蘆丁的提取分離和鑒定

綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)：蘆丁的提取分離和鑒定蘆丁簡(jiǎn)介：蘆丁（Rutin）又名蕓香昔化學(xué)式：C27H3o016-3H20,是一種淺黃色針狀結(jié)晶有機(jī)化合物，廣泛存在于自然界植物中，是一種被人們廣泛使用的有機(jī)天然產(chǎn)物。目前已發(fā)現(xiàn)含有蘆丁的植物至少在70種以上，常見的如煙葉、槐花、養(yǎng)麥和蒲公英中均有不同含量。尤其以中藥槐米（豆科、槐屬，槐樹Sophorajaponica的花蕾）和養(yǎng)麥中含量最高，因此槐米可作為大量提取蘆丁的天然植物原料。中藥槐米（炒碳）味苦性涼、具清熱涼血、止血之功。常用于治療多種出血癥:腸風(fēng)便血、痔血、尿血、蛆血、崩漏下血、赤血下痢等。西醫(yī)研究其主要有效成分為有機(jī)化合物“蘆丁”而中藥槐米中蘆丁的含量可高達(dá)12-16%,是主要的蘆丁天然來源。槐米中還含有懈皮素、三糖皂昔、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文獻(xiàn)證明蘆丁具有VitP（維生素P）樣作用（VitP具有生物類黃酮的功能，可防止維生素C被氧化而受到破壞，增強(qiáng)維生素功效；增加毛細(xì)血管壁強(qiáng)度，防止瘀傷。有助于牙齦出血的預(yù)防和治療，有助于因內(nèi)耳疾病引起的浮腫或頭暈的治療等）。而蘆丁具有類似作用如可降低毛細(xì)血管脆性和調(diào)節(jié)通透性等，在醫(yī)學(xué)臨床上常將其用作毛細(xì)血管脆性引起的出血癥以及防治高血壓病等的輔助治療藥物。蘆丁是由棚皮素（quercetin）3位上的羥基與蕓香糖（rutinose,一種由葡萄糖glucose與鼠李糖rhamnose組成的雙糖）脫水合成的首，是一種淺黃色粉末或極細(xì)的針狀結(jié)晶，含有三分子的結(jié)晶水，熔點(diǎn)為174~178°C,無結(jié)晶水時(shí)188~190°C。溶解度：冷水中為1:10000；熱水中1:200；冷乙醇1:650；熱乙醇1:60；冷毗嚏1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醍、氯仿、石油酰，溶于堿而呈黃色。補(bǔ)充知識(shí)：關(guān)于昔（gan）和g^（dai）:昔類（glycosides,舊稱貳）又稱配糖體，是糖或糖的衍生物的半縮醛羥基與另一類非糖物質(zhì)中的羥基以縮醛鍵（式鍵）脫水縮合而成的環(huán)狀縮醛衍生物，水解后能生成糖與非糖化合物。目前國際上通用“首”如“皂昔”，而過去習(xí)慣使用的中文名稱“忒"目前已不再使用如“皂式"現(xiàn)統(tǒng)稱“皂甘”。—、目的要求：1、 通過蘆丁的提取與精制掌握堿酸法提取黃酮類化合物的原理及操作。2、 掌握化學(xué)鑒別試驗(yàn)、昔水解、衍生物制備、熔點(diǎn)和薄層層析檢測(cè)等手段在首類結(jié)構(gòu)鑒定上的作用。3、 通過UV、IR、HNMR和MS圖譜解析，了解光譜方法黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定中的作用。二、已知重要成分性質(zhì):蘆丁（rutin）：分子式C27H30O16-3H2O,為淺黃色針狀結(jié)晶物，mpl74?178°C（含三分子水）；lOOnmiHg和110°C加熱12小時(shí)后，變?yōu)闊o水物，115?117°C軟化，214?215°C發(fā)泡分解。難溶于乙醍、三氯甲烷、石油酰、乙酸乙酯、丙酮、二硫化碳、苯等，易溶于毗嚏，甲酰胺特別是堿液。