抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用

本章提要抗體的制備與應(yīng)用抗血清的制備單克隆抗體的制備基因工程抗體催化性抗體單抗的醫(yī)學應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)原理抗原抗體反應(yīng)特點常見免疫分析方法沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)免疫標記技術(shù)補體參與的抗原抗體反應(yīng)免疫分析靈敏度本章小結(jié)課后思考題2011春夏當前第1頁\共有103頁\編于星期五\19點7.1.1抗血清的制備抗原的準備免疫動物動物的選擇免疫途徑免疫劑量與周期動物采血法抗血清的純化與保存抗血清的鑒定2011春夏當前第2頁\共有103頁\編于星期五\19點抗血清與多克隆抗體抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫實驗動物，可獲得含有特異性抗體的血清，稱為抗血清。多克隆抗體(polyclonalantibody)：抗血清中抗體是多個抗原決定簇刺激不同B細胞產(chǎn)生的抗體，所以稱為多克隆抗體。2011春夏當前第3頁\共有103頁\編于星期五\19點抗原的準備半抗原與載體偶聯(lián)制備完全抗原常用的連接反應(yīng)及雙功能連接劑佐劑的使用：佐劑與抗原按1：1比例混合乳化2011春夏當前第4頁\共有103頁\編于星期五\19點動物的選擇抗原與免疫動物的種屬差異越遠越好。對蛋白質(zhì)抗原，大部分動物皆適合常用的是山羊和家兔；甾體激素免疫多用家兔；酶類免疫多用豚鼠?？寡辶康男枰捍髣游锶珩R、騾等可獲得大量血清（一頭成年馬反復采血可獲得10000ml以上的抗血清）；但有時抗體需要是不多，選用家兔或豚鼠即可。2011春夏當前第5頁\共有103頁\編于星期五\19點免疫途徑一般采用多點注射，一只動物注射總數(shù)約為8~10點，包括足掌及肘窩淋巴結(jié)周圍，背部兩側(cè)、頜下、耳后等處皮內(nèi)或皮下，免疫效果較好；亦有肌肉、腹腔、靜脈注射途徑。腹腔、肌肉、皮內(nèi)、皮下注射適合使用任何抗原，刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答；靜脈注射適合可溶性抗原及分散的單細胞懸液，不使用佐劑，免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。2011春夏當前第6頁\共有103頁\編于星期五\19點免疫劑量與周期免疫劑量：抗原用量視抗原種類及動物而異，一般大動物抗原劑量（以蛋白抗原為準）約0.5~1mg/只，小動物約0.1~0.6mg/只。免疫周期：初次免疫后，再經(jīng)2～3次以上的加強免疫，一般3～4周間隔適合大部分動物，小動物10～14天，大動物2月左右。2011春夏當前第7頁\共有103頁\編于星期五\19點動物采血法頸動脈放血法：這是最常用的方法，對家兔、山羊等動物皆可采用。心臟采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、雞等小動物。此法采血技術(shù)應(yīng)熟練，穿刺不準容易導致動物急性死亡。靜脈多次采血法：家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日一次，有時可采集多量血液。2011春夏當前第8頁\共有103頁\編于星期五\19點抗血清的純化與保存試血、采血：加強免疫后2－3次，可通過耳靜脈或眼球采血，進行抗血清效價測定，當效價達到理想高度，可以心臟直接采血或動脈放血。待血凝后用針筒或吸管吸取血清?？寡寮兓蝴}析、層析(離子交換、分子篩、親和層析)。保存：低溫凍存，凍干、加保護劑（疊氮化鈉NaN3或BSA）4℃保存。2011春夏當前第9頁\共有103頁\編于星期五\19點抗血清的鑒定效價鑒定：效價又稱滴度（titer），是表達抗血清中特異性抗體相對含量的一個半定量指標，即在一定條件下結(jié)合一定量抗原的抗血清的稀釋度。親和力鑒定：親和力（affinity）指抗血清與相應(yīng)抗原結(jié)合的強度，是描述抗體特異性的重要指標，常用親和常數(shù)K表示。抗體特異性鑒定：常用瓊脂雙擴散法鑒定抗體特異性。2011春夏當前第10頁\共有103頁\編于星期五\19點7.1.2單克隆抗體的制備單克隆抗體（monoclonalantibody，MAb）——由單一B細胞克隆合成并分泌的一種組成均一的免疫球蛋白分子，簡稱單抗。