分子生物學(xué)教學(xué)課件：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-理論講授

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-理論講授重組人白介素-18基因工程菌的構(gòu)建概要分子生物學(xué)基因工程人白介素18基因工程菌的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)的基本含義以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用為研究對象，從分子水平闡明生命現(xiàn)象和生物學(xué)規(guī)律，并在分子水平上改造和利用生物的一門學(xué)科。分子生物學(xué)發(fā)展簡史進(jìn)化論和遺傳學(xué)說確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNAWatson和Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑基因工程技術(shù)作為新的里程碑?dāng)?shù)、理、化相關(guān)學(xué)科生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)滲透交叉近代生物學(xué)生物學(xué)個性共性宏觀生物學(xué)（生態(tài)學(xué)為核心）微觀生物學(xué)（分子生物學(xué)為核心）細(xì)胞水平分子水平結(jié)構(gòu)生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)等新興學(xué)科發(fā)展生物多樣性研究資源保護(hù)與利用人類生態(tài)環(huán)境的保護(hù)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展分子生物學(xué)在現(xiàn)代生物學(xué)中的地位分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)分子發(fā)育生物學(xué)分子神經(jīng)生物學(xué)分子育種學(xué)分子腫瘤學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)分子免疫學(xué)分子病毒學(xué)分子生理學(xué)分子考古學(xué)分子遺傳學(xué)分子數(shù)量遺傳學(xué)分子生態(tài)學(xué)分子進(jìn)化學(xué)…………….分子生物學(xué)的延伸分子生物學(xué)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的幾乎所有領(lǐng)域分子生物學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的帶頭學(xué)科基因工程基因工程的基本概念基因工程的組成、基本條件和主要內(nèi)容基因工程的操作過程基因工程又稱基因拼接技術(shù)，DNA重組和分子克隆技術(shù)。是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將外源基因（供體）按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在工具酶的協(xié)助下與載體構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。最大特點(diǎn)：克服了固有的生物種間限制?；蚬こ痰慕M成基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用。上游技術(shù)：基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建；下游技術(shù)：涉及到基因工程菌或細(xì)胞或基因工程生物體的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程?；蚬こ虒?shí)際應(yīng)用的現(xiàn)狀和展望基因工程農(nóng)業(yè)環(huán)境能源食品工業(yè)醫(yī)藥基因工程試劑的高回報白細(xì)胞介素-2410元/ug胰島素10.2元/mg胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素。將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！抗真菌病的轉(zhuǎn)基因草坪抗棉鈴蟲棉花抗蟲水稻12資源危機(jī)能源危機(jī)環(huán)境危機(jī)化石經(jīng)濟(jì)石油煉制生物煉制嗜熱嗜冷嗜酸嗜堿嗜鹽嗜壓嗜金屬抗輻射耐干燥極端環(huán)境人類基因組計(jì)劃21世紀(jì)對生命現(xiàn)象的認(rèn)識從單基因水平向全基因組整體水平發(fā)展。人類基因組蘊(yùn)涵有人類生、老、病、死的絕大多數(shù)遺傳信息，破譯它將為疾病的診斷、新藥物的研制和新療法的探索帶來一場革命。基因工程的主要內(nèi)容1、獲得帶有目的基因的DNA片段。2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上形成重組DNA分子。3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞(亦稱寄主細(xì)胞)，并與之一起增殖。4、從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。5、功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)?；蚬こ痰幕緱l件外源DNA（供體）；載體分子；工具酶；受體細(xì)胞載體載體是攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。質(zhì)粒（plasmid)為最常用的載體。細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制子，對細(xì)菌的某些代謝活動和抗藥性表型有一些作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)?；A(chǔ)上人工改造拼接而成，其不僅可以在細(xì)菌中復(fù)制，同時在添加真核細(xì)胞復(fù)制信號和啟動子后，可構(gòu)建成真核細(xì)胞復(fù)制表達(dá)的穿梭質(zhì)粒，用途非常廣泛。其他載體：λ噬菌體、粘粒、病毒等基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測等限制性核酸內(nèi)切酶TaqDNA聚合酶1.特點(diǎn)：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：

主要用于DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個DNA分子因而可被擴(kuò)增4×106倍。

DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，它包括以下三個步驟：

DNA模板變性(95℃)→與DNA引物退火(45℃)→引物延伸（72℃)

