現(xiàn)代分子生物學(xué)筆記朱玉賢

第一章緒論分子生物學(xué)分子生物學(xué)的基本含義(p8)是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。分子生物學(xué)與其它學(xué)科的關(guān)系成它獨(dú)特的理論體系和研究手段，成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科。生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切:傳統(tǒng)生物化學(xué)的中心內(nèi)容是代謝，包括糖、脂類、氨基酸、核苷酸、以及能量代謝等與生理功能的聯(lián)系。分子生物學(xué)則著重闡明生命的本質(zhì) 主要研究生物大分子核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、生命信息的傳遞和調(diào)控。細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切:法。的分子機(jī)理，這在某種程度上是向細(xì)胞生物學(xué)的靠攏。第一章序論1859年發(fā)表了《物種起源》，用事實(shí)證明“物競天擇，適者生存”的進(jìn)化論思想。個(gè)認(rèn)識(shí)到生物世界的不連續(xù)性。不可磨滅的貢獻(xiàn)。細(xì)胞學(xué)說細(xì)胞學(xué)說的建立及其意義的基本單位。經(jīng)典遺傳學(xué)統(tǒng)一律：當(dāng)兩種不同植物雜交時(shí)，它們的下一代可能與親本之一完全相同；分離規(guī)律：將不同植物品種雜交后的F1代種子再進(jìn)行雜交或自交時(shí)，下一代就會(huì)按照一定的比例分離，因而具有不同的形式。1865年發(fā)表《植物雜交試驗(yàn)1900現(xiàn)代遺傳學(xué)Morgan及其助手第一次將代表某一特性的基因同染色體聯(lián)系起來，使科學(xué)界普遍認(rèn)識(shí)了染色體的重要性并接受了孟德爾的遺傳學(xué)原理。Morgan特別指出：種質(zhì)必須由某些獨(dú)立的要素組成，我們把這些要素稱為遺傳因子或基因。第二節(jié)分子生物學(xué)發(fā)展簡史準(zhǔn)備和醞釀階段2050對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的兩點(diǎn)重大突破：1．確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)2．確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段（20世紀(jì)50年代初到70年代初）1953WatsonCrickDNA子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。在此期間的主要進(jìn)展包括：遺傳信息傳遞中心法則的建立對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的意義：確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；提出了堿基配對(duì)是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式；礎(chǔ)。Crick于1954年所提出遺傳信息傳遞的中心法則CentralDogma：初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段（20世紀(jì)70年代后至今）基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為標(biāo)志。其間的重大成就包括：DNA基因組研究的發(fā)展基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究成為新的前沿領(lǐng)域第三節(jié)分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容一．DNA重組技術(shù)（recombinantDNAtechnology）DNA使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。DNA重組技術(shù)的應(yīng)用：利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物體細(xì)胞克隆基因表達(dá)與調(diào)控的基礎(chǔ)研究二．生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究基因組、蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)基因組(Genome)：細(xì)胞或生物體一條完整單體的全部染色體遺傳物質(zhì)的總和。人類基因組計(jì)劃HumanGenomeProject,HG：測定出人基因組全部DNA31095-10基因組、蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)蛋白組計(jì)劃（Proteomeproject）整個(gè)生物個(gè)體全部蛋白質(zhì)及其功能。生物信息學(xué)的科學(xué)。四．基因表達(dá)調(diào)控研究第二章染色體與DNA本章內(nèi)容染色體DNADNA原核生物和真核生物DNADNADNA第一節(jié)染色體(chromosome)概念：染色體(chromosome原核生物及細(xì)胞器在內(nèi)的基因載體的總稱。染色質(zhì)(chromatin)：由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，在分裂間期染色體結(jié)構(gòu)疏松，稱為染色質(zhì)。其實(shí)染色質(zhì)與染色體只是同一物質(zhì)在不同細(xì)胞周期的表現(xiàn)。(euchromatin(hypersensitive異染色質(zhì)(heterochromatin)：在間期核中處于凝縮狀態(tài)，無轉(zhuǎn)錄活性，也叫非活動(dòng)染色質(zhì) chromatin)，是遺傳惰性區(qū)。在細(xì)胞周期中表現(xiàn)為晚復(fù)制，早凝縮，即異固縮現(xiàn)(heteropycnosis)。