第二核酸的結(jié)構(gòu)與功能

第二核酸的結(jié)構(gòu)與功能第一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一1956年A.Kornberg發(fā)現(xiàn)E.coliDNA聚合酶，1958年分離該酶并在體外環(huán)境下酶促合成有活性的DNA,1959年諾獎。1958年Meselson用著名的“密度轉(zhuǎn)移”試驗(yàn)證實(shí)DNA的“半保留復(fù)制”；建立密度梯度離心。1968年岡崎片段發(fā)現(xiàn)后提出DNA半保留不連續(xù)復(fù)制。1959年S.Wess發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄酶。1960年JacobMonod經(jīng)10余年研究后提出乳糖操縱子模型，同時預(yù)言mRNA的存在。1961年S.Spiegelman在T2感染的E.coli中發(fā)現(xiàn)mRNA，建立分子雜交技術(shù)。1965年R.W.Holley測定酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級結(jié)構(gòu)，提出tRNA的“三葉草”結(jié)構(gòu)模型。1966年M.W.Nirenberg和H.G.Khorana完成全部遺傳密碼的破譯。1967年Kates和McAuslan發(fā)現(xiàn)真核轉(zhuǎn)錄酶，1970年發(fā)現(xiàn)真核mRNA含有polyA尾巴(在天花病毒感染細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)），用oligo(dT)柱分離純化真核mRNA。

第二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一1968年M.Gellert等5個實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，為發(fā)展體外DNA重組技術(shù)鑒定了基礎(chǔ)。1970年H.M.Temin和D.Baltimore同時發(fā)現(xiàn)不同反轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，補(bǔ)充“中心法則”。1970年H.O.Smith發(fā)現(xiàn)第一個II型DNA限制性內(nèi)切核酸酶HindII，導(dǎo)致一系列DNA限制性內(nèi)切核酸酶發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，和DNA連接酶一起促進(jìn)了DNA體外重組的發(fā)展。1972年P(guān).Berg等三人建立DNA重組技術(shù)，建立了第一個體外DNA重組分子(dvgalDNA片段克隆到SV40)。并建立了含有哺乳動物激素基因的工程菌株，促進(jìn)了DNA克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。1975年Furuichit和Miura研究質(zhì)型多角體病毒，發(fā)現(xiàn)真核mRNA中的m7Gppp帽子結(jié)構(gòu)。1977年P(guān).Sharp和P.Leder分別從腺病毒II型和雞卵白蛋白基因中發(fā)現(xiàn)真核基因內(nèi)部含有內(nèi)含子。1977年和分別發(fā)明了不同的測序技術(shù)，前者發(fā)明了化學(xué)斷裂法，后者發(fā)明了加減法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)終止技術(shù)（即雙脫氧終止技術(shù)），他因此第二次獲諾貝爾獎。第三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一長期以來，人們一直相信所有的酶都是蛋白質(zhì)，1981-1982年，Cech和Altman各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)RNA具有生物催化功能，取名為ribozyme（核酶）,這打破了蛋白質(zhì)對生物催化劑的一統(tǒng)天下，極大促進(jìn)了有關(guān)生命起源、生物進(jìn)化等生物學(xué)中帶根本性問題的進(jìn)一步研究。1985Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)（Polymeradechainreaction,PCR）,這是一種體外擴(kuò)增DNA的酶促反應(yīng)技術(shù)，又稱PCR擴(kuò)增。PCR技術(shù)的問世，極大地方便了DNA的克隆、鑒定及應(yīng)用，因此在很短時間內(nèi)迅速進(jìn)入生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、遺傳工程、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等各個領(lǐng)域，并顯示巨大的優(yōu)越性。目前生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因時代，更是離不開對核酸的深入廣泛研究。第四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一核酸可分成兩大類，含有核糖的稱核糖核酸（RNA）,含有脫氧核糖的稱脫氧核糖核酸（DNA）。DNA主要分布在細(xì)胞核，儲存并攜帶遺傳信息。決定細(xì)胞和個體的基因型；RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，負(fù)責(zé)遺傳信息的表達(dá)，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成；所有生物細(xì)胞都含有這兩類核酸。對于病毒來說，要么只含有DNA，要么只含有RNA，還未發(fā)現(xiàn)既含有DNA又含有RNA的病毒。第五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)核酸的化學(xué)組成核酸是分子量很大的核苷酸高聚物，是由C、H、O、N和P五種元素組成。正象蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合而成一樣，核酸的基本結(jié)構(gòu)單位是單核苷酸。核苷酸水解后產(chǎn)生核苷、磷酸，核苷繼續(xù)水解，得到堿基和戊糖。其結(jié)構(gòu)單元為核苷酸第六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一一、堿基、戊糖與核苷（一）堿基核酸中的堿基有兩類：嘌呤堿和嘧啶堿。常見的嘌呤堿有腺嘌呤(A)和鳥嘌呤（G），它們是嘌呤的衍生物。嘧啶堿基有胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)及胸腺嘧啶(T)，都是嘧啶的衍生物。兩類核酸所含的主要堿基都是4種，所含的兩種嘌呤堿完全相同，即腺嘌呤和鳥嘌呤。但所含的嘧啶堿有所不同，RNA主要含有胞嘧啶和尿嘧啶，大多數(shù)DNA也含胞嘧啶，但不含尿嘧啶。見表。第七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一除上述五種堿基外，在一些核酸中還存在少量其他修飾堿基，也稱為稀有堿基。其中大多數(shù)是堿基的甲基化產(chǎn)物或衍生物。tRNA中的修飾堿基種類較多，如次黃嘌呤、二氫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶（胸腺嘧啶）、4-硫尿嘧啶等。表4-1兩類核酸分子組成的比較堿基核糖磷酸嘌呤嘧啶DNAA,GC,T脫氧核糖磷酸RNAA,GC,U核糖磷酸第八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一（二）戊糖RNA和DNA是因所含的戊糖不同而分類的。RNA中的戊糖是D-核糖，DNA中的戊糖是D-2-脫氧核糖，某些RNA中含少量的甲基化核糖。核酸分子中的戊糖都是β-D-型。第十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一（三）核苷

