第十章細(xì)菌和病毒的遺傳

第一節(jié)細(xì)菌和病毒遺傳研究的意義*一、細(xì)菌的生物學(xué)特征*二、病毒的生物學(xué)特征三、細(xì)菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性四、細(xì)菌和病毒的擬有性過程五、細(xì)菌遺傳的實(shí)驗(yàn)研究方法當(dāng)前第1頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)一、細(xì)菌的生物學(xué)特征所有的細(xì)菌都是比較小的細(xì)胞，、大約1-2μm長(zhǎng)，0.5μm寬，。由一層或多層膜或壁所包圍。細(xì)菌細(xì)胞中有含有許多核糖體的細(xì)胞質(zhì)，以及含DNA的區(qū)域，即擬核。大腸桿菌(Escherichiacoli)在細(xì)菌遺傳學(xué)研究中應(yīng)用十分廣泛，其DNA主要是以單個(gè)主染色體(mainchromosome)的形式存在。當(dāng)前第2頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)細(xì)菌細(xì)胞模式圖當(dāng)前第3頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)二、病毒的生物學(xué)特征病毒沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，既不屬于原核生物，也不屬于真核生物?？煞志惒《?，動(dòng)物病毒和植物病毒。病毒結(jié)構(gòu)十分簡(jiǎn)單，僅含一種核酸，或DNA或RNA，和一個(gè)蛋白質(zhì)外殼。蛋白質(zhì)外殼保護(hù)遺傳物質(zhì)，并參與感染宿主細(xì)胞的過程。在病毒中沒有合成蛋白質(zhì)外殼所必須的核糖體。當(dāng)前第4頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)病毒的生物學(xué)特征病毒必須感染活細(xì)胞，改變和利用活細(xì)胞的代謝合成機(jī)器，才能合成新的病毒后代。感染細(xì)菌的病毒又叫噬菌體(bacteriophage)。依其遺傳物質(zhì)的性質(zhì)，可將病毒分為單鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈DNA和雙鏈RNA等四種類型。依其與宿主細(xì)胞的相互關(guān)系，可以有烈性(virulent)和溫和(temperate)噬菌體兩大類型。當(dāng)前第5頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)病毒的特性當(dāng)前第6頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)三、細(xì)菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性了解微生物遺傳研究有助于理解多年來分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)理論發(fā)展。世代周期短，繁殖世代所需時(shí)間短；易于操作管理和進(jìn)行化學(xué)分析(純培養(yǎng)與代謝產(chǎn)物累積)；便于研究基因的突變(表現(xiàn)與選擇)；便于研究基因的作用(突變型生長(zhǎng)條件與基因作用)；便于研究基因的重組(重組群體大、選擇方法簡(jiǎn)便有效)；遺傳物質(zhì)比較簡(jiǎn)單，可作為研究高等生物的簡(jiǎn)單模型在研究基因結(jié)構(gòu)、功能與表達(dá)調(diào)控時(shí)更為簡(jiǎn)便。微生物的應(yīng)用領(lǐng)域日益擴(kuò)大、成就突出(微生物工程)；在遺傳工程中，作為重要研究材料、工具，也具有決定性作用。當(dāng)前第7頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)四、細(xì)菌和病毒的擬有性過程真核生物基因分離、自由組合及連鎖交換均通過有性過程實(shí)現(xiàn)。細(xì)菌和病毒均不存在嚴(yán)格意義上的有性過程。細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)除了染色體外還有一些寄生性復(fù)制因子(如噬菌體和質(zhì)粒)，它們可以在細(xì)胞間傳遞，并且形成細(xì)菌染色體間以及細(xì)菌染色體與核外遺傳因子間的重組體。這種重組體結(jié)構(gòu)類似于真核生物減數(shù)分裂過程中形成的重組體結(jié)構(gòu)。擬有性過程：引起細(xì)菌、病毒間遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移與重組的過程。擬有性過程的存在是細(xì)菌、病毒在遺傳學(xué)研究，特別是作為真核生物的模型研究遺傳重組和基因結(jié)構(gòu)的重要前提。當(dāng)前第8頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)五、細(xì)菌遺傳的實(shí)驗(yàn)研究方法(一)細(xì)胞計(jì)數(shù)(培養(yǎng)物細(xì)胞濃度)(二)建立純系的方法(三)選擇培養(yǎng)法鑒定突變型與重組型(四)突變型與重組型的批量篩選方法當(dāng)前第9頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(一)細(xì)胞計(jì)數(shù)(培養(yǎng)物細(xì)胞濃度)培養(yǎng)物中微生物計(jì)數(shù)方法是微生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其基本思路是：對(duì)原培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)稀釋；進(jìn)行平板涂抹培養(yǎng)；由于每個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)菌落，計(jì)數(shù)菌落數(shù)；根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算原培養(yǎng)物中的細(xì)胞濃度。