單抗制備的原理單抗制備的材料單抗制備的技術(shù)單抗制備流程圖2011春夏當前第11頁\共有103頁\編于星期五\19點單抗制備的原理MAb是單一B細胞克隆產(chǎn)生的，其特異性是針對一個抗原決定簇的，它是B細胞克隆的標志。為使B細胞在體外能長期存活，Kǒhler和Milstein于1975年創(chuàng)建了雜交瘤方法。其基本原理是：將分泌抗體但不能長期培養(yǎng)的B細胞與能長期體外培養(yǎng)但不能分泌抗體的瘤細胞融合，篩選出既能分泌抗體又能長期體外培養(yǎng)的雜交瘤細胞，然后單克隆化，并擴大培養(yǎng)，從而進行單抗生產(chǎn)。2011春夏當前第12頁\共有103頁\編于星期五\19點單抗制備的材料骨髓瘤細胞：不產(chǎn)生抗體或產(chǎn)生抗體的某種鏈但不分泌次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型B細胞——小鼠或大鼠脾臟融合劑——50%的聚乙二醇（PEG）或電脈沖HAT選擇培養(yǎng)基——含10%-20%小牛血清和HAT的RPMI1640）2011春夏當前第13頁\共有103頁\編于星期五\19點單抗制備的技術(shù)抗原提純與動物免疫骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備細胞融合HAT法篩選雜交瘤細胞陽性細胞的篩選、單克隆化與保存單克隆抗體的制備與純化2011春夏當前第14頁\共有103頁\編于星期五\19點抗原提純與動物免疫抗原純度越高越好，尤其是初次免疫抗原。選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c（巴比塞）健康小鼠，鼠齡在8~12周，雌雄不限，可同時免疫3~4只小鼠。免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價抗體為最終目的，免疫間隔一般2~3周。末次免疫后3~4天，取出脾臟組織，制成單細胞懸液。2011春夏當前第15頁\共有103頁\編于星期五\19點骨髓瘤細胞與飼養(yǎng)細胞的制備選擇瘤細胞株應(yīng)用最多的是源自BALB/c小鼠的Sp2/0骨髓瘤細胞株，要求是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型（HGPRT-，TK-）。融合時應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)和活性佳的細胞（活性應(yīng)大于95％）。在培養(yǎng)融合細胞或細胞克隆化培養(yǎng)時，需加入飼養(yǎng)細胞，常用的飼養(yǎng)細胞為小鼠腹腔細胞，可用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出腹腔液即可，其中多為巨噬細胞。2011春夏當前第16頁\共有103頁\編于星期五\19點細胞融合細胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，其基本步驟如下：骨髓瘤細胞與脾臟細胞混合（1:2～1:10）培養(yǎng)，培養(yǎng)液中小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分需嚴格配制，以保證融合效率；加入40％（W/V）PEG1000~2000使細胞融合；1min后滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml稀釋，消除PEG的作用。2011春夏當前第17頁\共有103頁\編于星期五\19點HAT法篩選雜交瘤細胞哺乳動物DNA合成的兩條途徑：salvage

pathway替代合成途徑胸腺嘧啶（T）胸腺嘧啶激酶（TK）次黃嘌呤（H）次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）核苷酸染色體DNAdonovopathway從頭合成途徑磷酸核糖焦磷酸尿嘧啶葉酸核苷酸氨基蝶呤（A）2011春夏當前第18頁\共有103頁\編于星期五\19點陽性細胞的篩選、單克隆化與保存篩選ELISA、Dot-ELISA、凝集試驗、免疫印跡、免疫熒光試驗單克隆化有限稀釋法熒光激活細胞分揀法（FACS）保存冰凍保存，溫度越低越好，研究顯示，液氮保存的細胞株活性僅有輕微下降。2011春夏當前第19頁\共有103頁\編于星期五\19點單克隆抗體的制備與純化篩選出陽性細胞株進行抗體制備，有兩種方法：增量培養(yǎng)法：即將雜交瘤細胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體，如大瓶培養(yǎng)法、中空反應(yīng)器法。