核苷是堿基與戊糖生成的糖苷，即戊糖的第1位碳原子(C1)分別與嘌呤堿的第9位氮原子N9或嘧啶堿的第1位氮原子N1相連。所以糖與堿基之間的連接鍵是N-C糖苷鍵。在tRNA中存在少量5-核糖尿嘧啶，其C1是與尿嘧啶的第5位碳原子以C－C鍵連接而成的，因?yàn)檫B接方式特殊，也稱為假尿苷。因?yàn)樗焯遣煌?，核苷分為核糖核苷，用單字符號A、G、C、U表示；脫氧核苷，在單字符號前加一小寫的d，如dA、dG、dC、dT。常見的修飾核苷有：二氫尿苷D，假尿苷ψ，次黃苷或肌苷I，黃嘌呤核苷X。第十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一二、核苷酸（一）核苷酸的結(jié)構(gòu)核苷酸是核苷的戊糖上羥基與磷酸形成的酯。核苷酸的核糖有3個自由的羥基（2′，3′,5′），所以可分別生成2′-，3′-，和5′-核苷酸。脫氧核糖上只有2個自由羥基，相應(yīng)的脫氧核苷只能生成3′-和5′-脫氧核苷酸。體內(nèi)的游離核苷酸多為5′-核苷酸，常在其單字符號后添上MP表示單核苷酸，如AMP,GMP，dTMP等。第十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一單核苷酸可以在5′位上進(jìn)一步磷酸化產(chǎn)生5′-二磷酸核苷和5′-三磷酸核苷。如生物體內(nèi)的腺苷酸AMP可與一分子磷酸結(jié)合成腺苷二磷酸（ADP），ADP再與一分子磷酸結(jié)合成腺苷三磷酸（ATP）（圖）。其他單核苷酸可以和腺苷酸一樣磷酸化，產(chǎn)生相應(yīng)的二磷酸或三磷酸化合物。（二）核苷酸的功能在體內(nèi)，核苷三磷酸作為核酸生物合成的原料，此還外在生物體內(nèi)的能量代謝中起著重要的作用。其中ATP在所有代謝途徑化學(xué)能的貯藏和利用中起著關(guān)鍵的作用，稱生物的能量“通用貨幣”。另外ATP還可作為淀粉生物合成中葡萄糖的載體。其他核苷三磷酸還參與特定的代謝過程，如UTP作為葡萄糖載體參與糖原的合成，CTP參加磷脂的合成，GTP參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成等。第十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖4-1核苷酸及其磷酸化合物圖4-2cAMP的結(jié)構(gòu)式第十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一腺苷酸還與維生素PP（尼克酰胺）形成輔酶Ⅰ（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）和輔酶Ⅱ（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸），它們在生物氧化中起傳遞氫的作用。腺苷酸還與黃素形成黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），分子的一半是腺嘌呤二核苷酸，另一半是磷酸核黃素，又稱黃素單核苷酸（FMN）。FAD和FMN也是在生物氧化系統(tǒng)中起傳遞氫的作用。輔酶A分子中也包含腺苷酸結(jié)構(gòu)，還有泛酸，即水溶性B族維生素，以及氨基乙硫醇（H2N-CH2-CH2-SH），后者部分的硫基（－SH）是輔酶A作為?；d體參與多種反應(yīng)的一個重要基團(tuán)，因此，輔酶A常用HSCoA表示。ATP在腺苷酸環(huán)化酶的作用下可以生成3′,5′-環(huán)狀腺苷酸(cAMP)，cAMP具有以下的結(jié)構(gòu)式（圖）。同樣，GTP在鳥苷酸環(huán)化酶的催化下可以生成3′,5′-環(huán)鳥苷酸(cGMP)。第十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一cAMP和cGMP是一些激素等信號分子發(fā)揮生理作用的媒介物,被稱為第二信使。cGMP是cAMP的拮抗物，二者共同在細(xì)胞的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前cAMP及其衍生物已用于臨床，對心絞痛、心肌梗塞等冠心病發(fā)作癥狀有明顯效果。近些年還發(fā)現(xiàn)，一些核苷多磷酸和寡核苷多磷酸類參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。如ppGpp或pppGpp以及pppApp，pppAppp等。許多核苷酸類衍生物可作為抗病毒和抗腫瘤藥物，前者如,5-碘尿苷、阿糖胞苷、阿糖腺苷及多聚肌苷酸和多聚胞苷酸，后者如,5-氟嘧啶、,6-巰基嘌呤等。第十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一三、核酸中核苷酸間的連接實(shí)驗(yàn)證明，DNA和RNA都是沒有分支的多核苷酸長鏈，鏈中前一個核苷酸的3′－羥基和后一個核苷酸戊糖上的5′-磷酸形成酯鍵，借助這種3′5′－磷酸二酯鍵將核苷酸彼此相連，形成核酸鏈。每條線形核酸鏈都有一個5′-末端和一個3′-末端（圖），即如果多核苷酸片段最后一個核苷酸的戊糖的C3′-羥基不再參與3′,5′-磷酸二酯鍵的構(gòu)成，這一端就是3′端，反之，如果其C5′-羥基不再參與磷酸二酯鍵的構(gòu)成，就是5′端，這樣RNA和DNA鏈都有方向性。核酸分子戊糖和磷酸所構(gòu)成的主鏈上的磷酸基是酸性的，在生理pH下帶負(fù)電荷；而側(cè)鏈嘌呤和嘧啶堿基團(tuán)相對不溶于水而具有疏水性質(zhì)。第十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一

多核苷酸鏈的化學(xué)式第二十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)DNA的分子結(jié)構(gòu)