當(dāng)前第10頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(二)建立純系的方法——純培養(yǎng)挑取由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來的菌落進(jìn)行培養(yǎng)就可以獲得由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的純系。通常采用平板表面涂布法或劃線法可以獲得單菌落。這種方法獲得的純系，稱為“菌種純”。有時(shí)采用顯微操縱器進(jìn)行菌絲尖端切割等方法從單個(gè)細(xì)胞直接培養(yǎng)建立純系。采用這種方法獲得的純系稱為“菌株純”。當(dāng)前第11頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(三)選擇培養(yǎng)法鑒定突變型與重組型許多細(xì)菌的突變都與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分及培養(yǎng)條件有關(guān)。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選、鑒定：選擇培養(yǎng)法是根據(jù)菌株在基本培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)將菌株分為原養(yǎng)型和營(yíng)養(yǎng)缺陷型。營(yíng)養(yǎng)突變型的篩選、鑒定方法與紅色面包霉生化突變型的鑒定方法基本一致。其它突變類型的篩選、鑒定：對(duì)于其它的突變類型(如溫度敏感型)，也可以通過培養(yǎng)條件的選擇培養(yǎng)來篩選與鑒定。當(dāng)前第12頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(四)突變型與重組型的批量篩選方法為高效檢測(cè)、分離混和群體中不同突變型，黎德伯格夫婦設(shè)計(jì)了影印培養(yǎng)法。該方法原理與選擇培養(yǎng)法一致，但是采用影印法將在完全培養(yǎng)基上單菌落同時(shí)接種到不同選擇培養(yǎng)基上同時(shí)對(duì)所有菌落進(jìn)行選擇培養(yǎng)，鑒定效率大大提高。注意：(1)最初的培養(yǎng)基必須是非選擇性的，即各種突變型都能夠在其上生長(zhǎng)；(2)必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缤坎蓟騽澗€法，以使培養(yǎng)物菌落之間要分開。當(dāng)前第13頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)影印培養(yǎng)法當(dāng)前第14頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)細(xì)菌基因重組的方式一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的DNA與另一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞DNA的交換重組可以通過四種不同的方式進(jìn)行：轉(zhuǎn)化接合性導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)前第15頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)第二節(jié)細(xì)菌的遺傳分析一、轉(zhuǎn)化二、接合三、性導(dǎo)當(dāng)前第16頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)一、轉(zhuǎn)化(transformation)(一)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(二)、轉(zhuǎn)化過程(三)、共同轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制當(dāng)前第17頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)化(transformation)是指某些細(xì)菌(或其他生物)能通過其細(xì)胞膜攝取周圍供體(donor)的染色體片段，并將此外源DNA片段通過重組整合到自己染色體組的過程。只有當(dāng)整合的DNA片段產(chǎn)生新的表現(xiàn)型時(shí)，才能測(cè)知轉(zhuǎn)化的發(fā)生。轉(zhuǎn)化中接受供體遺傳物質(zhì)的稱為受體(receptor)。大部分的轉(zhuǎn)化工作是用肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoniae)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)和流感嗜血桿菌(Hemophilusinfluenzae)進(jìn)行的。當(dāng)前第18頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(一)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1.基礎(chǔ)知識(shí)野生型肺炎雙球菌的菌落為光滑型，一種突變型為粗糙型，兩者根本差異在于莢膜形成；莢膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性；不同抗原型是遺傳的、穩(wěn)定的，一般情況下不發(fā)生互變。