植物組織培養(yǎng)基本知識(shí)

植物組織培養(yǎng)基本知識(shí)第一頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六本課程學(xué)習(xí)要求☆掌握基本原理☆掌握基本概念☆了解開展組織培養(yǎng)工作的基本設(shè)施☆掌握植物組織培養(yǎng)基本的操作技術(shù)及操作流程

☆了解植物組織培養(yǎng)在植物快繁等方面的應(yīng)用成績(jī)?cè)u(píng)定：本課程為考查科目，采用理論考試（40%）、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（包括實(shí)驗(yàn)報(bào)告、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、團(tuán)隊(duì)精神等）（50%）、作業(yè)與平時(shí)表現(xiàn)（10%）相結(jié)合的考核方式。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目分值分配：實(shí)驗(yàn)一5%、實(shí)驗(yàn)二10%、實(shí)驗(yàn)三10%、實(shí)驗(yàn)四20%、實(shí)驗(yàn)五5%第二頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六本課程的學(xué)習(xí)方法做好基本功：植物學(xué)、植物生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)重視實(shí)驗(yàn)課（36節(jié)實(shí)驗(yàn)課、14節(jié)理論）練就嫻熟的實(shí)驗(yàn)技能學(xué)會(huì)對(duì)新知識(shí)的不斷吸收和總結(jié)：發(fā)展中的學(xué)科，有更多新知識(shí)、新結(jié)論、新技術(shù)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際：

應(yīng)用性強(qiáng)的學(xué)科，學(xué)會(huì)應(yīng)用，才有作用。第三頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六第一章植物組織培養(yǎng)的基本知識(shí)主要內(nèi)容植物組織培養(yǎng)定義及類型植物組織培養(yǎng)的基本原理植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡(jiǎn)史植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用第四頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六目的與要求掌握植物組織培養(yǎng)的概念與類型掌握植物組織培養(yǎng)的基本原理了解植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)了解植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡(jiǎn)史了解植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用第五頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六一、植物組織培養(yǎng)一般概念

定義：離體（invitro)條件下利用人工培養(yǎng)條件在無菌情況下，對(duì)植物組織（器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體等）進(jìn)行培養(yǎng)，并使之生長(zhǎng)、發(fā)育再生出完整植株的過程。

外植體（explant)：由活體（invivo)植物體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細(xì)胞、組織、器官等。第六頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六第七頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六第八頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六第九頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六二、植物組織培養(yǎng)的類型1.依外植體不同分：器官培養(yǎng)（organculture）莖尖分生組織培養(yǎng)(shoottipculture,shootapexculture,apicalmeristemculture)愈傷組織培養(yǎng)(callusecultrue)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplastculture)

愈傷組織（callus）:在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無序生長(zhǎng)狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。第十頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六蟹爪蘭的愈傷組織第十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六第十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六二、植物組織培養(yǎng)的類型按培養(yǎng)方法分為固體培養(yǎng)（solidculture）:在液體培養(yǎng)液中加入0.5%～1%的瓊脂使液體培養(yǎng)液半固化，再接種培養(yǎng)物的一種培養(yǎng)技術(shù)。液體培養(yǎng)（submergedculture）：把細(xì)胞或生物體的一部分，置于液體培養(yǎng)基中使其發(fā)育，并不斷振蕩，使之均勻地在懸濁液中進(jìn)行培養(yǎng)的一種方法第十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）：將親本愈傷組織或高密度的懸浮細(xì)胞同低密度細(xì)胞一起培養(yǎng)，以促進(jìn)低密度細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂的培養(yǎng)方法。看護(hù)培養(yǎng)是由繆爾（Muir）于1953年創(chuàng)立的。微室培養(yǎng)（microchamberculture）：利用玻璃或塑料制作的小室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)。第十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）：將親本愈傷組織或高密度的懸浮細(xì)胞同低密度細(xì)胞一起培養(yǎng)，以促進(jìn)低密度細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂的培養(yǎng)方法。看護(hù)培養(yǎng)是由繆爾（Muir）于1953年創(chuàng)立的。第十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六微室培養(yǎng)（microchamberculture）：利用玻璃或塑料制作的小室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)。第十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六二、植物組織培養(yǎng)的類型3.按培養(yǎng)過程分為：初代培養(yǎng)（Primaryculture）(無菌培養(yǎng)物)