一、DNA的一級結(jié)構(gòu)DNA的一級結(jié)構(gòu)就是指DNA分子中通過3′5′－磷酸二酯鍵連接的核苷酸排列順序。任何DNA分子的糖-磷酸的連接總是一樣的,不同核酸之間的千差萬別,只在于每個糖環(huán)上連接的堿基排列順序不同,所以核酸的一級結(jié)構(gòu)也稱為核苷酸序列或堿基序列。生物之具有多樣性就在于它們的DNA中核苷酸序列或堿基序列的變化多端，也即它們的基因組結(jié)構(gòu)不同。無論是DNA，還是RNA，在它們的生物合成的聚合反應(yīng)中，都是按照5′3′方向進(jìn)行的，因此沒有特別指定時，核苷酸序列都是按照5′3′方向讀寫。第二十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一a基因組與染色體所謂基因組是指一個獨(dú)立生物體所包含的全部遺傳信息。在細(xì)胞中遺傳信息儲存在稱為染色體的基因結(jié)構(gòu)體上，每條染色體含有一個DNA分子。一般細(xì)菌在單條環(huán)狀染色體上攜帶它們的全部基因，每條染色體只有一份拷貝，也即其細(xì)胞或個體每個基因有一份拷貝，為單倍體。高等生物的染色體為線狀的，不同生物有不同數(shù)目的染色體，通常每條染色體包含有兩份拷貝，因而每個基因有兩份拷貝，為雙倍體。偶爾也發(fā)現(xiàn)有些生物細(xì)胞的每條染色體有兩份以上的拷貝，如三份拷貝的，稱三倍體，四份拷貝的，稱四倍體等等。所有基因均為單拷貝的一套完整的基因組稱單倍體基因組，因此，通常生物體均含有兩個或兩個以上拷貝的完整基因組。需要注意的是，單倍體細(xì)胞的一些基因可能有多份拷貝，如具單條染色體的大腸桿菌E.coli其延長因子EF-Tu基因有兩份拷貝，核糖體RNA基因有7份拷貝，酵母Saccharomycescerevisiae的單倍體細(xì)胞中有多達(dá)40%的基因是雙重拷貝的。第二十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一b原核生物基因組的特點(diǎn)原核生物基因組DNA分子較小，其基因分布的主要特點(diǎn)有:①每個基因在基因組中出現(xiàn)僅一次或幾次，而且主要為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，其次為調(diào)控序列。②功能關(guān)聯(lián)的基因常集中在一起，形成一個功能單位在DNA分子的特定部位，相關(guān)結(jié)構(gòu)基因常轉(zhuǎn)錄成一個mRNA。③有重疊基因存在，同一段DNA可編碼多種蛋白質(zhì)分子，這種現(xiàn)象見于病毒、線粒體和葉綠體及質(zhì)粒DNA分子。第二十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一c真核生物基因組的特點(diǎn)真核生物的基因一般分布在若干條染色體上，基因組比原核生物復(fù)雜龐大，體細(xì)胞基因組是雙倍體，配子細(xì)胞為單倍體。其基因組組成特點(diǎn)有:①重復(fù)序列真核生物DNA分子中特定堿基序列重復(fù)出現(xiàn)的頻率相差很大，可分為:單拷貝序列在整個基因組中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。大多數(shù)蛋白質(zhì)(包括珠蛋白，卵清蛋白、絲心蛋白和酶蛋白等)的基因在單倍體中都是單拷貝序列。單拷貝序列在人基因組中約占DNA總量的65%，在高等生物中占總DNA的20%。第二十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一中度重復(fù)序列在DNA分子中可重復(fù)幾十到數(shù)萬次，長度300-7000bp(堿基對)，大多與單拷貝基因間隔排列。rRNA基因、tRNA基因和某些蛋白質(zhì)基因?qū)僦卸戎貜?fù)序列，還有許多中度重復(fù)非編碼DNA由長散布元件(LINE)構(gòu)成，哺乳動物基因組中有2到3萬拷貝的LINE（L1）家族，一個完整的L1元件約7000bp，包含兩個編碼序列，然而絕大多L1元件要短。人的DNA約25%屬中度重復(fù)序列。第二十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一高度重度序列可重復(fù)幾十萬到上百萬次，它們一般位于著絲粒和端粒處，不轉(zhuǎn)錄，可能與染色體結(jié)構(gòu)的形成及基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。人的DNA中有10%是由高度重復(fù)序列構(gòu)成的。許多高度重度序列為短散布元件（SINE）,最為人熟知的SINE是300bp的Alu元件，因被限制性內(nèi)切酶Alu切成170bp而得名，在哺乳動物及人類單倍體基因組中重復(fù)30-50萬次。衛(wèi)星DNA，不像LINE與SINE散布在整個基因組中，而是高度重復(fù)DNA以長的串聯(lián)重復(fù)簇出現(xiàn)，并總是緊緊卷曲在異染色質(zhì)中，因此也是惰性的。其量在不同生物中是高度可變的。短的串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成的DNA稱小衛(wèi)星或可變數(shù)的串聯(lián)重復(fù)（VNTR)，其拷貝數(shù)遠(yuǎn)比衛(wèi)星DNA少。人與人之間的短隨機(jī)重復(fù)片段在總長度上有很大的不同，這使得我們可以區(qū)分每個人，并用于司法鑒定。除了重復(fù)序列外，真核生物細(xì)胞還有假基因，這是正?；虻娜毕菪涂截?，它的缺陷阻止它被表達(dá)。在細(xì)胞中假基因只以一份或兩份拷貝存在，占總DNA的極小部分。第二十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一②在結(jié)構(gòu)基因中編碼片段被不編碼片段隔開，基因中不編碼的居間片段稱為“內(nèi)含子”(intron)，而編碼的片段則稱作“外顯子”(exons)。內(nèi)含子將編碼基因隔成不連續(xù)基因或斷裂基因(splitgene)。如雞卵清蛋白基因含有7個內(nèi)含子,它們把卵清蛋白基因分割成8個外顯子（圖4-4），基因共有7700bp,而其mRNA只有1859個核苷酸。各類真核生物基因中的內(nèi)含子數(shù)目、位置和占基因總長的比例都不同，但組蛋白基因沒有內(nèi)含子。③基因家族許多來源相同，結(jié)構(gòu)相似，功能關(guān)聯(lián)的基因或串聯(lián)排列集中成基因簇，或分散在不同部位。前者如rRNA、組蛋白基因，后者如珠蛋白、生長激素等基因。第二十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖4-4卵清蛋白基因白色代表內(nèi)含子，用A、B、C……表示，黑色代表外顯子，用1、2、3……表示?；蚩傞L7700bp,被7個不編碼區(qū)分割成8個編碼片段，編碼部分的總長度為1872bp，數(shù)字為該片段的長度，以bp表示。第二十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一因?yàn)?成熟"的mRNA只能與為其編碼的基因中編碼區(qū)結(jié)合形成DNA-RNA雜交分子，不能結(jié)合的內(nèi)含子區(qū)便突出成環(huán)(圖4-5)，可在電鏡下清楚看到。圖4-5雞卵清蛋白基因的結(jié)構(gòu)左側(cè)的電子顯微鏡照片顯示卵清蛋白基因克隆與卵清蛋白mRNA間形成的復(fù)雜“雜交分子”結(jié)構(gòu)；右側(cè)為該照片的示意圖,從環(huán)形突起部分可看出7個內(nèi)含子（A到G）的位置。第二十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一二、DNA的空間結(jié)構(gòu)肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以及噬菌體感染實(shí)驗(yàn)使科學(xué)家們相信DNA是遺傳物質(zhì)，但遺傳信息是如何貯存在DNA中，仍難以推測。1953年，Chargaff等應(yīng)用色譜法對多種生物DNA的堿基組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)DNA中的腺嘌呤數(shù)目與胸腺嘧啶的數(shù)目相等，胞嘧啶（包括5-甲基胞嘧啶）的數(shù)目和鳥嘌呤的數(shù)目相等。后來又有人證明腺嘌呤和胸腺嘧啶間可以生成兩個氫鍵；而胞嘧啶和鳥嘌呤之間可以允許生成3個氫鍵。在前人工作的基礎(chǔ)上，Waston和Crick于1953年的4月25日在《Nature》發(fā)表了題為“核酸的分子結(jié)構(gòu)-脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)”的文章，闡述了雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)。后人的許多工作證明，這個模型基本上是正確的。(2)DNA的二級結(jié)構(gòu)①X射線衍射1951年，RosalindFranklin和MauriceWilkins利用X射線衍射圖譜分析了DNA的晶體。X射線衍射數(shù)據(jù)說明DNA中含有兩條或兩條以上具有螺旋結(jié)構(gòu)的多核苷酸鏈，而且沿纖維長軸有0.34nm和3.4nm兩個重要的周期性變化。②關(guān)于堿基成對的證據(jù)③電位滴定行為第三十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖X射線衍射第三十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一b雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的內(nèi)容①DNA分子是由兩條方向相反的平行多核苷酸鏈構(gòu)成的，兩條鏈的糖-磷酸主鏈都是右手螺旋，有一共同的螺旋軸，一條鏈的方向是5′-3′，另一條鏈則是3′-5′。螺旋表面有一條大溝和小溝。②兩條鏈上的堿基均在主鏈內(nèi)側(cè)，而磷酸及戊糖位于外側(cè)，彼此以磷酸二酯鍵相連接，形成DNA分子的骨架，兩條鏈借堿基之間的氫鍵和堿基之間堆積力牢固地連為一體。一條鏈上的A與另一條鏈上的T配對，G一定與C配對。A與T配對形成兩個氫鍵，G與C配對形成3個氫鍵（圖）。氫鍵維持雙螺旋的橫向穩(wěn)定性，堿基堆積力維持雙螺旋的縱向穩(wěn)定性。磷酸殘基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的正離子形成的離子鍵也穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)。正是這三種作用使雙螺旋結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定。由于堿基對的大小基本相同，所以無論堿基序列如何，雙螺旋DNA分子整個長度的直徑相同，螺旋直徑為2nm。

