DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響及機(jī)制探討

聲敏劑血卟啉對(duì)COC1/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響及機(jī)制探討聲敏劑血卟啉對(duì)COC1/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響及機(jī)制探討

：周曉莉,唐良萏,王燕,彭麗欽

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聲敏劑血卟啉對(duì)COC1/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響及機(jī)制探討

接滅活耐藥卵巢癌細(xì)胞是醫(yī)學(xué)工亟待解決的關(guān)鍵問題,更是腫瘤康復(fù)中提高女性生產(chǎn)率和改善女性生活質(zhì)量的迫切需要。聲動(dòng)力療法（SDT）是一種很有應(yīng)用前景的治療腫瘤的方法。大量討論表明,超聲加血卟啉(hematoporphyrin,Hp)比單獨(dú)超聲對(duì)腫瘤細(xì)胞更具有殺傷效果,血卟啉則無(wú)抗腫瘤效應(yīng)［1,2］。有報(bào)道說這種殺傷作用機(jī)制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。在本試驗(yàn)中,把超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用于人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞,觀看其殺傷的作用,以期降低卵巢癌對(duì)順鉑化療的耐藥。

1材料、儀器與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器超聲增敏劑血卟啉購(gòu)自Sigma公司,注射用順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字H37021358）,四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、姆薩色素為Sigma公司。血卟啉和MTT均以生理鹽水配成5mg/ml的溶液,過濾除菌后4℃避光保存。超聲裝置為陜西師范高校聲學(xué)討論所研制,探頭面積為4.7cm2.1.1.2細(xì)胞系及培育腫瘤細(xì)胞株為人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株COC1/DDP（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)討論所）。COC1/DDP在含有0.5μg/ml順鉑的完全培育基（50μg/ml青霉素,50μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培育基）37℃,5%CO2常規(guī)細(xì)胞培育、傳代。試驗(yàn)前1周換用不含順鉑的完全培育基培育。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測(cè)各試驗(yàn)組對(duì)COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響把細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔0.2×104個(gè)接種于96孔板中,每孔200μl完全培育基。12h后進(jìn)行試驗(yàn)干預(yù),按以下分組進(jìn)行試驗(yàn)干預(yù),A組(對(duì)比組):單純培育COC1/DDP細(xì)胞;B組(單純順鉑組):在細(xì)胞中加入順鉑,順鉑選0.625、1.25、2.5、5μg／ml4個(gè)濃度;C組(血卟啉+超聲組):血卟啉選0.0125、0.025、0.05、0.1mg/ml4個(gè)濃度,同時(shí)進(jìn)行超聲照耀60s;D組(順鉑+血卟啉+超聲組):細(xì)胞液中加入順鉑和血卟啉,使其終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5μg／ml和0.0125、0.025、0.05、0.1mg/ml,同時(shí)進(jìn)行超聲照耀60s.每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,此時(shí)記為0d;于37℃、5%CO2的飽和濕度箱中連續(xù)培育和觀看,于3d后取出96孔板,1200r/min離心10min.去上清,加入180μl完全培育基和20μlMTT,37℃連續(xù)培育4h,離心后當(dāng)心吸棄上清。再加入150μlDMSO,振蕩10min,充分溶解。選擇490nm,在酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光率。試驗(yàn)重復(fù)3次。按下列公式求出增殖抑制率:腫瘤細(xì)胞增殖抑制率=［1(藥物處理組OD值空白對(duì)比組OD值)／(細(xì)胞對(duì)比組OD值空白對(duì)比組OD值)］×100％.

