狂犬病病毒分子生物學(xué)基礎(chǔ)演示文稿

狂犬病病毒分子生物學(xué)基礎(chǔ)演示文稿當(dāng)前第1頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)（優(yōu)選）狂犬病病毒分子生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前第2頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)病原狂犬病病毒：Rabiesvirus,RV。有兩種主要抗原：一種是外膜上的糖蛋白抗原，為主要抗原，決定病毒的嗜神經(jīng)性、致病性和產(chǎn)生中和抗體；內(nèi)層的核蛋白抗原，可使體內(nèi)產(chǎn)生補(bǔ)體結(jié)合抗體和沉淀素，無保護(hù)作用。從患者或患病動(dòng)物體內(nèi)分離的毒株成為自然毒株或街毒株（streetvirus），毒力強(qiáng)；經(jīng)過腦組織多次傳代后，成為固定毒株（fixedvirus），毒力弱，可以用于疫苗制備。當(dāng)前第3頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)病原學(xué)病毒主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、唾液腺和唾液內(nèi)。在唾液腺、海馬角、大腦皮層細(xì)胞漿內(nèi)形成嗜酸性包涵體，稱為Negribodies(NB)，是病毒復(fù)制和裝配的場所。病毒可以在大鼠、小鼠、家兔和雞胚等腦組織內(nèi)增殖、致弱，也可以通過馴化，適應(yīng)于非腦組織細(xì)胞。當(dāng)前第4頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)狂犬病疫苗疫苗：所有用減毒或者殺死的病原生物（包括細(xì)菌、病毒、立克次氏體等）或其抗原性物質(zhì)所制成，用于預(yù)防接種的生物制品。目的：預(yù)防、控制疾?。ㄈ缈袢。┑陌l(fā)生、流行。1881年法國巴斯德最早應(yīng)用連續(xù)傳代減弱病毒毒力，成功制造出狂犬病疫苗。目前接種狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病唯一有效的手段。由于狂犬病幾乎100%的致死性，人用狂犬病疫苗必須是滅活苗。當(dāng)前第5頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)狂犬病疫苗的歷史經(jīng)歷五代疫苗神經(jīng)組織疫苗禽胚培養(yǎng)疫苗細(xì)胞培養(yǎng)疫苗亞單位及精致疫苗基因工程疫苗當(dāng)前第6頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)人用狂犬病疫苗生產(chǎn)流程細(xì)胞制備及培養(yǎng)接種毒株培育收獲病毒上清病毒純化病毒滅活原液檢定分裝及凍干當(dāng)前第7頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV的滅活病毒對H2O2、KMNO4、新潔爾液、來蘇兒、肥皂水、70%酒精、碘酒以及β-丙內(nèi)酯敏感。目前通用β-丙內(nèi)酯來滅活疫苗收獲液中的活毒，用量為1:4000，方法：4℃過夜，37℃水浴2h水解殘留的β-丙內(nèi)酯。當(dāng)前第8頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)里程碑：分子生物學(xué)的誕生1962NobelprizeinPhysiologyorMedicine當(dāng)前第9頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)中心法則蛋白質(zhì)當(dāng)前第10頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)原核生物和真核生物在基因表達(dá)上的區(qū)別當(dāng)前第11頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)什么是病毒？生物病毒是一類個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡單，只含單一核酸（DNA或RNA），必須在活細(xì)胞內(nèi)寄生并以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型微生物。特點(diǎn)：不具細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有遺傳、復(fù)制等生命特征，既無能能量代謝系統(tǒng)也無蛋白質(zhì)和核酸合成系統(tǒng)……當(dāng)前第12頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)病毒的形態(tài)⑴球狀病毒；⑵桿狀病毒；⑶磚形病毒；⑷冠狀病毒；⑸絲狀病毒；⑹鏈狀病毒；⑺有包膜的球狀病毒；⑻具有球狀頭部的病毒；⑼封于包含體內(nèi)的昆蟲病毒等。病毒粒的對稱體制：病毒粒的對稱體制只有兩種，即⑴螺旋對稱（代表煙草花葉病毒）⑵二十面體對稱（等軸對稱，代表腺病毒）。一些結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的病毒，實(shí)質(zhì)上是上述兩種對稱相結(jié)合的結(jié)果，故稱作復(fù)合對稱（代表T偶數(shù)噬菌體）。當(dāng)前第13頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)當(dāng)前第14頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)桿狀病毒HIV當(dāng)前第15頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)絲狀病毒腺病毒當(dāng)前第16頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)病毒的分類從遺傳物質(zhì)分類：DNA病毒、RNA病毒、蛋白質(zhì)病毒（如：朊病毒）。從病毒結(jié)構(gòu)分類：真病毒（Euvirus，簡稱病毒）和亞病毒（Subvirus，包括類病毒、擬病毒、朊病毒）。從寄主類型分類：噬菌體（細(xì)菌病毒）、植物病毒（如煙草花葉病毒）、動(dòng)物病毒（如禽流感病毒、天花病毒、HⅣ等）。從性質(zhì)來分：溫和病毒（HⅣ）、烈性病毒（狂犬病病毒）。當(dāng)前第17頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)病毒的分類國際病毒分類委員會（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses：ICTV）當(dāng)前第18頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)當(dāng)前第19頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)彈狀病毒科病毒結(jié)構(gòu)示意圖當(dāng)前第20頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)彈狀病毒科成員彈狀病毒科水泡性病毒屬狂犬病病毒屬?短暫熱病毒屬?細(xì)胞核彈狀病毒屬?非毒粒彈狀病毒屬?細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬?58種植物病毒未歸類植物病毒VSVRV當(dāng)前第21頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)狂犬病病毒：Rabiesvirus,RV75