莢膜菌落毒性類型光滑型S發(fā)達(dá)光滑有I,II,III粗糙型R無粗糙無I,II當(dāng)前第19頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)2.Griffith轉(zhuǎn)化研究當(dāng)前第20頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)Griffith對(duì)其試驗(yàn)結(jié)論及發(fā)展根據(jù)上述研究結(jié)果Griffith認(rèn)為：(有毒)死細(xì)菌中的某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到(無毒)活細(xì)菌中，并使之具有毒性，導(dǎo)致小家鼠死亡。他將這種細(xì)菌遺傳類型的轉(zhuǎn)變稱為轉(zhuǎn)化，并將引起轉(zhuǎn)化的物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)化因子(tranformingprinciple)。以后一些研究者重復(fù)上述試驗(yàn)，并且加入了體外培養(yǎng)試驗(yàn)，即：將加熱殺死的SIII細(xì)菌與無毒RII細(xì)菌混合培養(yǎng)，然后注入小家鼠體內(nèi)，同樣導(dǎo)致家鼠死亡。表明：細(xì)菌在培養(yǎng)條件下也能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳類型間的定向轉(zhuǎn)化。當(dāng)前第21頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)3.阿維利(Avery)等的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(1944)當(dāng)前第22頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：來源于加熱殺死的SIII細(xì)菌，并使RII細(xì)菌轉(zhuǎn)化成為SIII型細(xì)菌的轉(zhuǎn)化因子是DNA。轉(zhuǎn)化定義為：某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。Avery等人的實(shí)驗(yàn)也表明：決定細(xì)菌遺傳類型的物質(zhì)是DNA，即證明了DNA就是遺傳物質(zhì)。但由于他們采用的實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)時(shí)不被人們廣泛接受，而且得出的結(jié)論與當(dāng)時(shí)人們的傳統(tǒng)觀念(認(rèn)為蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì))不符合，而長(zhǎng)期沒有得到人們的承認(rèn)。當(dāng)前第23頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(二)、轉(zhuǎn)化過程不同細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程有一定差異，但是它們都存在幾個(gè)共同特征：1.感受態(tài)與感受態(tài)因子：感受態(tài)指細(xì)菌能夠從周圍環(huán)境中吸收DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。感受態(tài)主要受一類蛋白質(zhì)(感受態(tài)因子)影響，感受態(tài)因子可以在細(xì)菌間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從感受態(tài)細(xì)菌中傳遞到非感受態(tài)細(xì)菌中，可以使后者變?yōu)楦惺軕B(tài)。一般認(rèn)為感受態(tài)出現(xiàn)在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，并且某些處理過程可以誘導(dǎo)或加強(qiáng)感受態(tài)，以大腸桿菌為例，用Ca2+(如CaCl2)處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的大腸桿菌可以增強(qiáng)其感受能力。當(dāng)前第24頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)化過程2.供體(donor)DNA與受體(receptor)細(xì)胞結(jié)合(binding)：結(jié)合發(fā)生在受體細(xì)胞特定部位；供體DNA片段為雙鏈；結(jié)合過程是一個(gè)可逆過程。3.DNA的穿入和攝?。寒?dāng)細(xì)菌結(jié)合點(diǎn)飽和之后，細(xì)菌開始攝取外源DNA；往往只有一條DNA單鏈進(jìn)入細(xì)胞，另一條鏈在膜上降解。4.聯(lián)會(huì)(synapsis)與外源DNA片段整合(integration)：整合就是指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的置換，穩(wěn)定地?fù)饺氲绞荏wDNA中的過程。整合是一個(gè)遺傳重組的過程。因而研究整合的分子機(jī)制也為遺傳重組的分子機(jī)制作出了貢獻(xiàn)。當(dāng)前第25頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)化過程當(dāng)前第26頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程當(dāng)前第27頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(三)、共轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制利用共同轉(zhuǎn)化繪制細(xì)菌連鎖遺傳圖譜的基本原理：相鄰基因發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的概率與兩者的距離間成反向關(guān)系，基因間距離越近，發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的頻率越高，反之越低。