1.2.2PI/Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)消化傳代,以每孔0.3×104個(gè)接種于96孔板中,每孔200μl完全培育基。12h后進(jìn)行試驗(yàn)干預(yù),分組同前,72h后,每孔依次加入細(xì)胞染色緩沖液100μl、Hoechst染色液0.5μl、PI染色液0.5μl冰浴30min,PBS洗滌1次,再在熒光顯微鏡下觀看。計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞比例。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)干預(yù)后COC1/DDP細(xì)胞內(nèi)bcl2和bax表達(dá)的變化選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COC1/DDP細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,按2×104/ml接種于24孔培育板,連續(xù)培育12h后按前述方法進(jìn)行分組處理。各組細(xì)胞經(jīng)試驗(yàn)處理后置于37℃,5%CO2孵箱中連續(xù)培育8h,收集細(xì)胞,涂布細(xì)胞于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上,室溫風(fēng)干,純丙酮室溫固定30min.按免疫組化試劑盒使用說明書分別進(jìn)行:純甲醇加過氧化氫至0.5%,室溫30min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗滌后，滴加

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免抗bcl2(或bax)基因抗原的抗體,置濕盒中37℃,20min,0.01NPBS洗2min×3次后，滴加生物素化羊抗兔IgG,置濕盒中37℃,20min.0.01NPBS洗2min×3次后滴加SABC37℃,20min,0.01NPBS洗5min×4次后，DAB顯色10min,蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透亮?????、封片。光學(xué)顯微鏡下觀看細(xì)胞漿著色呈棕黃色的為陽(yáng)性細(xì)胞,每張片隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野,每樣品取5張片的平均值為陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所獲試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采納SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。預(yù)先用HomogeneityofVariances進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),如方差齊采納LSD檢驗(yàn),如方差不齊采納TamhaaeT2檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)各試驗(yàn)組對(duì)COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響

順鉑、血卟啉、順鉑和血卟啉聯(lián)用對(duì)COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響（見表1、2）,兩種方法聯(lián)用的增殖抑制率隨著各自濃度的增加而增加,各組與對(duì)比組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。表1順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的細(xì)胞增殖MTT試驗(yàn)OD值表2順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的增殖抑制率

2.2順鉑和血卟啉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)COC1/DDP細(xì)胞凋亡的影響

順鉑組和血卟啉組的凋亡率高于空白對(duì)比組,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);血卟啉＋順鉑組與血卟啉組和順鉑組相比,其凋亡率高于血卟啉組和順鉑組,其差異均有顯著性(P0.05)。提示血卟啉和順鉑都對(duì)COC1/DDP細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用,而且血卟啉和

順鉑聯(lián)用能夠加強(qiáng)這種促進(jìn)作用(見表3、圖1)。表3順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的凋亡率

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)干預(yù)后COC1/DDP細(xì)胞內(nèi)bcl2和bax表達(dá)的變化

bcl2免疫組化染色光學(xué)顯微鏡下觀看到空白對(duì)比組和順鉑組中可見很多細(xì)胞內(nèi)胞漿呈棕黃色,高倍鏡下可見胞漿內(nèi)有大量棕黃色顆粒,而血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組此種細(xì)胞明顯削減。Bax蛋白的免疫組化染色可見在血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組中有較多的胞漿呈棕黃色顆粒的細(xì)胞,而對(duì)比組和順鉑中的此種細(xì)胞較少,bcl2蛋白及bax表達(dá)陽(yáng)性率（見表4）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明:血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組的bcl2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低(P0.05),而空白對(duì)比組和順鉑組的細(xì)胞內(nèi)bcl2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)顯著性(P0.05)。bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在各組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(見表4、圖2)。表4順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的bcl2蛋白及bax表達(dá)陽(yáng)性率

3爭(zhēng)論

聲動(dòng)力療法（SDT）是指對(duì)腫瘤患者靜脈注射聲敏劑,而后用肯定頻率和強(qiáng)度超聲輻射腫瘤部位,使聚集在腫瘤部位聲敏劑產(chǎn)生抗腫瘤因子而殺傷腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤的生長(zhǎng)。有學(xué)者認(rèn)為由于超聲發(fā)生空化作用,其結(jié)果是來(lái)源于聲敏劑的自由基,再與氧分子反應(yīng)生成過氧基和烷氧基,過氧基和烷氧基與溶液中的有機(jī)分子反應(yīng)活性低,更易于到達(dá)靶細(xì)胞的表面,破壞癌細(xì)胞的脂質(zhì)和細(xì)胞膜,導(dǎo)致膜通透性增加而損傷細(xì)胞,此外,過氧基和烷氧基還可以導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性,染色體變異等破壞細(xì)胞。目前認(rèn)為較好的聲敏劑仍是卟啉類為主［4］,因此本試驗(yàn)選擇血卟啉做聲敏劑能對(duì)超聲有良好的敏感性,產(chǎn)生大量活性氧對(duì)細(xì)胞進(jìn)行殺傷作用。