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法：將雜交瘤細胞接種到弗氏佐劑處理的BALB/c小鼠腹腔中去，通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，抗體含量較高且雜蛋白較少，每只小鼠可收集5~10ml的腹水。單抗的純化方法與多抗相同。2011春夏當前第20頁\共有103頁\編于星期五\19點7.1.3基因工程抗體基因工程抗體是利用DNA重組技術(shù)，在基因水平上對Ig分子進行剪接、修飾，甚至是人工合成后導入受體細胞表達，而制備的一種新型抗體。根據(jù)基因工程抗體的結(jié)構(gòu)不同，可以分為：人－鼠嵌合抗體改型抗體雙特異性抗體小分子抗體基因工程抗體的結(jié)構(gòu)與特性2011春夏當前第21頁\共有103頁\編于星期五\19點人－鼠嵌合抗體結(jié)構(gòu)：鼠源V區(qū)或Fab＋人源C區(qū)或Fc制備：從雜交瘤細胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人－鼠嵌合抗體。特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。2011春夏當前第22頁\共有103頁\編于星期五\19點改型抗體結(jié)構(gòu)：將鼠單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，故又稱CDR移植抗體。特點：抗體CDR直接決定抗體的特異性，改型抗體使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，同時減少其異源性。2011春夏當前第23頁\共有103頁\編于星期五\19點雙特異性抗體結(jié)構(gòu)特點：由異源性的H2＋L2構(gòu)成，具備結(jié)合兩種不同抗原的特點，又稱雙功能抗體。制備：將兩套輕鏈、重鏈基因?qū)牍撬枇黾毎校x擇合適的抗體恒定區(qū)及Ig類型表達。應(yīng)用：將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應(yīng)細胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細胞更容易殺傷腫瘤細胞。2011春夏當前第24頁\共有103頁\編于星期五\19點小分子抗體源自抗體且保持抗原結(jié)合能力，但不具備完整抗體結(jié)構(gòu)的一系列小分子。典型的小分子抗體有：單鏈抗體scFv由VH－連接肽－VL組成，它質(zhì)量很小，作為異種蛋白抗原性較小，組織穿透力強，是目前研究最活躍的基因工程抗體之一，可用噬菌體轉(zhuǎn)染細菌大量制備。其他小分子抗體還有：Fab、Fv，單域抗體（VH），最小識別單元（CDR）等。2011春夏當前第25頁\共有103頁\編于星期五\19點基因工程抗體的種類及其特性2011春夏當前第26頁\共有103頁\編于星期五\19點7.1.4催化性抗體一種具有催化化學反應(yīng)活性的抗體，又稱抗體酶（abozyme），表現(xiàn)出對底物立體結(jié)構(gòu)的專一性，催化的化學反應(yīng)特異性高于酶，效率低于常規(guī)酶類。通過設(shè)計穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換態(tài)類似物作為半抗原，與載體蛋白交聯(lián)后免疫動物，可制備催化性抗體：先篩出與底物或半抗原結(jié)合的抗體，再從中篩出有催化活性的抗體；對底物進行適當修飾，使催化反應(yīng)的產(chǎn)物可直接表現(xiàn)抗體的催化活性。2011春夏當前第27頁\共有103頁\編于星期五\19點7.1.5單抗的醫(yī)學應(yīng)用單克隆抗體的均一性和生物活性單一性，使抗原抗體反應(yīng)結(jié)果便于質(zhì)量控制，利于標準化和規(guī)范化。目前已有許多檢驗試劑盒用單抗制成，其主要用途如下：單克隆抗體具有靈敏度高、特異性好的特點，可用于各類病原體的診斷，這是單克隆抗體應(yīng)用最多的領(lǐng)域。對腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原進行檢測，用于腫瘤的診斷、分型及定位。2011春夏當前第28頁\共有103頁\編于星期五\19點檢測淋巴細胞的表面標志，用于區(qū)分細胞亞群和細胞分化階段。