將從植物體上分離下來的第一次培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)（Subculture）（增殖培養(yǎng)）將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，稱為繼代培養(yǎng)。第十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六三、植物組織培養(yǎng)的基本原理—植物細(xì)胞的全能性基本原理：▲植物細(xì)胞的全能性（totipotent)：

-----植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。從理論上講，生物體的每一個(gè)活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性.細(xì)胞差異：（1）受精卵的全能性最高（胚性強(qiáng)）

（2）體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞的低。實(shí)踐證明：處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。

第十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六

三、植物組織培養(yǎng)的基本原理—植物細(xì)胞的全能性

▲植物細(xì)胞全能性的表達(dá)兩個(gè)過程：☆脫分化（dedifferentiation)：一個(gè)成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程。恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。☆再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類型的過程。第十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六離體的植物器官、組織、細(xì)胞脫分化愈傷組織再分化根芽胚狀體植物體

植物組織培養(yǎng)過程（細(xì)胞全能性表達(dá)過程）植物組織培養(yǎng)條件

含有全部營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基(無機(jī)、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)、植物激素)、一定的溫度、空氣、光照、適合的pH、無菌環(huán)境等。

植物激素控制理論：細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素-可控制器官的分化：高-莖芽的分化；中-誘導(dǎo)愈傷組織；低-根的形成）第二十頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六四、植物組織培養(yǎng)特點(diǎn)①培養(yǎng)條件可以人為控制

在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對(duì)植物生長(zhǎng)極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。②生長(zhǎng)周期短，繁殖率高

由于人為控制培養(yǎng)條件，因此生長(zhǎng)較快，一般20—30d為一個(gè)周期。植物材料按幾何級(jí)數(shù)繁殖生產(chǎn)，總體來說成本低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。

③管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制

植物組織培養(yǎng)是在一定的場(chǎng)所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營(yíng)養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等一系列繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。

第二十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六五、植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡(jiǎn)史探索階段（1902-1929年）組培方法和定義的建立階段（1930-1939年）細(xì)胞全能性的證實(shí)階段（1940-1959）組培技術(shù)和理論迅速發(fā)展階段（1960-今）四個(gè)階段第二十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六1.探索階段（1902-1929年）Haberlandt：基礎(chǔ)：貢獻(xiàn)：提出細(xì)胞全能性假設(shè)實(shí)驗(yàn)-檢驗(yàn)細(xì)胞學(xué)說小野芝麻和鳳眼蘭的柵欄細(xì)胞和虎眼萬年青屬表皮細(xì)胞無分裂細(xì)胞高度分化+培養(yǎng)基中無生長(zhǎng)激素首次進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)說Knop+蔗糖第二十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六《關(guān)于單離植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)》我愿意指出：在我的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，雖然經(jīng)常觀察到細(xì)胞的明顯生長(zhǎng)，但從未觀察到細(xì)胞分裂。發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞培養(yǎng)的條件，將是未來培養(yǎng)試驗(yàn)的難題。在未來，人們可以成功地從營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)出人工胚。第二十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六1904年：Hanning胚培養(yǎng)：培養(yǎng)蘿卜和辣根菜的胚，得到植株1922年：Kotte和Robbins根培養(yǎng)1925年：Laibach亞麻種間雜交幼胚培養(yǎng)得到雜種其它研究1922年：Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得蘭花幼苗，克服其種子發(fā)芽困難的問題。第二十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六2.組培方法和定義的建立階段（1930-1939年）1934年：White番茄根建立第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的植物無性系。 當(dāng)根2厘米長(zhǎng)－切成0.5-1厘米切斷，無菌液體培養(yǎng)－完全 相同的離體根－根離體培養(yǎng)真正成功。28年-1600代。