通常常用的溶劑下其溶解情況為：較難溶于冷水（1：8000?10000）,冷乙醇（1：650）；可溶于熱水（1：180?200）以及冷甲醇（1：100）；較易溶于熱乙醇（1：60）和熱甲醇（1：10）o棚皮素（quercetin）為蘆丁的昔元其分子式為：C15H10O7?2H2O,黃色結(jié)晶,mp313-314°C（2分子結(jié)晶水），316°C（無水物）。能溶于冷乙醇（1：290）,易溶于沸乙醇（1：23）,可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、毗嚏、丙酮等；難溶于水、苯、石油醍等溶劑。一般在堿水中溶解顯黃色。

OHHOR=——glu—rhaOHHOOHOR=—OHOHO皂昔(saponin)―般為白色粉末，mp210°C?220°C。易溶于毗嚏。能溶于甲醇(1：200),可酸水解得下列兩種昔元及糖。糖為葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄醛酸內(nèi)酯。白樺酯醇(betulin)無色針晶，mp215~220°C,能溶于醋酸，丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯等；難溶于石油醍和水。CH、OH槐花二醇(sophoiadiol)無色針晶，mp219~224°C,溶于石油醍、苯、丙酮、甲醇、難溶于水。CH、OHH0H00H+鼠李糖+葡萄糖0H0裾皮素H0OHOHH0H00H+鼠李糖+葡萄糖0H0裾皮素H0OHOH° |0HOHOH0oo-ch2蘆丁屬于黃酮昔，分子中具有酚羥基，顯酸性，因此可溶于稀堿液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性質(zhì)進(jìn)行提取分離。利用蘆丁易溶熱水、熱乙醇，較難溶于冷水、冷乙醇的性質(zhì)選擇重結(jié)晶方法進(jìn)行精制。蘆丁可被稀酸水解生成搠皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此進(jìn)行制備搠皮素。通過紙色譜及紫外光譜等可進(jìn)行黃酮及糖的鑒定。蘆丁酸性條件下水解的過程見下反應(yīng)方程式：

三，提取分離和純化槐花米粗粉25g禎提取在soonn燒杯中加入水250mi,硼砂三，提取分離和純化槐花米粗粉25g禎提取在soonn燒杯中加入水250mi,硼砂igf注1JS加熱至沸騰時(shí)』投入槐花米,繼續(xù)直火煮沸b盼鐘』在攪拌下小心加入石灰乳「調(diào)至85現(xiàn)注2H呆持微沸蹄鐘，趁熱用尼龍布擠過濾°濾渣凝feWXE在fiD~7lTE下用濃鹽酸調(diào)pH至4注3卜靜置創(chuàng)、時(shí)以上祈出沉淀。抽濾，用蒸'溜水洗沉淀久至中性。濾液（棄去）沉淀（蘆丁粗品）粗稱重后按蘆丁在熱水中1：2TO的溶解度加蒸僧水進(jìn)行重結(jié)晶。將沉'淀懸浮于蒸僭水中,加熱煮涕1盼鐘，趁熱過濾。濾渣（棄去）濾滿充分靜置'過濾』60-70七干燥'稱重,蘆?。ň破罚┳?:硼砂因能與蘆丁結(jié)合，起保護(hù)鄰二酚羥基，不被氧化破壞的作用，實(shí)驗(yàn)證明，提取時(shí)加入硼砂，產(chǎn)品質(zhì)量要好些。注2：加石灰乳既能達(dá)到堿溶解提取蘆丁的目的，還可以除去槐花米中大量的粘液質(zhì)和酸性樹脂（形成鈣鹽沉淀），但pH不能過高和長時(shí)間煮沸，因?yàn)闀?huì)導(dǎo)致蘆丁的降解。注3：pH過低會(huì)使蘆丁形成鋅鹽而降低收率。!1!,!1!,蘆丁的鑒定定性反應(yīng)鑒別見附錄。（一）蘆丁的酸水解