應(yīng)用單克隆抗體和免疫學技術(shù)，可對機體的多種微量成分進行測定，以便判斷健康狀態(tài)、檢出疾病、指導診斷和治療等。鼠源性單抗作為體外診斷試劑是滿意的，但用于人體可能會引起過敏反應(yīng)甚至危及生命。目前雖然已通過人－鼠細胞雜交及人－人細胞雜交進行了一些探索，但還不能商品化生產(chǎn)，因此制備人源單克隆抗體是目前亟待解決的問題。2011春夏當前第29頁\共有103頁\編于星期五\19點7.2.1抗原抗體反應(yīng)原理抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段：抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，此階段僅需幾秒至幾分鐘，不出現(xiàn)可見反應(yīng)?？梢姺磻?yīng)，此階段抗原抗體復合物在環(huán)境因素的影響下，進一步交聯(lián)集聚，表現(xiàn)為凝集、沉淀、中和、溶解、補體結(jié)合介導的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)原理：抗原抗體間的作用力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體2011春夏當前第30頁\共有103頁\編于星期五\19點抗原抗體間的作用力抗原和抗體通過非共價鍵結(jié)合，兩者間涉及多種弱的分子間作用力：靜電引力、范德華力、氫鍵作用力、疏水作用力等?？乖贵w間結(jié)合力表現(xiàn)為：親和力（affinity）：單價抗原與抗體間結(jié)合力的強度，表現(xiàn)為抗原抗體反應(yīng)平衡常數(shù)；親合力（avidity）：多價抗原與抗體間結(jié)合力的總強度，表現(xiàn)為多個親和力的加成。2011春夏當前第31頁\共有103頁\編于星期五\19點親水膠體轉(zhuǎn)換為疏水膠體親水膠體：抗體和大多數(shù)抗原都是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)親水的氨基羧基周圍可形成水化層，再加上同種電荷相斥，就形成了穩(wěn)定的親水膠體。疏水膠體：當抗原與抗體結(jié)合后，表面電荷減少，水化層變??；且抗原抗體結(jié)合后，與水接觸的表面積減少，由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。各疏水膠體進一步靠攏，形成可見的抗原抗體復合物沉淀。2011春夏當前第32頁\共有103頁\編于星期五\19點7.2.2抗原抗體反應(yīng)特點抗原抗體反應(yīng)是指抗原與對應(yīng)抗體在一定條件下特異結(jié)合，形成可逆性抗原抗體復合物的過程。此類反應(yīng)的規(guī)律和特點有：特異性可逆性比例性2011春夏當前第33頁\共有103頁\編于星期五\19點特異性特異性是指任何一種抗原分子，只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體發(fā)生反應(yīng)。因為抗體CDR與抗原決定簇在化學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系。這種高度的特異性在傳染病的診斷、防治等醫(yī)學和生物學領(lǐng)域都已得到了廣泛的應(yīng)用。大多數(shù)天然抗原物質(zhì)的構(gòu)成復雜，常含有多種抗原決定簇。如果兩種不同的抗原物質(zhì)具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原決定簇，則可與彼此相應(yīng)的抗血清出現(xiàn)交叉反應(yīng)（crossreaction）。2011春夏當前第34頁\共有103頁\編于星期五\19點可逆性可逆性是指在一定條件（如低pH、高濃度鹽等）下，抗原抗體復合物分子間作用力減弱而導致解離，回復到抗原與抗體的游離狀態(tài)。抗原抗體反應(yīng)遵循生物大分子熱動力學反應(yīng)原則，其反應(yīng)式為：抗原抗體反應(yīng)平衡取決于兩個因素，一是抗原抗體親合力大小；二是環(huán)境因素對復合物的影響。2011春夏當前第35頁\共有103頁\編于星期五\19點比例性比例性是指多價抗原與抗體反應(yīng)，只有當二者濃度比例適當時，才形成大的抗原抗體結(jié)合物，產(chǎn)生凝集、沉淀等可見反應(yīng)。把最迅速出現(xiàn)可見反應(yīng)時的抗原抗體的濃度比或量比，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價點（equivalencepoint），抗原與抗體比例最合適的范圍稱等價帶（equivalencezone）。