多糖結(jié)構(gòu)分析

多糖結(jié)構(gòu)研究方法多糖及其復(fù)合物是來自于高等動、植物細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁中的天然大分子物質(zhì)之一，自然界含量豐富，與人類生活緊密相關(guān)，對維持生命活動起至關(guān)重要的作用。多糖和核酸、蛋白質(zhì)、脂類構(gòu)成了最基本的4類生命物質(zhì)。由于多糖的生物活性與多糖的結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，因此清楚認(rèn)識多糖的結(jié)構(gòu)是進(jìn)行多糖研究和利用的基礎(chǔ)。多糖結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，可以說是自然界中最復(fù)雜的生物大分子。從化學(xué)觀點(diǎn)來看，多糖結(jié)構(gòu)解析最大的難點(diǎn)就在于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。糖的結(jié)構(gòu)分類可沿用蛋白質(zhì)和核酸的分類方法，即多糖的結(jié)構(gòu)也可分為一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。與蛋白質(zhì)或核酸大分子相比，糖鏈的一級結(jié)構(gòu)“含義”要十分豐富。測定糖鏈的一級結(jié)構(gòu)，要解決以下幾個問題：(1)相對分子質(zhì)量；(2)糖鏈的糖基組成，各種單糖組成的摩爾比；(3)有無糖醛酸及具體的糖醛酸類型和比例；(4)各單糖殘基的D-或L．構(gòu)型，毗喃環(huán)或呋喃環(huán)形式；(5)各個單糖殘基之間的連接順序；(6)每個糖苷鍵所取的a-或B．異頭異構(gòu)形式；(7)每個糖殘基上羥基被取代情況：(8)糖鏈和非糖部分連接情況；(9)主鏈和支鏈連接位點(diǎn)：（10)糖殘基可能連接硫酸酯基、乙?；?、磷酸基、甲基的類型等。多糖的二級結(jié)構(gòu)是指多糖主鏈間以氫鍵為主要次級鍵而形成的有規(guī)則的構(gòu)象，與分子主鏈的構(gòu)象有關(guān)，不涉及側(cè)鏈的空間排布；多糖的三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)是指以二級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，由于糖單位之間的非共價相互作用，導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)在有序的空間里產(chǎn)生的有規(guī)則的構(gòu)象四。多糖結(jié)構(gòu)的分析手段很多。不僅有儀器分析法，如紅外、核磁共振、質(zhì)譜等，還有化學(xué)方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應(yīng)等，以及生物學(xué)方法，如特異性糖苷酶酶切、免疫學(xué)方法等。1質(zhì)譜(MS)由于MS法在糖鏈結(jié)構(gòu)分析中具有快速靈敏，樣品用量少、結(jié)構(gòu)信息直觀的特點(diǎn)而得到越來越廣泛的應(yīng)用。近年來各種軟電離技術(shù)的誕生，如快原子轟擊質(zhì)譜(FAB—MS)，電噴霧質(zhì)譜(ESI—MS)，基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜(MALDI-MS)等，使得糖結(jié)構(gòu)分析的研究取得了日新月異的發(fā)展。(1)快原子轟擊質(zhì)譜(FAB—MS)FAB-MS是上世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的一種新的軟電離質(zhì)譜技術(shù)。其顯著區(qū)別于傳統(tǒng)質(zhì)譜之處在于樣品受加速原子或離子的轟擊，可直接在基質(zhì)溶液中電離。