nm(60～85nm)180

nm

(60～400nm)當(dāng)前第22頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV基因組構(gòu)成大?。杭s12kbp。單股負(fù)鏈RNA(-ssRNA)?；蚺挪迹?’to5’）：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（即依賴RNA的RNA聚合酶，L）。其中N基因最保守，常用于進(jìn)化分析；G基因編碼的G蛋白是病毒唯一暴露在外表面的蛋白，是病毒的主要抗原，同時(shí)也是引起宿主免疫應(yīng)答的主要組分。當(dāng)前第23頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)-ssRNAvs+ssRNA定義：一般來說根據(jù)RNA能否直接起mRNA作用而分成單股正鏈RNA病毒(正股RNA病毒)與單股負(fù)鏈RNA病毒(負(fù)股RNA病毒)兩種。RV屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，即-ssRNA病毒。當(dāng)前第24頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV感染周期(CitedfromDietzscholdetal.,2005)當(dāng)前第25頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)逆軸突運(yùn)輸機(jī)制(CitedfromDietzscholdetal.,2005)當(dāng)前第26頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)小結(jié)狂犬病病毒RV是彈狀病毒科(Rhabdoviridae

)狂犬病病毒屬(Lyssavirus

)的模式病毒種。RV呈子彈狀，長約為180

nm

(60-400nm)，直徑約為75

nm(60-85nm)。具有囊膜包被，基因組為12kbp大小的單股負(fù)鏈RNA(-ssRNA)。高度嗜神經(jīng)性，且逆軸突傳播。含有5個(gè)結(jié)構(gòu)基因，從3’到5’依次為N、P、M、G和L。病毒粒子大?。?×105—8×105kDa，沉降系數(shù)為600S。當(dāng)前第27頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)根據(jù)N基因5’端500bp堿基的同源性分析，可以將狂犬病病毒屬分為7種基因型（Genotype，GT）：狂犬病病毒屬的分類GT病毒名稱縮寫I狂犬病病毒RVIILagos蝙蝠株LagVIIIMokola病毒MokVIVDuvenhage病毒DuvVV歐洲蝙蝠病毒-1EBL-1VI歐洲蝙蝠病毒-2EBL-2VII澳大利亞蝙蝠病毒ABL……….當(dāng)前第28頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)兩個(gè)遺傳譜系疫苗的交叉保護(hù)作用僅存在與同一個(gè)遺傳譜系內(nèi)的病毒中！當(dāng)前第29頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)病毒感染的一般步驟吸附進(jìn)入脫殼病毒基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制子代病毒裝配釋放當(dāng)前第30頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV感染的一般步驟當(dāng)前第31頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄當(dāng)前第32頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV基因轉(zhuǎn)錄vs復(fù)制兩種狀態(tài)的RNA聚合酶：RNA轉(zhuǎn)錄酶和RNA復(fù)制酶。RNA轉(zhuǎn)錄酶：L、P、EF-1αβγ、Hsp60、GT（鳥苷轉(zhuǎn)移酶），從N基因處直接開始轉(zhuǎn)錄。RNA復(fù)制酶：L、P、可溶性的N蛋白（N-P復(fù)合物形式存在，為復(fù)制必須），從基因組的第一個(gè)bp處開始合成leaderRNA和復(fù)制基因組。當(dāng)前第33頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄重要的順式作用元件：啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止信號。RV基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：stop-startmodel。