Marrack提出的網(wǎng)格學說解釋了抗原抗體反應(yīng)比例性的機制。2011春夏當前第36頁\共有103頁\編于星期五\19點網(wǎng)格學說當多價抗原與多價抗體在等價帶結(jié)合時，相互交叉連接成具有立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格狀復合體，形成肉眼可見的沉淀物。當抗原或抗體過剩時，由于過剩方的結(jié)合價得不到飽和，只能形成較小復合物，不能出現(xiàn)可見反應(yīng)。2011春夏當前第37頁\共有103頁\編于星期五\19點7.3.1沉淀反應(yīng)在體外當抗原與相應(yīng)抗體濃度比例適當時，會發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，廣泛用于抗原或抗體的定性及定量分析。根據(jù)反應(yīng)介質(zhì)和檢測方法不同，沉淀反應(yīng)可分為以下幾種類型：液相沉淀反應(yīng)凝膠擴散沉淀免疫電泳試驗免疫共沉淀2011春夏當前第38頁\共有103頁\編于星期五\19點液相沉淀反應(yīng)指以含鹽緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)的抗原抗體特異性結(jié)合的沉淀試驗，可分為3類：絮狀沉淀試驗：抗原抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。環(huán)狀沉淀試驗：將抗原溶液疊加在細小玻管中抗體溶液上面，在兩液交界的清晰界面上形成白色沉淀環(huán)。主要用于鑒定微量抗原如鑒定血跡，診斷炭疽。免疫濁度試驗：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后溶液濁度變化測定未知抗原或抗體濃度。2011春夏當前第39頁\共有103頁\編于星期五\19點凝膠擴散沉淀瓊脂或瓊脂糖凝膠內(nèi)部是一種大孔徑網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抗原和抗體在凝膠中可自由擴散。當抗原與相應(yīng)抗體經(jīng)擴散后在凝膠中相遇形成復合物，若兩者在相遇處比例適當，則復合物的分子量增大，顆粒增大，因而不再繼續(xù)擴散而產(chǎn)生沉淀，呈現(xiàn)出線狀或帶狀。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的方式和特性可分為：免疫單擴散試驗免疫雙擴散試驗2011春夏當前第40頁\共有103頁\編于星期五\19點免疫單擴散試驗原理：定量抗體混勻在瓊脂凝膠中，加待測抗原溶液使其單獨在凝膠中擴散，形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原的濃度成正比。技術(shù)要點：將抗體和0.9%瓊脂50-56℃混合制成平板；凝固后在其上打孔，加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標準品；37℃自由擴散24-48小時，孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)，測定沉淀環(huán)直徑。2011春夏當前第41頁\共有103頁\編于星期五\19點免疫雙擴散試驗原理：將抗原和抗體溶液分別放在凝膠不同的對應(yīng)孔中，讓兩者均在凝膠中自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成可見的沉淀線，可檢測抗原或抗體的特異性。技術(shù)要點：在平板玻璃上傾注一均勻的瓊脂凝膠薄層；打制2~3mm的小孔，分別加入抗原或抗體；溫育1~2天，可出現(xiàn)不同沉淀線。2011春夏當前第42頁\共有103頁\編于星期五\19點免疫電泳試驗免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物，有兩大優(yōu)點：大大加快了沉淀反應(yīng)的速度；將某些蛋白組分根據(jù)帶電荷的不同而分開，再與抗體反應(yīng)，從而使本法更為微量化，多樣化，使其應(yīng)用范圍日益擴大。常用技術(shù)有以下幾種：血清免疫電泳（IEP）火箭免疫電泳（RIEP）對流免疫電泳（CIEP）2011春夏當前第43頁\共有103頁\編于星期五\19點血清免疫電泳（IEP）步驟：電泳分離抗原；在抗體槽內(nèi)加入抗血清；擴散形成肉眼可見的弧形沉淀線。