FAB-MS的引入使傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)難以分析的極性強(qiáng)，難揮發(fā)以及熱不穩(wěn)定的化合物不經(jīng)衍生化就可以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，而且對生物大分子的研究取得了重大突破。FAB-MS已被證明是分析糖結(jié)構(gòu)最為有力的方法之一，它不僅可以測定寡糖及其衍生物的分子量，而且可以測定聚合度高于30的糖的分子量。同時，F(xiàn)AB-MS還可以確定糖鏈中糖殘基的連接位點(diǎn)和序列，已廣泛用于糖類的分析。(2)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)ESI-MS是將溶液中分子轉(zhuǎn)變成氣相離子非常有效的手段，是目前最軟的一種電離方式。這種電離方式所產(chǎn)生的分子離子往往帶有多電荷。因此ESI-MS可以測定的分子量范圍大大擴(kuò)展。對多糖而言，ESI-MS可以分析nh25個甚至更多單糖殘基組成的含有羧基或硫酸根等官能團(tuán)的多糖。近年來，ESI-MS已在多糖的結(jié)構(gòu)分析中顯示了強(qiáng)大的生命力。它能用于衍生化和非衍生化多糖的測定。ESI-MS易與HPLC，CE等技術(shù)聯(lián)用，大大提高了工作效率以及靈敏度和精確度，如ESI-MS與I-IPLC聯(lián)用分析寡糖及其衍生物。(3)基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜(MALDI-MS)MALDI-MS于上世紀(jì)80年代末問世。由于技術(shù)的特點(diǎn)，這種離子化方式電離出的離子常用飛行時間(TOF)檢測器檢測，因此MALDI-MS常與TOF一起稱為基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。它也是一種軟電離方式，產(chǎn)生的分子離子十分穩(wěn)定，不易裂解，所以適用于檢測大分子質(zhì)量的生物樣品。2紅外光譜(IR)紅外光譜(infraredspectroscopy，IR)是一種吸收光譜。因?yàn)榧t外光只能激發(fā)分子內(nèi)原子核之間的振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，所以紅外吸收光譜是通過測定振動和轉(zhuǎn)動能級躍遷的信息來研究分子結(jié)構(gòu)的。在紅外光譜圖中，縱坐標(biāo)一般用線性透光率作標(biāo)度，稱為透射光譜圖；也有采用非線性吸光度為標(biāo)度的，稱為吸收光譜圖。譜圖中的橫坐標(biāo)是以紅外輻射光的波數(shù)(鋤d)為標(biāo)度。較少采用波長(pm)為標(biāo)度。波長和波數(shù)的關(guān)系依照式為：v(cml)×u岬)=104。紅外輻射光的波數(shù)可分為近紅外區(qū)(10000-4000cm-1)、中紅外區(qū)(4000-400cm-1)和遠(yuǎn)紅外區(qū)(400-10cnl-1)。其中最常用的是中紅外區(qū)，大多數(shù)化合物的化學(xué)鍵振動能級的躍遷發(fā)生在這一區(qū)域，因此主要研究中紅外區(qū)域的吸收光譜即分子的振動光譜，可以對各種高分子材料進(jìn)行分析、測定。則對應(yīng)這些基團(tuán)的一些譜帶在這個化合物的取光譜中往往是最強(qiáng)的，明顯地顯示這個基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特征。因此，對應(yīng)這些基團(tuán)的譜帶在其聚合物的譜圖中，常常是處于最顯著的地位，能夠很特征地反映該類聚合物的結(jié)構(gòu)和預(yù)示其存在。對于各種聚合物分子來說，含有的主要極性基團(tuán)是酸、酯、酰胺、酰亞胺、苯醚、脂肪醚和醇等。除此之外，含有硅、硫、磷、氯和氟等雜原子的化合物也常具有較強(qiáng)的極性。紅外光譜作為“分子的指紋”廣泛用于分子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)化學(xué)組成的研究。根據(jù)分子對紅外光吸收后得到譜帶頻率的位置、強(qiáng)度、形狀以及吸收譜帶和溫度、聚集狀態(tài)等的關(guān)系便可確定分子的空間構(gòu)型，求出化學(xué)鍵的力常數(shù)、鍵長和鍵角。