本試驗(yàn)發(fā)覺,CO

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C1／DDP細(xì)胞對(duì)順鉑明顯耐藥,血清峰值濃度(2.5g／ml)以下的順鉑對(duì)COC1／DDP細(xì)胞增殖未見明顯影響,這與文獻(xiàn)報(bào)道基本全都［5］。但與血卟啉合用時(shí),血清峰值濃度以下的順鉑明顯抑制了COC1／DDP細(xì)胞增殖。提示超聲激活的血卟啉能夠提高耐藥的卵巢癌細(xì)胞COC1／DDP對(duì)順鉑的敏感性,從而增加順鉑對(duì)該細(xì)胞的殺傷作用。干擾細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡是順鉑治療腫瘤的重要途徑,而血清峰值濃度的順鉑對(duì)COC1／DDP的凋亡率幾乎無(wú)影響,但與血卟啉合用時(shí),可致細(xì)胞凋亡率明顯上升，這提示超聲激活的血卟啉提高耐藥細(xì)胞株COC1／DDP對(duì)順鉑敏感性的機(jī)制可能是恢復(fù)了耐藥細(xì)胞株的凋亡途徑,從而恢復(fù)了順鉑治療腫瘤的作用。

細(xì)胞凋亡是在基因掌握下的細(xì)胞自身消亡過程,涉及一系列的基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),受凋亡抑制基因（bc12/bax）和凋亡促進(jìn)基因的調(diào)控。順鉑可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但耐藥卵巢癌細(xì)胞中bc12/bax明顯增高,這是導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的重要緣由之一。因此,抗腫瘤治療中,有效地降低bc12/bax含量是取得療效的關(guān)鍵之一。

已有討論發(fā)覺,提高細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,細(xì)胞凋亡的發(fā)生率明顯增加,認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的ROS作為一種信使分子在調(diào)控細(xì)胞生存及凋亡過程中起關(guān)鍵作用［6,7］。1988年,Vaux等［8］首先證明bcl2基因高表達(dá)可明顯延長(zhǎng)細(xì)胞的生存周期。體外討論亦表明bcl2可阻擋很多刺激物誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,且bcl2的抑制可能是細(xì)胞凋亡的共同通道［9］。bax是bcl2家族的另一成員,與bcI2形成異二聚體,也對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控［10］。在體內(nèi),bcl2與bax相互影響,相互拮抗,其作用并不直接表現(xiàn)為單獨(dú)的bcl2和bax對(duì)凋亡的影響,而是由bcl2／bax來(lái)打算細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。討論顯示，bc12／bax比值降低,可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,作為細(xì)胞調(diào)亡調(diào)控的主要因子bcl2蛋白家族,尤其是bcl2和bax的相互作用在調(diào)亡的調(diào)整中起關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)的bcl2蛋白及bax蛋白免疫細(xì)化染色結(jié)果顯示，超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP，bcl2蛋白水平顯著低于對(duì)比組(P0.05);而順鉑組和對(duì)比組比較,bcl2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用可以降低人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP的bcl2蛋白的表達(dá)水平,bax蛋白表達(dá)水平在試驗(yàn)組及對(duì)比組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示聲動(dòng)力作用是通過下凋bcl2蛋白的水平,使bcl2／bax的比值下降來(lái)促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP發(fā)生凋亡。

聲動(dòng)力療法（SDT）是繼手術(shù)、放療、化療后新興的一種腫瘤治療手段,具有無(wú)創(chuàng)、細(xì)胞毒性低、選擇性殺傷等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)僅初步討論了超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑對(duì)耐藥的卵巢癌細(xì)胞的作用,還需要進(jìn)一步增加超聲的劑量,將血卟啉的濃度范圍擴(kuò)大,找出三者協(xié)同作用的最佳比例,為以后應(yīng)用于臨床供應(yīng)理論基礎(chǔ)。

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