當(dāng)前第34頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV基因組僅有一個(gè)啟動(dòng)子，5個(gè)基因有相同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：UUGU和轉(zhuǎn)錄終止信號：A/UCUUUUUUU。通用模式：-間隔區(qū)UUGU---ORF---A/UCUUUUUUU間隔區(qū)。RV轉(zhuǎn)錄元件當(dāng)前第35頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)Stop-startmodel一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的終止是下一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄起始必須的。RNA聚合酶在終止上一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，大約有30%的RNA聚合酶不能起始下游基因的轉(zhuǎn)錄，造成轉(zhuǎn)錄依次遞減30%。研究發(fā)現(xiàn)，-ssRNA基因表達(dá)的調(diào)控主要是通過基因與3’端啟動(dòng)子的位置來控制的。當(dāng)前第36頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RV基因組的復(fù)制3’leader和5’trailer互補(bǔ)鏈均含有復(fù)制起始信號，但5’的trailer互補(bǔ)鏈的復(fù)制信號強(qiáng)度大于3’leader，造成-ssRNA：+ssRNA=50:1，因此包裝成熟的病毒粒子含有-ssRNA與含有+ssRNA的比例也約為50:1當(dāng)前第37頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)VSV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制模型當(dāng)前第38頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)病毒粒子的裝配研究發(fā)現(xiàn)，RV的基因組兩端不存在特定的包裝信號，-ssRNA或+ssRNA包裝入病毒粒子完全由兩種RNA在細(xì)胞內(nèi)的豐度決定(Finkeretal.,1997)。然而，對VSV的研究發(fā)現(xiàn)，VSV基因組-ssRNA

5’端的trailer區(qū)含有包裝信號，使-ssRNA被選擇性包裝入核衣殼(WhelanandWertz,1999)。當(dāng)前第39頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)G蛋白簡介狂犬病病毒G蛋白參與病毒的組織趨向性和致病性，是主要的保護(hù)性抗原，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)病毒中和抗體的產(chǎn)生。

整個(gè)G蛋白分為四個(gè)結(jié)構(gòu)域：信號肽(signalpeptite,SP)膜外區(qū)(ectodomain,ECTO)，跨膜區(qū)(transmembraneregion,TM)和膜內(nèi)區(qū)(endodomain,ENDO)，成熟的G蛋白包括后面三個(gè)結(jié)構(gòu)域。G全長:522-533aa成熟G蛋白:503-514aaSP:19aa,TM:22aa,ECTO:439aa,ENDO:42-53aa當(dāng)前第40頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)RVG蛋白主要抗原位點(diǎn)膜34-42198-200II膜外區(qū)：1-439aaI231IV264III330-357a342-343244-281G5跨膜區(qū)：440-460aa膜內(nèi)區(qū)：462-505aa當(dāng)前第41頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)反向遺傳學(xué)技術(shù)經(jīng)典遺傳學(xué)技術(shù)GregorJohannMendel1822-18841：1表型（phenotype）基因型（genotype）當(dāng)前第42頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)反向遺傳學(xué)技術(shù)表型（phenotype）基因型（genotype）基因重組技術(shù)當(dāng)前第43頁\共有45頁\編于星期五\10點(diǎn)-ssRNA反向遺傳學(xué)建立的基礎(chǔ)L、P、N和病毒-ssRNA或+ssRNA包裝形成核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein,RNP)。RNP負(fù)責(zé)病毒進(jìn)入細(xì)胞后的所有復(fù)制過程，包括病毒基因的轉(zhuǎn)錄和基因組