因此可能通過測(cè)定兩基因共同轉(zhuǎn)化的頻率來指示基因間的相對(duì)距離。當(dāng)前第28頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜按照概率定律，兩個(gè)片段同時(shí)轉(zhuǎn)化的概率應(yīng)為它們單獨(dú)轉(zhuǎn)化的概率的乘積，所以這種情況的概率是很低的。當(dāng)兩個(gè)基因緊密連鎖時(shí)，它們就有較多的機(jī)會(huì)包括在同一個(gè)DNA片段中，并同時(shí)整合到受體染色體中。因此，緊密連鎖的基因可以通過轉(zhuǎn)化進(jìn)行作圖。例如，黎德伯格等人用枯草桿菌作了如下實(shí)驗(yàn)，即以trp2+his2+tyr1+為供體，以trp2-his2-tyr1-為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果如表。

當(dāng)前第29頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)化結(jié)果當(dāng)前第30頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜可以看出，trp2、his2和tyr1是連鎖的，其中his2和tyr1連鎖緊密，這是因?yàn)樗鼈儾l(fā)轉(zhuǎn)化的頻率最高。根據(jù)重組值計(jì)算結(jié)果，可知trp2-his2的重組值為34%，trp2-tyr1的重組值為40%，his2-tyr1的重組值為13%，因此，trp2、his2及tyr1的排列順序?yàn)椋?/p>

當(dāng)前第31頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)二、接合(conjugation)在原核生物中，接合是指遺傳物質(zhì)從供體—“雄性”轉(zhuǎn)移到受體—“雌性”的過程。(一)、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)(二)、F因子及其在雜交中的行為(三)、中斷雜交試驗(yàn)作圖當(dāng)前第32頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(一)、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)黎德伯格和塔特姆大腸桿菌雜交試驗(yàn)：材料：大腸桿菌(Escherichiacoli)K12菌株的兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型品系：A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-；B—蘇氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-。方法：將A、B混和，在基本培養(yǎng)基(固體)上涂布培養(yǎng)。結(jié)果：平板上長(zhǎng)出原養(yǎng)型菌落(++++)。當(dāng)前第33頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)黎德伯格和塔特姆接合試驗(yàn)當(dāng)前第34頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)幾種可能解釋及其分析對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果原養(yǎng)型菌落可能產(chǎn)生于：親本細(xì)菌A或B發(fā)生了回復(fù)突變；兩品系細(xì)胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料——互養(yǎng)作用；兩品系間發(fā)生了轉(zhuǎn)化作用；發(fā)生細(xì)胞融合，形成了異核體或雜合二倍體。為了驗(yàn)證這些原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的可能而進(jìn)行的研究最終表明：這些解釋均不成立。當(dāng)前第35頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)回復(fù)突變可能的排除Lederbery和Tatum利用的雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行試驗(yàn)，已基本排除A或B品系發(fā)生回復(fù)突變產(chǎn)生原養(yǎng)型細(xì)菌的可能。單基因回復(fù)突變的頻率約為10-6；雙基因回復(fù)突變的頻率則為10-12，頻率很低。但試驗(yàn)中產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的頻率非常高，因此基本可以排除回復(fù)突變的可能。當(dāng)前第36頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)互養(yǎng)作用及其排除試驗(yàn)材料：A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)；B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。試驗(yàn)方法：將A、B品系混合接種在基本培養(yǎng)基表面；短時(shí)間后噴T1殺死A品系，使其不能持續(xù)產(chǎn)生thr與leu供B品系持續(xù)生長(zhǎng)。結(jié)果與結(jié)論：仍然出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。