-1和SHP-2同細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)[10,11,13]。SHP-1/p16/CDK4/CyclinD1主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)液和G418購(gòu)自Gibco公司；新生胎牛購(gòu)自杭州四季青公司；胰蛋白酶粉劑、碘化丙錠（PI、RNA酶購(gòu)自Sigma公司；Lipofectamine2000TrizolMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)marker購(gòu)自Fermentas公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)；蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；兔抗人SHP-1、p16、CDK4以及CylinD1單克隆抗體購(gòu)自CellSignalTechnology公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG購(gòu)自中杉金橋公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司。瘤中心保存。采用含10％胎牛的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。鼻咽癌細(xì)胞放射抗拒亞系的建立PrimusH6MVX10cm×10cm，SSD100cm，吸收劑量 E-2S2，在不照射的情況下連續(xù)傳代3個(gè)月，觀察其放射敏感性pGCsi-RNAisiRNA靶序列的設(shè)計(jì)：在NCBI上找到SHP-1以及SHP-2的轉(zhuǎn)錄本NM_080549.3以及NM_002831.5，并應(yīng)用下列國(guó)際通用設(shè)計(jì)軟件 lib/misc/siRNAfinder.html)根據(jù)靶位點(diǎn)選擇的一般原則進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選。篩選出的序列見(jiàn)表1、2，并設(shè)置對(duì)照表 針對(duì)SHP-1設(shè)計(jì)的siRNA序質(zhì) siRNA序 起始位 5’-

表 針對(duì)SHP-2設(shè)計(jì)的siRNA序質(zhì) siRNA序 起始位 5’-

篩選最有效的干擾質(zhì)粒：將pGCsi-RNA1、2、3、4、5、6及質(zhì)粒瞬時(shí)PCR條帶及蛋白條帶的樣本順序均為pGCsi-RNA1pGCsi-增靶SHP-1/2的PCR引物見(jiàn)表3。擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外表 SHP-1/2的PCR引物序靶引SHP- 5'-CTTCTGCCTGGTCTTCTCCT-3'(reverse 5'-TCCAGGACTGCAATGCTTAC-3'(forwardprimer)Westernblot：用細(xì)胞裂解液提取上述各組細(xì)胞總蛋白，BCA5×SDSSDSPVDF，4SHP-1育過(guò)夜，次日二抗孵育，后加ECL顯色劑，發(fā)光顯色，X光膠片成像。CNE-248hRT-PCR和Westernblot檢測(cè)結(jié)果篩選出最有效的干擾質(zhì)粒，將此質(zhì)粒與質(zhì)粒CNE-2，24h1：10600g/mLG41814RT-PCRWesternblot下一步實(shí)驗(yàn)及保種；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞持續(xù)加壓培養(yǎng)，G418300g/m2siRNACNE-2S#。，6MV200cGy153000cGy。然后對(duì)存活細(xì)3×PE3t檢驗(yàn)；P<0.05和E-2S2克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞、1X其呈指數(shù)性殺滅。各種細(xì)胞放射敏感性參數(shù)、E-2S1細(xì)胞圖1多靶單擊模型擬合的 E-2S1以及CNE-2S2細(xì)胞的存活曲線比4CNE-2CNE-2S1CNE-2S2NCNE-2細(xì)胞放射敏感性變化CNE-2細(xì)胞及CNE-2S細(xì)胞培2D0、Dq及N3，結(jié)果提示CNE-2S1細(xì)胞與CNE-23個(gè)月后，仍保持放射抗性（525CNE-2CNE-2S1CNE-2S2N 圖3，CNE-2細(xì)胞的細(xì)胞周期中G1期S期和G2-M期細(xì)胞分別占83.21%±3.75%、10.00%±1.19%和6.79%±0.81%，CNE-2S1細(xì)胞分別為G1期63.73%±2.78%、43圖 E-2S1和CNE-2S2細(xì)胞系S期細(xì)胞數(shù)與G1期細(xì)胞數(shù)的比 從圖5中我們可以看出，S、以及在E-2S1細(xì)胞中的表達(dá) 圖 Westernblot檢 E-2S1和CNE-2S2細(xì)胞系各蛋白水 RT-PCRCNE-2SHP-1/2mRNA水平的表達(dá)將pGCsi-RNA1、2、3、4、5、6及質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞，48小后提取RNART-PCR法從mRNA水平比較六種質(zhì)粒分別對(duì)SHP-1以及SHP2PCR條帶的樣本順序?yàn)閜GCsi-RNA1pGCsi-RNA2pGCsi-RNA3、果示：與對(duì)照組相比，pGCsi-RNA1~3mRNASHP-1表達(dá)有不度的下調(diào)，其中以pGCsi-RNA1以及pGCsi-RNA66。