原核細(xì)胞與真核細(xì)胞特征分析染色體特性：分子結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定能夠自我復(fù)制，使親、子代之間保持連續(xù)性能夠產(chǎn)生可遺傳的變異真核細(xì)胞染色體的組成DNA 30%--40%組蛋(histone) 非組蛋(NHP) 變化很大少量RNA染色體中的蛋白質(zhì)組蛋白(histone)：一類小的帶有豐富正電荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，與DNA有高親和力。組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它與DNA組成核小體。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。非組蛋白(non-histoneprotein)：是染色體上與特異DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，所以又稱為序列特異性DNA結(jié)合蛋白。組蛋白具有如下特性：1、進(jìn)化上的極端保守性。2、無組織特異性。3、肽鏈上氨基酸分布的不對(duì)稱性。4、組蛋白的修飾作用。5、富含賴氨酸的組蛋白H5。非組蛋白：非組蛋白大約占組蛋白總量的60－70%，種類很多。HMG(highmobilitygroupprotein)，能與DNAH1作用,可能與DNA螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。DNADNAA24非組蛋白：與H2A非組蛋白的一般特性：1.非組蛋白的多樣性；非組蛋白的量大約是組蛋白的60%～70%，但它的種類卻很多，約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。2.非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。DNAC值：通常指一種生物單倍體基因組DNA的總量。C值反常現(xiàn)象：真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開，這就是著名的“C值反?，F(xiàn)象”。染色體中的DNA根據(jù)DNA的動(dòng)力學(xué)研究，真核細(xì)胞DNA可分為：高度重復(fù)序列：幾百→幾萬copy。如：衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。中度重復(fù)序列：10→幾百copy。如：各種rDNA、tDNA及組蛋白基因。低度重復(fù)序列：2→10copy。如：血紅蛋白。單拷貝序列：大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和基因間間隔序列。只有一個(gè)拷貝。如：蛋清蛋白。染色體折疊DNA核小體螺線管圓筒超螺旋核小體染色質(zhì)纖維細(xì)絲是許多核小體連成的念珠狀結(jié)構(gòu)。核小體(nucleosome)：DNA繞在組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3、H4各一對(duì))核心外1.8周(146bp)，形成核小體核心顆粒。螺線管10nm的染色質(zhì)細(xì)絲盤繞成螺旋管狀的30nm纖維粗絲，通稱螺線管solenoi。螺線管的每一螺旋包含6個(gè)核小體，其壓縮比為和分裂中期染色體的基本組分。上述螺線管可進(jìn)一步壓縮形成超螺旋。由30nm螺線管纏繞而成一細(xì)長、中空的圓筒，直徑為440。超螺旋進(jìn)一步壓縮1/5便成為染色體單體，總壓縮比是7×6×40×5，原核生物基因組特點(diǎn)：1、結(jié)構(gòu)簡練2、存在轉(zhuǎn)錄單元 多順反子mRNA3、有重疊基因Sanger1977在《Nature》上發(fā)表了ΦX174DNA的全部核苷酸序列，正式發(fā)現(xiàn)了重疊基因。第二節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)所謂DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。基本特點(diǎn)①DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。②DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶配對(duì)，鳥嘌呤只能與胞嘧啶配對(duì)。2、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。A-DNA和Z-DNA3、DNADNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負(fù)超螺旋兩大類。DNA分子的超螺旋化可以用一個(gè)數(shù)學(xué)公式來表示：L=T+W其中L為連接數(shù)linkingnumbe，是指環(huán)形DNALT為雙螺旋的盤繞數(shù)twistingnumbe，W為超螺旋數(shù)writhingnumbe，它們是變量。2．3DNA的復(fù)制DNA復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度一、DNA1、DNA的半保留復(fù)制每個(gè)子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，所以這種復(fù)制方式被稱為DNA的半保留復(fù)制semiconservativereplicatioDNA的這種半保留復(fù)制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性。2、復(fù)制的起點(diǎn)與方向一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子replico。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。多復(fù)制子：DNA復(fù)制時(shí)，原核生物一般只有一個(gè)起始位點(diǎn)，而真核生物則有多個(gè)起始位點(diǎn)，因而在復(fù)制時(shí)呈現(xiàn)多復(fù)制泡，也稱為多復(fù)制子。DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點(diǎn)以雙向等速復(fù)制方式進(jìn)行的（圖2-1。復(fù)制叉以DNA順序?yàn)槠瘘c(diǎn)，向兩個(gè)方向等速生長前進(jìn)。拓?fù)洚悩?gòu)酶I拓?fù)洚悩?gòu)酶IDnaDNA解鏈酶（DNAhelicase）DNA解鏈酶能通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）SSB蛋白的作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán)。所以，SSB蛋白只保持單鏈的存在，并不能起解鏈的作用。3、DNA的半不連續(xù)復(fù)制與岡崎片段DNA復(fù)制時(shí)，短時(shí)間內(nèi)合成的約1000個(gè)核苷酸左右的小片段，稱之為岡崎片段(Okazakifragment)DNA制在生物界是有普遍性的，因而稱之為雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。DNA鏈的延伸：DNA復(fù)制體(replisome)：在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和解鏈酶構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體。4、滯后鏈的引發(fā)DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3'端開始合成新的DNA鏈。滯后鏈的引發(fā)過程往往由引發(fā)體來完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)nn'Dna、CI6進(jìn)一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功效。5、鏈的終止當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。6、復(fù)制的幾種方式(1)環(huán)狀DNA環(huán)狀雙鏈DNA的復(fù)制可分為θ型、滾環(huán)型和D-環(huán)型幾種類型(a) θ型復(fù)制的起始點(diǎn)涉及到DNA雙鏈的解旋和松開，形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉。前導(dǎo)鏈DNA開始復(fù)制前，復(fù)制原點(diǎn)的核酸序列被轉(zhuǎn)錄生成短RNA鏈，作為起始DNA復(fù)制的引物。(b) 滾環(huán)型（rollingcircle）這是單向復(fù)制的特殊方式。如ΦX174的雙鏈環(huán)狀DNADNA5‘端被從雙鏈環(huán)中置換出來并為單鏈DNA3’—OHDNADNA（c）D-環(huán)型（D-loop）DNA（即D-環(huán)。（2）線性DNA雙鏈的復(fù)制DNARNA5DNADNAT7DNA3DNA20DNADNA二、原核和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)1、原核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)大腸桿菌DNAIIIIII原核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ：有3’→5’外切酶活性和5’→3’外切酶活性。保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。DNA聚合酶Ⅱ：活性低，其3’→5’核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修復(fù)DNA的作用。DNA聚合酶Ⅲ：7種亞單位9個(gè)亞基。只具3’→5’外切酶活性，主導(dǎo)聚合酶。KlenowfragmentDNA76000UKlenow3’→5’外切酶的活性，廣泛使用于DNA三、真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)真核生物DNA復(fù)制的起始需要起始原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（ORC）參與。真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp秒，還不到大腸桿菌的120。真核生物的染色體在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能再開始。真核生物DNADNA原核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控：復(fù)制叉的多少?zèng)Q定了復(fù)制頻率的高低。真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控：細(xì)胞生活周期水平調(diào)控染色體水平調(diào)控復(fù)制子水平調(diào)控真核和原核生物DNA復(fù)制的比較相同：半保留復(fù)制都有引發(fā)、延長、終止三個(gè)階段都必須有相應(yīng)功能的蛋白質(zhì)和DNA聚合酶參與區(qū)別：真：多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)；原：一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)真：所有復(fù)制受一種調(diào)控；原：一個(gè)復(fù)制子上有多個(gè)復(fù)制叉DNADNA修復(fù)系統(tǒng) 功能錯(cuò)配修復(fù) 恢復(fù)錯(cuò)配堿基切除修復(fù) 切除突變的堿核苷酸切除修復(fù) 修復(fù)被破壞的DNADNA直接修復(fù) 修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNADNA轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)真核生物中的轉(zhuǎn)座子(Movablegene(Transposableelements)，是存在于染色體DNA(Jumping原核生物的轉(zhuǎn)座因子可分為：(insertionsequence，IS)：最簡單的