從而表明互養(yǎng)并非原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)的原因，而可能發(fā)生了遺傳重組。當(dāng)前第37頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)化作用及其排除把品系A(chǔ)的培養(yǎng)液經(jīng)加熱滅菌，加入到B品系的培養(yǎng)物中，未得到原養(yǎng)型菌落；表明原養(yǎng)型菌落可能不是由轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生。戴維斯(Dawis,1950)的U型管試驗(yàn)(結(jié)果沒有得到原養(yǎng)型細(xì)菌)；實(shí)驗(yàn)結(jié)論：細(xì)胞直接接觸是原養(yǎng)型細(xì)菌產(chǎn)生的必要條件。當(dāng)前第38頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)經(jīng)過上述分析可以認(rèn)為：在Lederbery和Tatum的試驗(yàn)中，發(fā)生了一種不同于轉(zhuǎn)化的遺傳重組方式，稱之為接合。Hayes(1952)研究表明：大腸桿菌兩種不同菌株(品系)接合過程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的；從而認(rèn)為大腸桿菌存在兩種類型品系：雌性與雄性分別作為接合過程中遺傳物質(zhì)的供體與受體。接合(conjugation)：遺傳物質(zhì)從供體(donor)轉(zhuǎn)移到受體(receptor)的重組過程。當(dāng)前第39頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)當(dāng)前第40頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(二)、F因子及其在雜交中的行為1.F因子：Hayes等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在接合中作供體的能力受細(xì)胞內(nèi)一種致育因子(fertilityfactor,F因子;sexfactor,性因子)控制。F因子的化學(xué)本質(zhì)是DNA，可以自主狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中或整合到細(xì)菌的染色體上。F因子可以在細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移并傳遞遺傳物質(zhì)。當(dāng)前第41頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)F因子的存在狀態(tài)當(dāng)前第42頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)接合現(xiàn)象具有F因子的菌株可作為供體，因?yàn)镕因子中有控制F性傘毛(Fpillus)形成的基因。F性傘毛是由供體細(xì)胞表面伸出的一種長(zhǎng)附屬物，當(dāng)供體與受體細(xì)胞相互接合，F(xiàn)性傘毛就成了兩個(gè)細(xì)胞之間原生質(zhì)的通道，或叫接合管(conjugationtube)。F+細(xì)胞的F因子由接合管向F-傳遞，使F–受體變成F+。當(dāng)前第43頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)F因子及其在雜交中的行為當(dāng)前第44頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)F因子及其在雜交中的行為當(dāng)前第45頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)F因子及其在雜交中的行為當(dāng)前第46頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)F因子及其在雜交中的行為當(dāng)前第47頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)(三)、中斷雜交試驗(yàn)作圖雅各布(Jacob，F(xiàn))和沃爾曼(Wollman，E.)在五十年代設(shè)計(jì)了一個(gè)著名的中斷雜交試驗(yàn)(interruptedmatingexperiment)。他們采用的菌株基因型為：Hfr:thr+leu+aziStonSlac+gal+strSF–:thr–leu–aziRtonRlac–gal-strR這里，thr、leu、lac、gal分別代表蘇氨酸、亮氨酸、乳糖和半乳糖，+代表原養(yǎng)型或發(fā)酵型，–代表營(yíng)養(yǎng)缺陷型或不發(fā)酵型；azi和tonA分別代表疊氮化納和T1噬菌體；Str表示鏈霉素，R代表抗性，S代表敏感。當(dāng)前第48頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖將兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，把菌液放在食物攪拌器內(nèi)攪拌，以中斷接合。將中斷接合的細(xì)菌接種到含有鏈霉素的幾種不同培養(yǎng)基上，測(cè)定形成了什么樣的重組體(鏈霉素可殺死所有的Hfr供體細(xì)胞)。當(dāng)前第49頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖結(jié)果表明，thr+最先進(jìn)入F-細(xì)胞，接合8分鐘后便出現(xiàn)了重組體，leu+隨后半分鐘出現(xiàn)，aziS在9分鐘時(shí)出現(xiàn)等等。在被選擇的thr+leu+的重組體中，其它的供體基因接連出現(xiàn)，不同的基因經(jīng)過一定時(shí)間就上升到一個(gè)穩(wěn)定的水平。