③成對堿基大致處于同一平面，該平面與螺旋軸基本垂直。糖環(huán)平面與螺旋軸基本平行，磷酸基在糖環(huán)的外側(cè)。相鄰堿基對平面間的距離為0.34nm。第三十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖4-7DNA螺旋表面的大溝和小溝第三十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖4-8由Waston和Crick確定的堿基對中的氫鍵圖形1A＝0.1nm第三十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一（二）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上DNA的雙螺旋進(jìn)一步折疊纏繞成更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。

1.原核生物DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

原核生物DNA二級結(jié)構(gòu)多為環(huán)狀雙螺旋，在細(xì)胞內(nèi)雙螺旋可進(jìn)一步扭曲形成超螺旋。超螺旋DNA是如何形成的呢?在DNA中，從雙螺旋的一端看過去，一個堿基對相對于下一個堿基對旋轉(zhuǎn)了36°，每一螺旋(旋轉(zhuǎn)360°)含有10個堿基對，具有這樣結(jié)構(gòu)的環(huán)形DNA分子稱為處于松弛狀態(tài)的分子。如果將之切斷，使變成線性雙螺旋分子，然后，設(shè)想用兩手分別捏住線性DNA分子的兩端，捻動其中的一端或兩端同時向相反方面捻動，雙螺旋形可以形成過旋或欠旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)向右捻動時，等于緊旋，相對于它的松弛狀態(tài)這時DNA分子處于一種超過原有螺旋狀態(tài)的狀態(tài)，稱為過旋。因DNA分子的兩端被固定，捻動施加的力釋放不掉，所以過旋分子增加了額外的扭轉(zhuǎn)張力。當(dāng)將處于松弛狀態(tài)的雙螺旋向左捻動時，等于解旋，相對于它的松弛狀態(tài)此時DNA處于一種沒有達(dá)到原有旋轉(zhuǎn)狀態(tài)的狀態(tài)，稱為欠旋。同樣，因DNA分子的兩端被固定，欠旋也給雙螺旋DNA分子增加了額外的應(yīng)力。處于松弛型的環(huán)狀DNA的鏈環(huán)數(shù)如圖所示。第三十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第三十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一

當(dāng)將線性過旋或欠旋的雙螺旋DNA形成一個環(huán)時，就會因要抵消過旋或欠旋所增加的額外應(yīng)力自動形成額外的超螺旋。過旋DNA會自動形成額外左手螺旋，這樣的超螺旋稱為正超螺旋；而欠旋DNA形成額外右手螺旋，稱為負(fù)超螺旋(見圖)。生物體內(nèi)大多數(shù)DNA分子都有負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，還未發(fā)現(xiàn)正超螺旋DNA。有的DNA分子的超螺旋數(shù)可達(dá)20或30。典型的細(xì)菌染色體每1000個堿基對就含有5個超螺旋，而真核生物的DNA含有的超螺旋更多。第三十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一