質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈的DNA分子編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代不僅能在細(xì)菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)。環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同構(gòu)型：超螺旋環(huán)狀DNA（scDNA）松弛開環(huán)DNA（ocDNA）松弛線性DNA（L-DNA）具有不同的電泳遷移率。載體特點(diǎn)1、至少有一個復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。2、

至少應(yīng)有一個克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。3、

至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。注：前三個特點(diǎn)必不可少。遺傳標(biāo)記基因1、標(biāo)記基因的作用

1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞這種指示可以是選擇性的（Ampr

，Tetr

，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）

2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。2、

標(biāo)記基因的種類

1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr

，Tetr

，Cmlr，Kanr，Strr2）生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ3、常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機(jī)制四環(huán)素抗性基因（Tetr

，Tcr）

Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。

β—半乳糖苷酶(lacZ)基因有1021AAs。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈分別由兩個基因編碼。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性。這兩個部分可獨(dú)立存在。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。因?yàn)樵S多載體都帶有一個LacZ基因的調(diào)控序列和頭146個氨基酸的編碼信息，編碼-互補(bǔ)肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（-互補(bǔ)）。lacZ（lacZα）中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)無外源DNA片段插入時，質(zhì)粒表達(dá)β—半乳糖苷酶的α-肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼α-肽）表達(dá)的lacZ基因產(chǎn)物（β鏈）互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有生色指示劑(5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－半乳糖苷)X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了lacZα-肽基因的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌內(nèi)不能產(chǎn)生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。β—半乳糖苷酶基因lacZα藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTGX-gal）

標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOHβ片段lacZpUC質(zhì)粒受體菌株X-galLacZ藍(lán)色化合物X-galpUC系列質(zhì)粒2.7Kb的雙鏈DNA質(zhì)粒一個氨芐青霉素抗性基因一個多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)處于表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體大腸桿菌：用于接受質(zhì)粒：DH5α、TB1、JM109、JM101用于接受λ-DNA：LE392、ED8654酵母菌：畢赤酵母啤酒酵母哺乳動物細(xì)胞：CHO基因工程實(shí)驗(yàn)需要掌握的技術(shù)質(zhì)粒提取酶切、連接電泳PCR感受態(tài)細(xì)胞制備轉(zhuǎn)化篩選鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)菌有兩個基本方法：一、CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染：即用CaCl2

處理并加以熱激促進(jìn)DNA進(jìn)入菌體二、電激法：即施加短脈沖的電荷以促進(jìn)DNA吸收聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體融合細(xì)胞核的顯微注射顆粒轟擊技術(shù)氯化鈣法瓊脂糖凝膠電泳PCR重組子的篩選1. 根據(jù)重組載體的特點(diǎn)進(jìn)行篩選：抗藥性篩選法、插入失活2. 營養(yǎng)缺陷型篩選法：載體上攜帶某些營養(yǎng)成分基因而受體菌缺失3. 限制性酶切分析4. 核酸雜交：原位雜交、Southern、Northern5. PCR表達(dá)產(chǎn)物的檢測：電泳、測活、蛋白印跡序列測定重組人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的構(gòu)建白細(xì)胞介素18白細(xì)胞介素18是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子；具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)生物學(xué)活性；與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；對多種腫瘤細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑瘤效應(yīng)。基因、載體、受體菌株基因載體菌株質(zhì)粒酶切連接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提取PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求應(yīng)掌握的實(shí)驗(yàn)技術(shù)酶切,連接凝膠回收制備感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒提取PCR瓊脂糖凝膠電泳考察指標(biāo)電泳、藍(lán)白斑數(shù)量電泳感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率電泳電泳電泳實(shí)驗(yàn)流程:第一天8AM-5PMrhIL-18基因的PCR產(chǎn)物（

0.5Kb）質(zhì)粒pUC18（2.7kb）BglⅡ和PstⅠ雙酶切BamHⅠ和PstⅠ雙酶切濃度1%瓊脂糖凝膠電泳凝膠回收與溶液回收電泳檢驗(yàn)T4連接酶連接過夜配制LB液體與固體平板培養(yǎng)基滅菌37℃過夜培養(yǎng)E.coliJM109菌株實(shí)驗(yàn)流程:第二天8AM-5PMCaCl2法制備E.ColiJM109感受態(tài)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組連接體系42℃熱激轉(zhuǎn)化90s37℃溫柔孵育45min涂布平板37℃過夜倒置培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)流程:第三天1PM-5PM觀察陰性對照組菌落生長情況有無菌落挑取1白色單菌落37℃液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)觀察陽性對照組菌落生長情況統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率觀