當(dāng)前第50頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖當(dāng)前第51頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖在檢查F-細(xì)胞是否得到thr+，可用不加thr而含str、leu的培養(yǎng)基，在這里，只有thr+strR才能生長(zhǎng)，能長(zhǎng)的細(xì)胞就是供體thr+已經(jīng)進(jìn)入受體并發(fā)生了重組的細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果列于表。當(dāng)前第52頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖上述事實(shí)說明，Hfr菌株的基因是按一定的線性順序依次進(jìn)入F–菌株的，染色體從原點(diǎn)以直線方式進(jìn)入F–細(xì)胞。基因位點(diǎn)離原點(diǎn)愈近，進(jìn)入F–細(xì)胞愈早，反之則晚。根據(jù)中斷雜交的實(shí)驗(yàn)，用Hfr基因在F–細(xì)胞中出現(xiàn)的時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，可以作出大腸桿菌的遺傳連鎖圖。當(dāng)前第53頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖用不同的Hfr菌株進(jìn)行中斷雜交實(shí)驗(yàn)所作出的大腸桿菌基因連鎖圖，其基因向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移的順序大不相同。當(dāng)前第54頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖初看起來，似乎每個(gè)菌株的基因轉(zhuǎn)移順序有所不同。其實(shí)，轉(zhuǎn)移的順序并不是隨機(jī)的。例如，所有的his基因都有g(shù)al在一邊，gly在另一邊。其他基因也是如此，除非它們?cè)谶B鎖群的另一端。這個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明F因子和細(xì)菌染色體都是環(huán)狀的，而Hfr細(xì)胞染色體的形成，則因F因子插入環(huán)狀染色體的不同位置，而形成了不同的轉(zhuǎn)移原點(diǎn)和轉(zhuǎn)移方向。

當(dāng)前第55頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖當(dāng)前第56頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)中斷雜交試驗(yàn)作圖如果兩個(gè)基因間的轉(zhuǎn)移時(shí)間小于2分鐘，用中斷雜交法所得的圖距不太可靠，應(yīng)采用傳統(tǒng)的重組作圖法(recombinationmapping)。例如，有兩個(gè)緊密連鎖的基因：lac+(乳糖發(fā)酵)和ade–(腺嘌呤缺陷型)，為了求得這兩個(gè)基因間的距離，可采用Hfrlac+ade+×F–lac–ade–的雜交實(shí)驗(yàn)。用完全培養(yǎng)基但不加腺嘌呤，可以選出F–ade+的菌落。由于ade進(jìn)入F–細(xì)胞的順序較lac為晚，因此，lac–自然也已經(jīng)進(jìn)入。如果選出ade+，同時(shí)也是lac+，lac–ade間沒有發(fā)生過交換；如果是lac–，說明兩者之間發(fā)生過交換。當(dāng)前第57頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)基因的重組兩基因間的重組頻率是22%。但這兩個(gè)位點(diǎn)間的時(shí)間單位約為1分鐘，可見1個(gè)時(shí)間單位(分鐘)大約相當(dāng)于20%的重組值。用重組頻率與中斷雜交法所測(cè)得的基因距離是大致符合的。當(dāng)前第58頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)三、性導(dǎo)(sexduction)與F?因子性導(dǎo)(sexduction)是指接合時(shí)由F′因子所攜帶的外源DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)菌染色體的過程。F因子整合到宿主細(xì)菌染色體的過程是可逆的，當(dāng)發(fā)生環(huán)出(loopingout)時(shí)，F(xiàn)因子又重新離開染色體。然而F因子偶然在環(huán)出時(shí)不夠準(zhǔn)確，它攜帶有染色體的一些基因。阿代爾伯格和伯恩斯(Adelberg，E.和Burns，S.，1959)稱這種F因子為F′因子。當(dāng)前第59頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)性導(dǎo)(sexduction)與F?因子F′因子使細(xì)菌帶有某些突出的特點(diǎn)：第一，F(xiàn)′因子以極高的比率轉(zhuǎn)移它的基因，如同F(xiàn)+細(xì)菌以極高的比率轉(zhuǎn)移它的F+因子一樣；第二，F(xiàn)′因子有極高的自然整合率，而且整合在一定的座位上，因?yàn)樗信c細(xì)菌染色體的同源區(qū)段。