1934年：Gautherete培養(yǎng)山毛楊、黑楊形成層組織產(chǎn)生了Callus1937年：White發(fā)現(xiàn)3種B族維生素（吡哆醇、硫胺素、煙酸）和IAA對(duì)植物生長(zhǎng)有用1939年：Gautherete培養(yǎng)胡蘿卜根小外植體成功1939年：White培養(yǎng)煙草種間雜種幼莖切段原形成層成功1939年：Nobecourt培養(yǎng)胡蘿卜根塊莖薄壁組織成功——組織培養(yǎng)學(xué)科的奠基人第二十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六組織培養(yǎng)的奠基人第二十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六3.細(xì)胞全能性的證實(shí)階段（1940-1959）1943年：White植物組織培養(yǎng)手冊(cè)《AHandbookofPlantTissueCulture》，標(biāo)志組織培養(yǎng)成為一門新興學(xué)科1946年：羅士韋在菟絲子莖尖培養(yǎng)中觀察到花的形成，為試管受精奠定了基礎(chǔ)1948年：Skoog和崔真培養(yǎng)煙草莖段時(shí)，發(fā)現(xiàn)腺嘌呤或腺苷可解除生長(zhǎng)素對(duì)芽生長(zhǎng)的抑制作用，腺嘌呤/生長(zhǎng)素高，生芽；低，生根；相等，不分化。第二十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六1952-1953年：美國(guó)科學(xué)家StewardF.C.

用胡蘿卜根的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞能經(jīng)歷象受精卵發(fā)育成胚一樣的途徑，發(fā)育成完整植抹。證實(shí)了植物細(xì)胞全能性學(xué)說。1952年：Morel和Martin首次報(bào)道莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，獲得無病毒大麗花植株。1954年：Muir將煙草愈傷組織置于固體培養(yǎng)基上，在其上放一片濾紙，再在濾紙片上放上一個(gè)煙草體細(xì)胞，單細(xì)胞培養(yǎng)成功。1957年：Skoog、Miller提出了激素控制理論（細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素-可控制器官的分化：高-莖芽的分化；中-誘導(dǎo)愈傷組織；低-根的形成）第二十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六4.組培技術(shù)和理論迅速發(fā)展階段（1960-今）1960年以來組織培養(yǎng)理論、實(shí)踐、技術(shù)和方法不斷完善和發(fā)展，形成獨(dú)具特色的專業(yè)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上建立了較完整的實(shí)驗(yàn)程序，已成為一種重要和精細(xì)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)組織培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的許多分支學(xué)科，并取得豐碩的成果。第三十頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六4.1原生質(zhì)體培養(yǎng)1960年：Cocking酶解法分離原生質(zhì)體獲得成功。使植物細(xì)胞可以象動(dòng)物細(xì)胞一樣進(jìn)行細(xì)胞融合。1971年，日本takebe和Nagata首次利用煙草葉片分離原生質(zhì)體并獲得再生植株。我國(guó)獲得了30個(gè)以上品種的原生質(zhì)體再生植株，其中包括難度較大的重要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物大豆、水稻、玉米、小麥、谷子、高梁、大麥、棉花、油萊、馬鈴薯等第三十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六4.2細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交1972年，美國(guó)Carlson誘導(dǎo)粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的原生質(zhì)體融合得到種間體細(xì)胞雜種－第一株體細(xì)胞雜種。1978年，有性雜交不親和的番茄/馬鈴薯間的體細(xì)胞雜交獲得了雜種植株(Melchers)。隨后獲得了地上結(jié)番茄，地下生馬鈴薯的雜種植物。1985年，馬鈴薯的栽培品種與野生種的體細(xì)胞雜交，得到了抗晚疫病和卷葉病的體細(xì)胞雜種(Austin)。第三十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六4.3胚胎培養(yǎng)和試管受精避免受精后胚乳發(fā)育不良或因種胚與胚乳間不親和而致使雜種胚夭折，及時(shí)分離幼胚接種在無激素培養(yǎng)基上使之直接成苗，這就是胚挽救。大大提高遠(yuǎn)緣雜交的成功率。印度科學(xué)家在裁培種菜豆、黃麻和花生的遠(yuǎn)緣雜交中獲得了理想的重組體。中國(guó)農(nóng)科院蔬菜所培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)和大白菜的雜種胚得到了種間雜種。第三十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六4.4組織及細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)