2．真核生物DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝真核細(xì)胞染色體DNA為線形雙螺旋，與組蛋白共同組成核小體(nucleosome)，是染色體的基本組成單位。核小體中的組蛋白有五種，分別為H2A、H2B、H3、H4和H1。由H2A、H2B、H3和H4各兩分子形成八聚體核心，DNA線形雙螺旋(約146bp)盤繞在該核心上形成核小體核心顆粒，核小體核心顆粒之間再由連接DNA(約60bp)和組蛋白H1前后連接為串珠狀結(jié)構(gòu)(圖2—8)。串珠狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步盤旋折疊，形成染色質(zhì)纖維，后者再經(jīng)多次折疊、盤曲，最終形成染色單體這一獨(dú)特的超螺旋形式。真核細(xì)胞的基因組DNA經(jīng)這種包裝后可高度壓縮，使很長的DNA分子被有規(guī)律地裝入細(xì)胞核內(nèi)。第三十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第三十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第四十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一三、DNA的功能DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，DNA分子中核苷酸序列中儲存了生物的全部遺傳信息；DNA可以通過自我復(fù)制將儲存的遺傳信息忠實(shí)地從一代細(xì)胞傳給下一代細(xì)胞；DNA儲存的遺傳信息還可通過轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)?？梢奃NA的核苷酸序列決定細(xì)胞內(nèi)所有的RNA核苷酸序列和蛋白質(zhì)的氨基酸序列。遺傳學(xué)上所指的基因(gene)就是DNA分子中的某一功能片段，它可以通過復(fù)制遺傳給子代，還可以通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，保證支持生命活動的各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)有序地合成；而基因組(genome)則是指一個生物體的全部基因序列。綜上所述，DNA是生物遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動和生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)。第三節(jié)RNA的分子結(jié)構(gòu)與功能RNA是由AMP、GMP、CMP和UMP四種核苷酸為基本單位，以3’，5，-磷酸二酯鍵連接而成的多聚核苷酸鏈。有些RNA分子中含有少量的稀有堿基和稀有核苷。RNA分子一般比DNA小得多，由數(shù)十個至數(shù)千個核苷酸組成，通常都是以單鏈形式存在。但RNA的多核苷酸鏈可以回折，通過A=U配對，C三G配對形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)，而非互補(bǔ)區(qū)則膨出成環(huán)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop)

第四十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一RNA在細(xì)胞核中合成，主要分布在胞質(zhì)中。RNA的種類、結(jié)構(gòu)多種多樣，它的主要作用是將DNA的遺傳信息表達(dá)為蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸序列。根據(jù)在蛋白質(zhì)的合成中所起的作用不同，RNA主要分為三類：信使RNA(messengerRNA，mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transferRNA，tRNA)和核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)。mRNA可直接傳遞DNA分子上的遺傳信息，是蛋白質(zhì)合成的直接模板；tRNA攜帶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)合成的原料——氨基酸；rRNA與蛋白質(zhì)組成核糖體，是細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的場所。一、mRNA和hnRNAmRNA是一種將DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)換為特定序列氨基酸的多聚核苷酸，mRNA種類很多，但壽命很短，大多為1-3min，更新速度快。它的數(shù)量也很少，僅占RNA總量的3％左右。絕大多數(shù)真核生物mRNA的3′端有一段長度100-200個堿基的多聚腺苷酸(po1yA)，po1yA結(jié)構(gòu)與mRNA的半衰期有關(guān)。原核生物mRNA的3′端一般無或者有小于10個bp的polyA序列。真核生物mRNA5’端有一個7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸的結(jié)構(gòu)，稱為帽子結(jié)構(gòu)（圖）。這種結(jié)構(gòu)有抗5’-核酸外切酶降解的作用，與蛋白質(zhì)生物合成的正確起始有關(guān)。第四十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖mRNA真核生物的帽子結(jié)構(gòu)第四十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第四十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一真核生物mRNA只為一條肽鏈編碼，稱單順反子，原核生物mRNA可為一條或多條肽鏈編碼，為二條以上編碼的稱多順反子。真核生物mRNA中有編碼區(qū)和非編碼區(qū)，編碼區(qū)堿基序列決定氨基酸序列，非編碼區(qū)與蛋白質(zhì)合成調(diào)控有關(guān)。原核生物mRNA的5’端有一不編碼的前導(dǎo)序列以及在多順反子之間有不翻譯區(qū)。原核生物mRNA在轉(zhuǎn)錄形成的同時就結(jié)合核糖體，進(jìn)行著翻譯過程，指導(dǎo)合成多肽鏈。真核生物轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中進(jìn)行，首先形成分子大小不一的RNA，稱為核不均一RNA（hnRNA），它們隨后被加工為成熟的mRNA，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)參加蛋白質(zhì)合成。真核生物mRNA具有二級結(jié)構(gòu)，如鴨珠蛋白mRNA有45-60％的核苷酸處于雙螺旋之中；兔珠蛋白mRNA有55-62％的核苷酸的堿基配對。第四十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一二、tRNAtRNA在三類主要RNA中相對分子質(zhì)量最小，僅由70～90個核苷酸組成，約占細(xì)胞總RNA的15％。tRNA的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸到核糖體上，參與多肽鏈合成。tRNA通過其共有的3’CCA一0H末端結(jié)構(gòu)與某一特定的氨基酸連接，并通過反密碼子與mRNA分子上的密碼子互補(bǔ)配對，使轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸按照。mRNA的遺傳信息依次排列。細(xì)胞內(nèi)tRNA的種類很多，但都具以下類似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①分子中的雙螺旋區(qū)稱臂，不能配對的部分稱環(huán)，tRNA-般由四臂四環(huán)組成。②三葉草的葉柄稱氨基酸臂，由7個堿基對組成，富含G—C，其3′末端為CCA-OH結(jié)構(gòu)，用來連接活化的氨基酸。③氨基酸臂對面的環(huán)稱反密碼子環(huán)，由7個核苷酸組成，環(huán)中央的三個堿基是與三聯(lián)體密碼相對應(yīng)的反密碼子。反密碼子常出現(xiàn)次黃苷酸。④左臂連接一個二氫尿嘧啶環(huán)(也稱為D環(huán)),由8－12個核苷酸組成，環(huán)上有二氫尿嘧啶。⑤右側(cè)有一個TψC環(huán)（因環(huán)中有TψC序列而得名）和一個核苷酸數(shù)變化較大的可變環(huán)（也稱額外環(huán)）。第四十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖4-16tRNA的二級結(jié)構(gòu)通式在tRNA中加入的核苷酸,其命名如下:以加入的核苷酸前一個核苷酸的序號加冒號后再編號.例如,20:1和20:2表示在第20位核苷酸之后加入的第一個和第二個核苷酸。圖中粗黑圓圈表示所有tRNA在這個位置上的核苷酸都是固定不變的,或者變化較小，橢圓表示并非所有tRNA在這個位置上都有核苷酸存在。例如,在第18,19往前的兩個核苷酸.在第20位后的兩個核苷酸以及在可變環(huán)中的核苷酸(其中有17個核苷酸可有可無)。Ⅰ、二氫尿嘧啶環(huán);Ⅱ、反密碼子環(huán);Ⅲ、可變環(huán);Ⅳ、TψC環(huán)第四十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一酵母苯丙氨酸t(yī)RNA的三級結(jié)構(gòu)為倒L形．其大小為6.5×7.5×2.5nm。氨基酸臂與TψC臂形成一個連續(xù)的雙螺旋區(qū)．構(gòu)成字母L下面的一橫。而二氫尿嘧啶環(huán)與反密碼環(huán)構(gòu)成字母L的—豎。二氫尿嘧啶環(huán)和TψC環(huán)組成字母L的拐角。見圖4-17。圖4-17酵母苯丙氨酸-tRNA三級結(jié)構(gòu)示意圖第四十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一三、rRNA