稱取精品蘆丁2g置稱取精品蘆丁2g置500ml燒瓶中加2%的H2SO4200ml加熱回流1小時(shí)靜置，抽濾放冷,酸性濾液中和中性濾液冷水洗兩次，干燥用95%乙醇25ml重結(jié)晶,結(jié)晶時(shí)可加入冷水201111,最后稱重，計(jì)算收率。濃縮u 黃色細(xì)針狀結(jié)晶濃縮液 （棚皮素）（供糖的鑒定）（二）糖的鑒定（紙色譜法）紙層析鑒定：采用中速層析濾紙（裁剪尺寸：5X20cm）取水解母液20ml,于水浴上加熱，同時(shí)于攪拌下加BaCO3細(xì)粉中和至中性，過濾去多余BaCCh后,濾液濃縮至2-3ml，得樣品液供紙色譜點(diǎn)樣用。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：以葡萄糖和鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照（1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品醇溶液及1%鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品醇溶液）。展開劑：正丁酵■醋酸■水（BAW）（4：1：5）上層，懸掛并利用上層展開劑紙色譜分離。顯色劑：苯胺以及鄰苯二甲酸混合試液，噴后105°C烘10分鐘。顯棕紅色斑點(diǎn)。注意事項(xiàng)：紙層析展開時(shí)可事先用鉛筆在裁剪好的層析紙上畫出展開起點(diǎn)（即點(diǎn)樣的位置）和預(yù)制終點(diǎn)（即展開完畢后展開液的前沿），這樣方便進(jìn)行測(cè)量計(jì)算比移值。另外由于糖液一般無色，因此點(diǎn)樣位置也可事先用鉛筆點(diǎn)出標(biāo)記，注意如果糖液濃度過低（實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡量將糖液蒸發(fā)濃縮至3亳升以內(nèi)）則應(yīng)多次點(diǎn)樣以達(dá)到濃集的目的，否則展開后的點(diǎn)不夠明顯。點(diǎn)樣時(shí)也需要注意點(diǎn)樣液斑不易擴(kuò)散太大，應(yīng)控制液斑直徑在3nun以內(nèi)，同時(shí)各點(diǎn)樣點(diǎn)之間應(yīng)盡量保持距離不可過于靠近，否則展開后可能得到較大的樣班，而且不同樣斑之間可能重合相互干擾而不易測(cè)量比移值。下圖給出正確的紙層析法標(biāo)示。

展開劑下層（三）蘆丁和梅皮素的薄層層析鑒定吸附劑：硅膠G（400目）以0.4%竣甲基纖維素鈉（CMC-Na）水液作為粘合劑制薄層層析板，板片自然陰干后于烘箱中100°C活化1小時(shí)。展開劑：（1）CHCh-MeOH-HCOOH（15：5：1）（2）CHCb-丁酮-HCOOH（5：3：1）顯色劑:1%的FeCh和1%的K3[Fe（CN）6]水溶液，使用時(shí)等體積混和。注意：薄層層析點(diǎn)樣注意事項(xiàng)依照紙層析實(shí)驗(yàn)說明及注意事項(xiàng)用石灰水調(diào)節(jié)蘆丁提取溶液的pH,既可以達(dá)到堿提取蘆丁的目的，還可以除去槐米中含有的大量粘液質(zhì)。但鈣離子濃度及pH值均不宜過高，否則多余的鈣能與蘆丁形成螯合物沉淀，同時(shí)黃酮結(jié)構(gòu)在強(qiáng)堿性條件下易被破壞。調(diào)PH時(shí)，應(yīng)注意PH不要過低，因?yàn)镻H過低（pH2以下）會(huì)使蘆丁形成牛羊鹽而使己形成的沉淀重新溶解，同時(shí)黃酮母核也會(huì)在強(qiáng)堿性條件下被破壞，導(dǎo)致收率下降。注意觀察棚皮素制備過程中的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。思考題昔類結(jié)構(gòu)檢識(shí)的一般程序？昔類水解的催化方法？