Arregnin和bonner在1950年首先進(jìn)行了培養(yǎng)橡膠莖愈傷組織獲取橡膠的嘗試。近50年來飛速的發(fā)展。從400多種植物培養(yǎng)細(xì)胞中分離到600多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中60多種在含量上超過或等于其原植物，20種以上干重超過1％。在日本，人參細(xì)胞培養(yǎng)已達(dá)130600L發(fā)酵罐；德國(guó)用1000L發(fā)酵罐培養(yǎng)毛地黃細(xì)胞；在我國(guó)，人參細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。利用培養(yǎng)細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化能力生產(chǎn)高值化合物，德國(guó)科學(xué)家進(jìn)行了出色的研究。他們?cè)诿攸S細(xì)胞的培養(yǎng)中加入生物合成途徑的中間化合物毛地黃毒素和一甲基毛地黃毒素，培養(yǎng)細(xì)胞以幾乎100％的轉(zhuǎn)化速率使之羥基化，變?yōu)獒t(yī)藥強(qiáng)心劑地高辛。第三十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六4.5單倍體育種1964年，印度的Guba和Meheshiwari培養(yǎng)毛葉曼陀羅花藥獲得了第一棵單倍體植株。我國(guó)于1970年開始這方面的研究，取得了很大的成果。40種以上植物獲得單倍體植株，其中小麥、玉米、橡膠樹、楊樹、辣權(quán)、油菜、柑桔、甘蔗、大豆、葡萄和蘋果等的單倍體植株為我國(guó)首創(chuàng)。通過單倍體育種獲得了水稻、小麥、煙草、辣椒和甜櫻新品種。中花8號(hào)、9號(hào)等15個(gè)水稻新品種，總種植面積達(dá)1000萬畝。通過花粉和花藥培養(yǎng)已獲得了幾百種植物的單倍體植株。第三十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六花藥培養(yǎng)：中花8號(hào)水稻、京花1號(hào)小麥。體細(xì)胞無性系變異：

我國(guó)已經(jīng)培育出抗白葉枯病及賴氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和酪氨酸含量高于親本系的水稻變異體。突變體誘導(dǎo)和篩選 細(xì)胞突變體的篩選最早始于1959年，G，Melchers在金魚草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中獲得了溫度突變體。迄今為止，不少于15個(gè)科、45個(gè)種的植物細(xì)胞培養(yǎng)中篩選出100個(gè)以上的細(xì)胞突變體或變異體，有抗病細(xì)胞突變體、逆境脅迫抗性突變體、抗除草劑細(xì)胞突變體及營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞突變體等。其他：第三十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六植物快速繁殖技術(shù)60年代，法國(guó)的Morel用莖尖培養(yǎng)的方法大量繁殖蘭花獲得成功。植物快速繁殖技術(shù)、試管苗工廠化生產(chǎn)和無病毒種苗生產(chǎn)技術(shù)在70年代得到了快速的發(fā)展。美國(guó)、法國(guó)、意大利、荷蘭等歐美國(guó)家試管苗的年產(chǎn)量均在數(shù)千萬株以上，并且以每年7％-8％的速度增加。我國(guó)快速繁殖和無病毒種苗生產(chǎn)的研究始于70年代，到“七五”期間研究成果開始向應(yīng)用轉(zhuǎn)化并大見成效。馬鈴薯無毒種薯和甘蔗種苗已在生產(chǎn)上大面積種植。第三十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六組織細(xì)胞培養(yǎng)物的超低溫保存及種質(zhì)庫(kù)的建立植物細(xì)胞全能性的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，為植物的種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存開辟了一條新途徑。許多植物的組織培養(yǎng)物在液氮中超低溫保存以后，仍然能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原來的遺傳特性。如胡蘿卜和煙草的懸浮細(xì)胞超低溫保存6個(gè)月以后仍然能恢復(fù)生長(zhǎng)并分化出植株。第三十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子1958年，Reinert在胡蘿卜的組織培養(yǎng)中最先發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞胚胎(胚狀體)。水稻、小麥、玉米等100多種植物（43科、92屬）能通過離體培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。1977年，Murashige第一次提出人工種子構(gòu)想。把胚狀體包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具有種子的機(jī)能并可直接播種于田間。80年代初，美、日、法等國(guó)相繼開展了人工種子的研究，并且在胡蘿卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、萵苣、花旗松等植物上獲得了初步的成功。我國(guó)人工種子的研究開始于“七五”期間，并且被列人了“863高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃”。第三十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，編輯于2023年，星期六六、應(yīng)用領(lǐng)域

1、快速繁殖