rRNA是構(gòu)成核糖體的RNA，也是細(xì)胞內(nèi)主要的和分子量較大的一類DNA,大約占細(xì)胞RNA總量的80%。核糖體是蛋白質(zhì)生物合成場所，可分為大小兩個亞基,其亞基組成及rRNA的種類和沉降系數(shù)如下表所示。原核生物核糖體中蛋白質(zhì)占1/3，rRNA占2/3。真核生物核糖體蛋白質(zhì)和rRNA各占一半。目前多種rRNA的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，其特定堿基序列所具有的功能也在不斷被揭示。70S80S原核生物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA16S18S5S、23S5S、5.8S、28S第四十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第五十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一四、非編碼小RNA

細(xì)胞內(nèi)的不同部位還存在一類被稱之為非編碼小RNA(smallnon-messengerRNA，snmRNAs)的小分子RNA。近年來對snmRNAs進(jìn)行了廣泛深入的研究，并由此產(chǎn)生了RNA組學(xué)(RNomics)，“RNA組學(xué)”就是從基因組水平研究細(xì)胞中snmRNAs結(jié)構(gòu)與功能的一門新的科學(xué)。snmRNAs在基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工及翻譯中發(fā)揮重要組織和調(diào)控作用，形成了細(xì)胞中高度復(fù)雜的RNA網(wǎng)絡(luò)。(一)核(內(nèi))小RNA核小RNA(smallnuclearRNA，snRNA)，存在于細(xì)胞核中，此類中的一些RNA具有催化活性，與核內(nèi)蛋白質(zhì)共同組成RNA剪接體，在hnRNA轉(zhuǎn)錄后加工中起重要作用，其次在控制細(xì)胞分裂和分化，協(xié)調(diào)胞內(nèi)物質(zhì)傳輸?shù)戎衅鹱饔谩?二)核仁小RNA核仁小RNA(smallnLmleolarRNA，snoRNA)，存在于核仁，在rRNA前體的剪接加工和轉(zhuǎn)錄后修飾過程中起重要作用，主要與2-O-核糖甲基化及假尿嘧啶核苷的形成有關(guān)。第五十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一(三)胞質(zhì)小RNA胞質(zhì)小RNA(smallcytoplasmicRNA，scRNA)的種類很多，其中7SLRNA與蛋白質(zhì)一起組成信號識別顆粒(SRP)，SRP參與分泌性蛋白質(zhì)的合成。(四)催化性小RNA催化性小RNA(smallcatalyticRNA)主要參與生物體內(nèi)RNA前體的加工剪接。20世紀(jì)80年代初，T．R．Cech在研究四膜蟲的rRNA剪接加工過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)除去所有蛋白質(zhì)后rRNA前體仍可進(jìn)行剪接，表明RNA分子本身具有酶的催化作用，后將這類具有催化功能的小RNA命名為“ribozyme'’，譯為“核酶”。人工設(shè)計(jì)的核酶在臨床上已被試用于治腫瘤和病毒性疾病等。(五)小干擾RNA小干擾RNA(smallinterfer’ingRNA，siRNA)，是生物宿主對外源侵入的基因表達(dá)的雙鏈RNA進(jìn)行切割所產(chǎn)生的特定長度和特定核酸序列的小片段RNA，siRNA可以與外源基因表達(dá)的mRNA相結(jié)合，然后降解這些mRNA分子，使其失去合成蛋白質(zhì)的能力，從而導(dǎo)致基因沉默，這一現(xiàn)象被稱為RNA干擾。siRNA能特異并高效地抑制基因的活性，因此RNA干擾技術(shù)已經(jīng)成為一項(xiàng)常規(guī)的基因功能研究手段。

第五十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一(六)微小RNA．微小RNA(microRNA，miRNA)，是一種單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，能夠與那些和它的序列互補(bǔ)的mRNA分子甚至特定的DNA片段相結(jié)合，導(dǎo)致基因的沉默。據(jù)推測，mRNA調(diào)節(jié)著人類1/3的基因。研究表明miRNA在癌癥、心臟病、艾滋病等各種疾病的治療中起到一定的作用。第四節(jié)核酸的理化性質(zhì)一、核酸的一般理化性質(zhì)

DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末;RNA和DNA都是極性化合物，都微溶于水而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。常用乙醇從溶液中沉淀核酸。它們的鈉鹽比自由酸易溶于水。高分子溶液比普通溶液粘度要大得多，不規(guī)則線團(tuán)分子比球形分子的粘度大，而線形分子的粘度更大。由于天然DNA分子量大，分子細(xì)長，長度可達(dá)幾厘米，因此，即使是極稀的DNA溶液，粘度也極大。RNA分子DNA分子短得多，呈無定形。RNA的粘度比DNA粘度小。當(dāng)DNA溶液加熱，或在其他因素作用下發(fā)生螺旋→線團(tuán)轉(zhuǎn)變時，粘度降低。所以可用粘度作為DNA變性的指標(biāo)。第五十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一核酸分子高度不對稱，因此核酸的旋光性很強(qiáng)，旋光方向?yàn)橛倚?。這是核酸的一個重要特性。DNA分子的大小可用長度(m)、相對分子質(zhì)量或堿基對(bp)來表示。1mDNA=2000×103=3×103bp二、核酸的紫外吸收性質(zhì)堿基的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)為共軛體系，可強(qiáng)烈吸收260-29Onm波段紫外光，其最高的吸收峰接近260nm(圖4-19)，蛋白質(zhì)由于芳香族氨基酸殘基而在280nm左右有最大吸收峰。利用這一特性，可以鑒別核酸樣品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。還可以利用核酸的這一特性來定位測定它在細(xì)胞和組織中的分布，細(xì)胞的紫外光照相主要是利用核酸的強(qiáng)烈吸收紫外光作用，也可利用這種性質(zhì)測定嘌呤或嘧啶衍生物在純?nèi)芤褐械暮?每摩爾這種物質(zhì)在一定pH條件下的紫外吸收值為常數(shù))，以及它們在色譜和電泳譜上的位置。常利用核酸電泳后在紫外燈下顯出清晰的熒光帶，可方便地進(jìn)行核酸操作。第五十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖DNA的紫外吸收光譜1.天然DNA2.變性DNA3.核苷酸總吸收值第五十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一三、核酸的兩性性質(zhì)含有酸性的磷酸基和堿性的含氮堿基，既可解離成陰離子又可解離成陽離子。堿基的解離由于嘧啶和嘌呤化合物雜環(huán)中的氮原子以及各種取代基具有結(jié)合和釋放質(zhì)子的能力，所以含氮堿基既有堿性解離又具有酸性解離的性質(zhì)。例如胞嘧啶環(huán)上3位“—N＝”轉(zhuǎn)變?yōu)閹д姾傻摹啊狽+H＝”，2位的烯醇式羥基可釋放質(zhì)子，呈酸性。第五十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一2核苷的解離核苷中的糖對堿基解離有一定的影響，核糖上的羥基也可發(fā)生解離。3核苷酸的解離含有磷酸，使核苷酸具有較強(qiáng)的酸性。磷酸可發(fā)生兩級解離，分別稱為第一磷酸基團(tuán)解離（pKIP)和第二磷酸基團(tuán)解離（pKIIP)第五十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一4核酸分子的解離核酸分子多核苷酸鏈中，除末端磷酸殘基外，磷酸二酯鍵中的磷酸殘基只有一個解離常數(shù)（pKa=1.5)，因分子中磷酸殘基pKa較低，當(dāng)溶液pH值高于4時，核酸分子幾乎全部解離呈多陰離子狀態(tài)，故可把核酸看成具有較強(qiáng)酸性的多元酸?？膳c金屬離子成鹽，也可與堿性蛋白結(jié)合。堿基解離與pH有關(guān)，堿基解離又影響堿基對之間氫鍵性質(zhì)，因此pH影響雙螺旋堿基對間氫鍵穩(wěn)定性。DNA在pH4.0～11.0之間穩(wěn)定。5核苷酸與核酸的等電點(diǎn)核酸和核苷酸既有酸性磷酸基,又有堿性基團(tuán),所以是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下，可以解離而帶電荷，因此都有一定的等電點(diǎn)，RNA等電點(diǎn)為pH2.0～2.5，DNA等電點(diǎn)為pH4.0～4.5第五十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一四、核酸的顏色反應(yīng)由于核酸的磷酸基酸性較強(qiáng)，常表現(xiàn)為酸性，能與Na＋、K＋、Mg＋等金屬離子結(jié)合成鹽，也易與堿性化合物結(jié)合成復(fù)合物，如與甲苯胺藍(lán)、派羅紅、甲基綠等堿性染料結(jié)合。其中甲苯胺藍(lán)能使DNA、RNA都染上藍(lán)色，派羅紅專染RNA成紅色，甲基綠專染DNA成綠色，故細(xì)胞組織化學(xué)中利用此性質(zhì)用于核酸染色。1地衣酚反應(yīng)