從光譜分析的角度看主要是利用特征吸收譜帶的頻率推斷分子中存在某一基團(tuán)或鍵，由特征吸收譜帶頻率的變化推測臨近的基團(tuán)或鍵，進(jìn)而確定分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，當(dāng)然也可由特征吸收譜帶強(qiáng)度的改變對混合物及化合物進(jìn)行定量分析。3拉曼光譜拉曼散射又稱拉曼效應(yīng)，是由印度物理學(xué)家拉曼于1928年首先發(fā)現(xiàn)并因此獲得1930年諾貝爾物-理獎。拉曼效應(yīng)是能量為hvo的光子同分子碰撞所產(chǎn)生的光散射效應(yīng)，也就是說，拉曼光譜是一種散射光譜。單色光束的入射光光子與分子相互作用時可發(fā)生彈性碰撞和非彈性碰撞，在非彈性碰撞過程中，光子與分子可以直接進(jìn)行觀察，所以不會由于制樣原因而產(chǎn)生假象。這對斷口的失效分析特別重要。樣品制備簡單，可以是自然面、斷口、塊狀、粉體、反光及透光光片，對不導(dǎo)電的樣品只需蒸鍍一層20nm的導(dǎo)電膜。另外，現(xiàn)在許多SEM具有圖像處理和圖像分析功能。有的SEM加入附件后，能進(jìn)行加熱、冷卻、拉伸及彎曲等動態(tài)過程的觀察。但掃描電鏡只能觀察物質(zhì)表面的微觀形貌，無法獲得物質(zhì)內(nèi)部的信息。7透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡是以波長很短的電子束做照明源，用電磁透鏡聚焦成像的一種具有高分辨本領(lǐng)，高放大倍數(shù)的電子光學(xué)儀器。測試的樣品要求厚度極薄(幾十納米)，以便使電子束透過樣品。在真空條件下，電子束經(jīng)高壓加速后，穿透樣品時形成散射電子和透射電子，它們在電磁透鏡的作用下在熒光屏上成像。投射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)如圖1．2所示[91。透射電子顯微術(shù)在高分子研究中有著重要的應(yīng)用。它可用來觀察高分子晶體的形貌和結(jié)晶結(jié)構(gòu)，高分子多相體系的微觀相分離結(jié)構(gòu)，高分子材料的網(wǎng)絡(luò)，測定高分子的分子量分布和多孔高分子薄膜的微孔大小與分布，高分子材料的表面、界面和斷口、粘合劑的粘結(jié)效果以及聚合物涂料的成膜特性，還可用來使高分子晶體的晶格至高分子本身直接成像。透射電鏡由于入射電子透射試樣后，將與試樣內(nèi)部原子發(fā)生相互作用，從而改變其能量及運(yùn)動方向。顯然，不同結(jié)構(gòu)有不同的相互作用。這樣，就可以根據(jù)透射電子圖象所獲得的信息來了解試樣內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。由于試樣結(jié)構(gòu)和相互作用的復(fù)雜性，因此所獲得的圖象也很復(fù)雜。它不象表面形貌那樣直觀、易懂。8差示掃描量熱法(DSC)DSC是在程序控制溫度條件下，測量輸入給樣品與參比物的功率差與溫度關(guān)系的一種熱分析方法。差示掃描量熱法又稱為差動分析，有功率補(bǔ)償式差示掃描量熱法和熱流式差示掃描量熱法兩種類型。典型的差示掃描量熱(DSC)曲線以熱流率(dH／dt)為縱坐標(biāo)、以時間(t)或溫度(T)為橫坐標(biāo)，即dH／dt．t(或T)曲線。曲線離開基線的位移即代表樣品吸熱或放熱的速率(mJ·s‘1)，而曲線中峰或谷包圍的面積即代表熱量的變化。因而差示掃描量熱法可以直接測量樣品在發(fā)生物理或化學(xué)變化時的熱效應(yīng)。能定量測定多種熱力學(xué)和動力學(xué)參數(shù)，如比熱、反應(yīng)熱、轉(zhuǎn)變熱、反應(yīng)速度和高聚物結(jié)晶度等。9圓二色譜(cD)法一束平面偏振光可以看成是相同頻率和振幅的左、右圓偏振光的迭加，當(dāng)這兩束偏振光通過光活性介質(zhì)時，如果它們的波長在該光活性的生色團(tuán)的吸收范圍內(nèi)，由于光吸收的不同，透射后的兩束光的振幅有不同的減少，這樣透射光的迭加就形成了一個橢圓偏振，這種現(xiàn)象稱為圓二色性，通過記錄不同波長處所對應(yīng)的橢圓率就得到圓二色譜(CD)t10l。圓二色光譜儀的結(jié)構(gòu)(如圖1