怎樣確定蘆丁結(jié)構(gòu)中糖基是否聯(lián)結(jié)在棚皮素3-0位上？怎樣證明蘆丁分子中只含有一個(gè)葡萄糖及一個(gè)鼠李糖？UV在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用。附錄：蘆丁的定性檢測(cè)蘆丁的定性反應(yīng)取蘆丁適量，加乙醇使溶解，分成三份供下述試驗(yàn)用：鹽酸鎂粉試驗(yàn)：取樣品液適量，加2滴濃HC1、再酌加少許鎂粉，即產(chǎn)生劇烈的反應(yīng)，并逐漸出現(xiàn)紅色至深紅色。錯(cuò)?枸試驗(yàn)：取樣品液適量，然后加2%ZrOCl2的甲醇溶液，注意觀察顏色變化，再加入2%枸椽酸的甲醇溶液，并詳細(xì)記錄顏色變化。。.荼酚.濃硫酸反應(yīng)：取樣品液適量，加等體積的10%。.荼酚乙醇溶液，搖勻，沿管壁緩加濃硫酸，注意觀察兩液界面的顏色。蘆丁的UV鑒定試劑的配制甲醇鈉溶液：取0.25g金屬鈉，切碎，小心加入色譜甲醇10ml中，此液置于玻璃瓶中，用橡皮塞密封。三氯化鋁溶液：取lg無水三氯化鋁，小心加入色譜甲醇20nil中，放置24小時(shí)后全部溶解即得。醋酸鈉：用無水粉末醋酸鈉。④⑤硼酸飽和溶液：取無水硼酸，加入適量色譜甲醇、制成飽和溶液。(上述貯備液可放置六個(gè)月)蘆丁溶液的配制精密稱取蘆丁純品0.5g,用甲醇適量溶解至50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。光譜的測(cè)定甲醇光譜：取樣品液置石英杯中，至200?500nm內(nèi)進(jìn)行掃描，重復(fù)一次，觀察紫外光譜。甲醇鈉光譜:取樣品液置石英杯中，加入甲醇鈉溶液3滴后,立即測(cè)定，放置5分鐘后再測(cè)一次。三氯化鋁光譜，在盛有樣品液的石英杯中，加入三氯化鋁6滴，放置1分鐘后進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定后加入3滴鹽酸溶液（鹽酸：水=1：1）再進(jìn)行測(cè)定。醋酸鈉光譜:取樣品液約3ml,加入過量的無水醋酸鈉固體,搖勻（杯底剩有約2mg的醋酸鈉），加入醋酸鈉后兩分鐘內(nèi)測(cè)定，5分鐘到10分鐘后再測(cè)定一次。蘆丁及懈皮素的色譜支持劑：中速層析濾紙（5x20cm）展開劑：正丁醇?醋酸■水（4：1：5）上層樣品：自制挪皮素的乙醇溶液自制蘆丁的乙醇溶液對(duì)照品：搠皮素標(biāo)準(zhǔn)品的乙醇溶液蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的乙醇溶液顯色劑：三氯化鋁乙醇溶液噴霧預(yù)習(xí)報(bào)告及實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式和要求:預(yù)習(xí)報(bào)告：1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 實(shí)驗(yàn)原理3、 實(shí)驗(yàn)步驟：（1） 要求將實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分拆，并畫出流程圖（2） 要求寫明各試劑的用途和各步驟的目的和實(shí)驗(yàn)原理4、 回答指導(dǎo)教師提出的問題實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)報(bào)告一律每班用一樣大小軟皮本，正面寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，背面寫實(shí)驗(yàn)記錄，上課前交預(yù)習(xí)報(bào)告和上一次的實(shí)