D-核糖與濃鹽酸和苔黑酚(甲基間苯二酚)共熱產(chǎn)生綠色，在670nm有最大吸收。第五十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一2二苯胺反應(yīng)D-2－脫氧核糖核酸和二苯胺一同加熱產(chǎn)生藍(lán)紫色，在595nm有最大吸收。可利用這兩種糖的特殊顏色反應(yīng)區(qū)別DNA和RNA或做為二者定量測定的基礎(chǔ)。3鉬藍(lán)反應(yīng)用強(qiáng)酸將核酸樣品高溫消化，使有機(jī)磷變?yōu)闊o機(jī)磷，進(jìn)一步與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸，經(jīng)還原生成藍(lán)色復(fù)合物，650nm測定第六十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一第六十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一五、核酸的變性和復(fù)性(一)核酸的變性天然的雙螺旋DNA和具有雙螺旋區(qū)的RNA溶液在一些物理化學(xué)因素的作用下，氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，雙螺旋解開，變成無規(guī)線團(tuán)狀態(tài)的現(xiàn)象稱為DNA變性。DNA變性后會發(fā)生性質(zhì)改變，如生物學(xué)功能部分或全部喪失，紫外吸收增強(qiáng)（圖）、粘度下降，浮力密度升高等。變性主要是二級結(jié)構(gòu)的改變引起的，并不涉及磷酸二酯鍵斷裂。引起核酸變性的理化因素有：加熱、有機(jī)溶劑、酸、堿等。核酸變性后由于原雙鏈中向內(nèi)互補(bǔ)的堿基對拆離暴露，故對260nm紫外吸收值增高，該現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。反之為減色效應(yīng)。DNA的加熱變性從開始解鏈到完全解鏈，是在一個相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成的，因此加熱DNA溶液達(dá)一定溫度時，260nm的吸光度驟然增加，最后達(dá)到最大值，其過程類似與晶體的熔解，以溫度對其紫外吸收值作圖得一曲線，將紫外吸收的增加值達(dá)最大增加值一半時的溫度值稱熔解溫度(Tm)(圖)，即50%DNA變性時溫度。第六十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖DNA的熔點(diǎn)第六十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一影響變性溫度的因素有：①三個氫鍵的G-C對與二個氫鍵的A-T對相對含量，DNA鏈中G-C對含量愈高,亦愈高反之則低。有經(jīng)驗(yàn)公式為:.②溶液的離子強(qiáng)度可影響，離子強(qiáng)度高，升高，因?yàn)镈NA鏈上解離帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)與介質(zhì)中正離子形成離子鍵，穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)。離子強(qiáng)度較低的介質(zhì),較低。在純水中，DNA在室溫下即可變性。DNA制品不應(yīng)保存在極稀的電解質(zhì)液中。RNA也具有螺旋→線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變。但由于RNA只有局部的雙螺旋區(qū)，所以這種轉(zhuǎn)變不如DNA那樣明顯。變性曲線也不那么陡，值較低。③溶液的pH，高pH下堿基廣泛失去質(zhì)子，氫鍵形成的能力喪失。pH大于11.3時,DNA完全變性。pH低于5.0時，DNA易脫嘌呤。對單甲酰胺、尿素、甲醛等可破壞氫鍵,妨礙堿基堆積,使下降,常使用作變性劑.第六十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一(二)核酸的復(fù)性在適當(dāng)條件下，變性DNA分開的兩條互補(bǔ)鏈可重新經(jīng)由氫鍵連接而形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程叫復(fù)性(renaturation)。復(fù)性后DNA的一系列理化性質(zhì)得到恢復(fù)，如粘度增高，生物活性部分恢復(fù)，260nm紫外吸收降低到原來變性前的水平。變性核酸復(fù)性時需緩慢冷卻，故又稱退火。復(fù)性時核酸單鏈隨機(jī)碰撞，不能形成堿基配對或只形成局部堿基配對時，在較高的溫度下兩鏈重新又分離,經(jīng)多次試探性碰撞，堿基配對正確，才能形成完整的雙螺旋（圖）。如果復(fù)性過快，單鏈上堿基來不及識別配對，則仍為單鏈。核酸復(fù)性時，溫度不宜過低。一般認(rèn)為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件。第六十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一圖核酸的變性與復(fù)性過程第六十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一(三)核酸雜交在退火條件下，不同來源的DNA由于某區(qū)域堿基互補(bǔ)，成雙鏈，或DNA單鏈和RNA鏈的區(qū)域性堿基互補(bǔ)形成DNA-RNA雙鏈雜合的過程稱核酸雜交，或分子雜交。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基序列完全互補(bǔ)，只要有一定同源序列（不同來源）的單鏈彼此間有一定程度的互補(bǔ)序列，就可形成。核酸雜交可在液相或固相載體上進(jìn)行，硝酸纖維素膜常作為載體。核酸雜交廣泛用于進(jìn)行基因定位，確定基因拷貝數(shù)等，使用天然的或人工合成的一段合適的DNA或RNA單鏈，經(jīng)放射性同位素或熒光標(biāo)記，通過雜交可以在許多其他DNA片段中檢出一個特殊DNA片段，這種標(biāo)記的互補(bǔ)核酸鏈稱做探針。雜交后通過檢測標(biāo)記的位置就可找到相應(yīng)特定的核酸。第六十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一用探針直接與菌落或組織細(xì)胞中的核酸雜交，因未改變核酸所在的位置，稱原位雜交技術(shù)。將核酸直接點(diǎn)在膜上，再與探針雜交稱點(diǎn)雜交，使用狹縫點(diǎn)樣器時，亦稱狹縫印跡雜交。該技術(shù)主要用于分析基因拷貝和轉(zhuǎn)錄水平的變化，亦可用于檢測病源微生物和生物制品中的核酸污染狀況。英國生物學(xué)家Southern提出一種方法，將電泳變性后的DNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上，再進(jìn)行分子雜交，此法稱為Southern印跡雜交（Southernblotting）。后來Alwine提出將RNA經(jīng)電泳變性后轉(zhuǎn)移至纖維素膜上再進(jìn)行雜交的方法，被戲稱為Northern印跡雜交（Northernblotting）。通過抗體與抗原結(jié)合的方法來分析蛋白質(zhì)，被稱為Western印跡雜交（Westernblotting）。分子雜交技術(shù)還可以用于檢出特殊RNA，依靠這些技術(shù)可以分離和鑒定基因和RNA。這種技術(shù)的發(fā)展和完善，已經(jīng)可以用來在一根毛發(fā)的基礎(chǔ)上證實(shí)某個人是否在犯罪現(xiàn)場，或者某個個體在臨床癥狀發(fā)生幾十年前預(yù)測它可能發(fā)生的疾病。因此，核酸的雜交技術(shù)在分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用極為廣泛。第六十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一六、核酸的分離純化與測定一核酸的提取

應(yīng)注意保持核酸的完整性，盡量降低核酸酶的活性，如加檸檬酸鈉、EDTA等抑制劑或去激活劑；防強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的降解作用；防高溫、劇烈攪拌等。1DNA提取

核蛋白（DNP）在核內(nèi)，先提取DNP。破碎細(xì)胞后，用1～2mol/LNaCl液提取DNP,稀釋至0.14mol/L使DNP沉淀出來，反復(fù)再溶解再沉淀以進(jìn)一步純化，加十二烷基磺酸鈉使蛋白變性沉淀，而DNA呈溶解狀態(tài)，離心取上清，加乙醇或乙醚可得纖維狀DNA2RNA提取先離心分離有關(guān)細(xì)胞器，再從細(xì)胞器中提取某種RNA，從核糖體、從細(xì)胞質(zhì)、從多聚核糖體提，用酚法，先用異硫氰酸胍等使蛋白變性，再用苯酚和氯仿多次除蛋白，得RNA。二核酸的分離純化密度梯度離心、羥基磷灰石或甲基白蛋白硅藻土柱色譜純化DNA。密度梯度離心、多種柱色譜法純化RNA。第六十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期一七、核酸的測定

1核酸含量的測定（1）紫外吸收法根據(jù)核酸的紫外吸收性質(zhì)進(jìn)行的含量測定，靈敏度高，但有干擾。（2）定磷法純的核酸含磷量9.5%，通過鉬藍(lán)反應(yīng)生成鉬藍(lán)化合物，在650～660nm比色測定，算出總含磷量，減去無機(jī)磷的量，即為核酸磷的量，乘以10.5即得核酸含量。（3）定糖量根據(jù)地衣酚反應(yīng)生成綠色物質(zhì)，在670～680nm比色測定，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得樣品RNA含量；根據(jù)二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在595nm比色測定，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得樣品DNA含量。2核酸純度的測定(1)紫外吸收法純DNA的A260/A280為1.8，純RNA的A260/A280為2.0，通常用A260