應(yīng)用：已知抗血清，根據(jù)沉淀弧的數(shù)量，位置和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及性質(zhì)。固定抗原，根據(jù)沉淀線的特點顯示病人血清與正常人血清的差異，即血清組分的缺少或增加。2011春夏當前第44頁\共有103頁\編于星期五\19點火箭免疫電泳（RIEP）一種通過電泳進行加速的單向免疫擴散技術(shù)，由于其沉淀形似火箭，故稱為火箭免疫電泳。在混合有抗體的凝膠上做孔，加入抗原電泳，沿電泳方向隨著抗原量的減少，沉淀帶越來越窄，形成火箭型沉淀線，沉淀線高度與抗原量成正比，可定量檢測特定血清蛋白含量。2011春夏當前第45頁\共有103頁\編于星期五\19點對流免疫電泳（CIEP）又稱電滲析，實質(zhì)上是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙向擴散技術(shù)的結(jié)合。原理：在PH8.6的瓊脂凝膠中，抗體帶微弱的負電且較大，電泳力小于電滲力，泳向負極；而一般抗原電泳力大于電滲力，泳向正極。電泳時抗原放負極側(cè)孔，抗體放正極側(cè)孔，抗原抗體相對泳動在兩孔間相遇，比例合適時形成沉淀線。有微量快速特點，常用于醫(yī)學檢驗。2011春夏當前第46頁\共有103頁\編于星期五\19點免疫共沉淀以抗原和抗體之間的專一性作用為基礎(chǔ)，研究蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)互作的一種免疫學方法。原理與應(yīng)用：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)間互作會被保留。如果用某蛋白的抗體免疫沉淀，與該蛋白在胞內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)也會隨之沉淀。常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在胞內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)新的作用搭檔。2011春夏當前第47頁\共有103頁\編于星期五\19點7.3.2凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)（agglutination）是指顆粒性抗原或表面覆蓋抗原（或抗體）的顆粒狀載體，與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，在一定條件下，形成肉眼可見的凝集團塊現(xiàn)象。根據(jù)技術(shù)方法差異，凝集反應(yīng)可分為：直接凝集試驗間接凝集試驗抗球蛋白試驗協(xié)同凝集試驗冷凝集試驗2011春夏當前第48頁\共有103頁\編于星期五\19點直接凝集試驗細胞等顆粒性抗原在有電解質(zhì)的參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。凝集原：凝集反應(yīng)中的抗原凝集素：凝集反應(yīng)中的抗體常用的直接凝集試驗有玻片法（定性）和試管法（定量）。2011春夏當前第49頁\共有103頁\編于星期五\19點間接凝集試驗用人工方法將可溶性抗原（或抗體）吸附或偶聯(lián)于載體上，使之成為致敏載體顆粒，在電解質(zhì)參與下與相應(yīng)抗體（或抗原）作用產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。載體：試驗體系中與免疫無關(guān)的顆粒。致敏：抗原或抗體偶聯(lián)于載體表面的過程。致敏顆粒：吸附有已知抗原或抗體的顆粒。根據(jù)致敏用的試劑和反應(yīng)方式可分為：（正向）間接凝集試驗反向間接凝集試驗間接凝集抑制試驗2011春夏當前第50頁\共有103頁\編于星期五\19點用特異性抗原致敏載體，檢測樣本中的相應(yīng)抗體，如病菌感染產(chǎn)生的抗體，自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)患者抗體等。正向間接凝集反應(yīng)2011春夏當前第51頁\共有103頁\編于星期五\19點反向間接凝集反應(yīng)用特異性抗體致敏載體，檢測樣本中的相應(yīng)抗原，可檢測HBsAg、細菌莢膜抗原等。2011春夏當前第52頁\共有103頁\編于星期五\19點間接凝集抑制試驗（陽性）用抗原致敏載體及相應(yīng)抗體作為診斷試劑，用于檢測樣本中是否存在與致敏顆粒相同的抗原，不出現(xiàn)凝集顆粒表示陽性。