6RT-PCR檢測(cè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞后SHP-1/2在mRNA將pGCsi-RNA1、2、3、4、5、6及質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞，48小時(shí)WesternblotSHP-1以及SHP2的干擾效率。蛋白條帶的樣本順序?yàn)閜GCsi-RNA1、pGCsi-RNA2、pGCsi-RNA3、pGCsi-RNA4、pGCsi-RNA5、pGCsi-RNA6、空白對(duì)照組以及pGCsi-圖 Westernblot檢測(cè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞后SHP-1/2在蛋白水平的表8X圖 6CNE-2*CNE-2#CNE-2CNE-2*CNE-2#N 在CNE-2S*細(xì)胞中的表達(dá)水平上調(diào)，以及在E-2S*細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下調(diào)，后兩者與原代CNE-2蛋蛋0圖9Westernblot檢測(cè)不同細(xì)胞SHP-1/2、p16、CDK4、CyclinD1 從流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞周期結(jié)果可見(jiàn)E-細(xì)胞在細(xì)胞周期時(shí)相中1期S期和2-期分別占78.62%±2.4%13.43±2.08%和8.8%± 。 E-2*的細(xì)胞周期特征為1期85.34%±1.65%，S期6.54%±0.67%，-M期8.18%±1.97%，其期細(xì)胞數(shù)與期細(xì)胞數(shù)之比例與E-2（p<0.0512.95%±0.87%和7.43%±1.01%，并且期細(xì)胞數(shù)與期細(xì)胞數(shù)之比例與E-210圖 通路密切相關(guān)[14-18]（proteintyrosinekinase，PTK）以及蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase，PTP）分別發(fā)良性或惡變的演進(jìn)。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶SHP-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)磷酸化水JAKs或其他酪氨酸激酶(Src、c-fms等)的酪氨酸去磷酸化，使這些激酶的活亞群和高放射敏感亞群，這兩種細(xì)胞亞群間存在著內(nèi)在放射敏感性（intrinsicradiosensitivity）DNAG1G2期阻滯現(xiàn)象。而阻滯時(shí)間長(zhǎng)短又與細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性相關(guān)，其CNE-2S1。首先本研究以兩種最佳照射劑量及分割方式尚無(wú)定論。有[31]3～5，6Gy/方式可以迅速篩選篩選出放射抗拒的細(xì)胞亞系。故而，本研究有采用這種6Gy/照組采用常規(guī)分割，即針對(duì)CNE-2細(xì)胞給予2Gy/次，共計(jì)15次照射，總劑量為 而CNE-2S2細(xì)胞則放射敏感性略增強(qiáng)。在聯(lián)系，這與既往大部分研究結(jié)果一致。同時(shí)我們初步觀察到SHP-1、CDK4SHP-1p16-CyclinD1-CDK4方面發(fā)揮了一定作用。而在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)對(duì)SHP-1SHP-1p16-CyclinD1-CDK4近期文獻(xiàn)表明SHP-1與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān)[32-34]Cyclin入S期。p16作為一種抑癌，通過(guò)與CyclinD1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4抑制Rb,前尚未見(jiàn)SHP1和p16/CyclinD1/CDK4通路與鼻咽癌的相關(guān)。胞明顯增多期細(xì)胞數(shù)與期細(xì)胞數(shù)之比例與E-2p16在CNE-2S*細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而以及在E-2S*細(xì)胞中的p16-CDK4-CyclinD1通路，延緩?fù)ㄟ^(guò)G1/S檢查點(diǎn)，即細(xì)胞難以順利由G1期轉(zhuǎn)化為S期，從而增加了放射敏感性。這與近期西班牙研究[35列細(xì)胞株中，敲除SHP-1可以促進(jìn)G1/S阻滯的結(jié)果類似 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