2011春夏當前第53頁\共有103頁\編于星期五\19點間接凝集抑制試驗（陰性）有凝集顆粒出現(xiàn)表示陰性——待測樣本中不存在與致敏顆粒相同抗原。妊娠檢測試驗2011春夏當前第54頁\共有103頁\編于星期五\19點抗球蛋白試驗原理：機體受某些抗原刺激后產(chǎn)生不完全抗體，其與相應(yīng)抗原結(jié)合后不出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象，但能封閉抗原決定簇，使其不能再與完全抗體結(jié)合，故又稱“封閉抗體”。方法：將人球蛋白，注入異種動物，獲得抗球蛋白。此種抗體加入表面結(jié)合有不完全抗體的紅細胞的復合物中，就能出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象。2011春夏當前第55頁\共有103頁\編于星期五\19點抗球蛋白試驗的作用可檢測紅細胞表面結(jié)合的封閉抗體或游離在血清中的封閉抗體，多用于母體Rh（D）抗體檢測或自身免疫性溶血性貧血癥診斷。2011春夏當前第56頁\共有103頁\編于星期五\19點協(xié)同凝集試驗原理：金黃色葡萄球菌的細胞壁含有一種特殊的蛋白質(zhì)（稱金黃色葡萄球菌蛋白A，SPA），能與血清中IgG抗體的Fc段非特異性結(jié)合，兩個保持活性的Fab暴露在菌體（起載體作用）表面，與特異性抗原相遇時，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。應(yīng)用：微生物的快速診斷與鑒定，以協(xié)助傳染病的早期診斷。2011春夏當前第57頁\共有103頁\編于星期五\19點冷凝集試驗原理：冷凝集素是紅細胞某些抗原的自身抗體，只能在低溫時與其相應(yīng)的抗原結(jié)合。冷凝集反應(yīng)在4℃時最強烈，紅細胞凝集最明顯；溫度升高后，抗原抗體復合物解離，凝塊消失。意義：冷凝集素增高常見于單核細胞增多癥和支原體肺炎，惡性淋巴瘤通常伴隨冷凝集素慢性增高。2011春夏當前第58頁\共有103頁\編于星期五\19點7.3.3免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)是指用酶、熒光素、同位素等物質(zhì)標記抗體或抗原進行抗原抗體反應(yīng)，檢測抗原或抗體的技術(shù)。具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點。根據(jù)標記物的不同，免疫標記技術(shù)可分為：放射免疫分析酶聯(lián)免疫吸附試驗免疫熒光技術(shù)親和標記的免疫分析2011春夏當前第59頁\共有103頁\編于星期五\19點放射免疫分析（RIA）同位素標記的免疫分析法，常用同位素有125I，131I，3H，35S。方法：液相反應(yīng)體系用液體閃爍儀計數(shù)；固相反應(yīng)體系用X射線膠片顯影。應(yīng)用：廣泛用于激素、藥物等小分子化合物的定量分析，是靈敏、可靠的免疫分析方法之一。2011春夏當前第60頁\共有103頁\編于星期五\19點酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）將抗原或抗體吸附在固相（如聚苯乙烯微量板、磁珠等）表面，用酶標抗體或抗原與之反應(yīng)后，根據(jù)固定酶催化底物顏色變化的深淺檢測抗原或抗體，此所謂酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。廣泛用于食品安全檢測、病原體鑒定、生物大分子甄別及藥物組分分析等諸多領(lǐng)域。根據(jù)檢測方法特點和性質(zhì)的不同可分為：

直接法

間接法

夾心法

競爭法

dot-ELISA

ELISPOT2011春夏當前第61頁\共有103頁\編于星期五\19點直接法原理：抗原或抗體固定酶標抗體或抗原與固相反應(yīng)，洗脫游離的抗原或抗體固定的酶量與受檢物量正相關(guān)底物酶促反應(yīng)，產(chǎn)物顏色深淺反映受檢物量多少。常用酶類：辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AKP）β-半乳糖苷酶（β-GAL）2011春夏當前第62頁\共有103頁\編于星期五\19點間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，利用酶標記的抗抗體檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱間接法。間接法操作流程如下：抗原固定，洗滌；加受檢樣本，充分反應(yīng)后洗滌；加酶標抗抗體，充分反應(yīng)后洗滌；加底物顯色，顏色深度代表樣本中受檢抗體的量。2011春夏當前第63頁\共有103頁\編于星期五\19點夾心法根據(jù)性質(zhì)不同可分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法，雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。雙抗體夾心法操作步驟如下：抗體固定，洗滌；加受檢樣本，充分反應(yīng)后洗滌；加酶標抗體，充分反應(yīng)后洗滌，此時固定的酶量與樣本中受檢物的量正相關(guān)；加底物，夾心復合物中的酶催化底物成有色產(chǎn)物，據(jù)顏色深淺可對受檢物定性或定量。2011春夏當前第64頁\共有103頁\編于星期五\19點競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，說明其操作步驟如下：抗體包被，洗滌。待測管中加受檢樣本與一定量酶標抗原的混合溶液，充分反應(yīng)后洗滌；參考管中只加酶標抗原，充分反應(yīng)后洗滌。分別加底物顯色，參考管與待測管顏色深度之差，代表受檢樣本抗原的量，待測管顏色越淡，表示樣本中抗原含量越多。2011春夏當前第65頁\共有103頁\編于星期五\19點dot-ELISA在硝酸纖維素膜上進行的酶聯(lián)免疫吸附試驗稱為斑點酶聯(lián)免疫吸附實驗（dot-ELISA）。原理：固定抗原或抗體后，洗脫，加酶標抗體或抗原反應(yīng)，再洗脫。最后的顯色反應(yīng)要用一些特殊的底物，使酶促反應(yīng)生成不溶于水的有色產(chǎn)物。根據(jù)膜上沉淀斑點顏色深淺進行定性和定量分析，使用斑點掃描儀可以進行定量測定。2011春夏當前第66頁\共有103頁\編于星期五\19點ELISPOTELISPOT即酶聯(lián)免疫斑點試驗，其原理與普通ELISA相似，但顯色后在細胞分泌特定蛋白的位置顯現(xiàn)清晰的斑點，可直接鏡檢計數(shù)，進而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。應(yīng)用領(lǐng)域：用已知抗原檢測分泌特異性抗體的B細胞；用細胞因子抗體檢測細胞分泌的細胞因子；移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測、自身免疫病研究、腫瘤研究、抗原決定簇圖譜分析等。2011春夏當前第67頁\共有103頁\編于星期五\19點免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)是將免疫學方法與熒光標記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。標記已知抗體成熒光抗體，以此為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原。抗原抗體復合物攜帶熒光素，利用熒光顯微鏡觀察樣本，可見熒光所在的細胞或組織，從對抗原進行定性、定位乃至定量檢測。常用熒光素：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）羅丹明（紅色熒光）2011春夏當前第68頁\共有103頁\編于星期五\19點親和標記的免疫分析利用一些特殊蛋白的親和作用，結(jié)合熒光標記或酶標方法可以避免酶標抗體制備的繁瑣，廣泛應(yīng)用于免疫分析系統(tǒng)。常用的親和標記系統(tǒng)有：SPA能與Fcγ結(jié)合，故可用作熒光標記或酶標抗抗體；小分子生物素能與親和素或鏈親和素組成生物素親和素系統(tǒng)（BAS），結(jié)合親和素或鏈親和素的熒光或酶標抗體，可用于抗體芯片系統(tǒng)。2011春夏當前第69頁\共有103頁\編于星期五\19點7.3.4補體參與的抗原抗體反應(yīng)原理：抗原抗體復合物可激活補體，活化的補體可以殺傷細胞，據(jù)此可用一定量的補體和致敏紅細胞來檢測抗原抗體間有無特異性結(jié)合，進而判斷受檢物存在與否或存在量的多少。典型應(yīng)用：補體結(jié)合試驗檢測抗原，如診斷傳染病、鑒定病原體等。溶血空斑試驗檢測抗體合成細胞。2011春夏當前第70頁\共有103頁\編于星期五\19點補體結(jié)合試驗組成部分：實驗系統(tǒng)：待測抗原或抗體、對應(yīng)已知抗體或抗原；指示系統(tǒng)：補體、紅細胞、溶血素（即紅細胞抗體）。2011春夏當前第71頁\共有103