當(dāng)前第60頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)性導(dǎo)(sexduction)與F?因子性導(dǎo)在大腸桿菌的遺傳學(xué)研究中十分有用。第一，不同的F′因子帶有不同的細(xì)菌DNA片段，利用不同的F′的性導(dǎo)可以測(cè)定不同基因在一起轉(zhuǎn)移的頻率。其次，觀察由性導(dǎo)形成的雜合部分二倍體中某一性狀的表現(xiàn)，可以確定這一性狀的等位基因的顯隱關(guān)系。第三，性導(dǎo)形成的部分二倍體也可用作互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)，確定兩個(gè)突變型是同屬于一個(gè)基因還是不同基因。當(dāng)前第61頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)第三節(jié)噬菌體的遺傳分析一、烈性噬菌體二、溫和噬菌體三、轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)前第62頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)噬菌體的遺傳分析

遺傳學(xué)上應(yīng)用最廣泛的是大腸桿菌的T噬菌體系列(T1到T7)。T偶列噬菌體具有六角形的頭部，其內(nèi)含有雙鏈DNA分子。頭下的尾部包括一個(gè)中空的針狀結(jié)構(gòu)及外鞘。末端是基板，由尾絲及尾針組成。通過尾鞘的收縮將噬菌體DNA經(jīng)中空尾部注入宿主細(xì)胞。根據(jù)噬菌體DNA在宿主細(xì)菌內(nèi)的特點(diǎn)，又將噬菌體分為兩類。當(dāng)前第63頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)一、烈性噬菌體噬菌體的遺傳物質(zhì)經(jīng)中空尾部進(jìn)入宿主細(xì)胞，遂即破壞宿主細(xì)胞原有的遺傳物質(zhì)，并轉(zhuǎn)而合成大量的噬菌體遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)，組裝成許多新的子噬菌體，最后使細(xì)菌裂解(lysis)。當(dāng)前第64頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)二、溫和噬菌體溫和性噬菌體具有溶源性(lysogeny)的生活周期，即在噬菌體侵入后，細(xì)菌并不裂解，它們以兩種不同形式出現(xiàn)，λ和P1噬菌體各代表一種略有不同的溶原性類型。λ噬菌體附著于大腸桿菌染色體的gal和bio位點(diǎn)之間的attλ座位上(attachmentsite)，它能通過交換而整合到細(xì)菌染色體上。這時(shí)它會(huì)阻止其他λ噬菌體的超數(shù)感染(superinfection)(一個(gè)細(xì)菌受一個(gè)以上噬菌體所感染的現(xiàn)象)。整合的噬菌體稱為原噬菌體(prophage)。P1噬菌體與λ不同，它并不整合到細(xì)菌的染色體上，而是獨(dú)立地存在于它的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)前第65頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)溫和噬菌體當(dāng)前第66頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)溫和噬菌體這兩種噬菌體的共同特點(diǎn)是核酸既不大量的復(fù)制，也不大量的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這類噬菌體往往只有一個(gè)或少數(shù)基因表達(dá)，由此產(chǎn)生的阻遏物能關(guān)閉其他基因的表達(dá)。當(dāng)溶源性細(xì)菌分裂成兩個(gè)子細(xì)胞時(shí)，噬菌體λ隨細(xì)菌染色體的復(fù)制而復(fù)制，每個(gè)子細(xì)胞中有一個(gè)拷貝。噬菌體P1的復(fù)制則使每個(gè)子細(xì)胞中至少含有一個(gè)拷貝。原噬菌體通過誘導(dǎo)(induction)可轉(zhuǎn)變?yōu)榱倚允删w。誘導(dǎo)可以通過不同的方式進(jìn)行，如UV照射、溫度改變、與非溶源性細(xì)菌的接合等。這類誘導(dǎo)可以造成阻遏物失活或稀釋，使其他的噬菌體基因表達(dá)出來，促使噬菌體繁殖并進(jìn)入裂解周期。

當(dāng)前第67頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)三、轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)是指以噬菌體為媒介所進(jìn)行的細(xì)菌遺傳物質(zhì)重組的過程。它與上述的轉(zhuǎn)化、性導(dǎo)、接合的主要不同之處，在于它是以噬菌體為媒介的。在這一過程中，細(xì)菌的一段染色體被錯(cuò)誤地包裝在噬菌體的蛋白質(zhì)外殼內(nèi)，并通過感染而轉(zhuǎn)移到另一個(gè)受體細(xì)菌內(nèi)。當(dāng)前第68頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)黎德伯格等在鼠傷寒沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。用兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交，一個(gè)不能合成苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(phe-、trp-、tryr-),另一個(gè)不能合成甲硫氨酸和組氨酸(met-、his-)，結(jié)果在基本培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)原養(yǎng)型的菌落。為了確定是否發(fā)生了接合，將兩種菌株分別放在U型管的兩臂內(nèi)，中間用玻璃濾板隔開，以防止細(xì)胞直接接觸，但可以允許比細(xì)菌小的物質(zhì)通過，竟然也獲得了野生型重組型。當(dāng)前第69頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)可能的結(jié)論是，這種重組是通過一種過濾性因子(filterableagent，F(xiàn)A)而實(shí)現(xiàn)的。由于FA不受DNA酶的影響，這樣就消除了轉(zhuǎn)化作用的可能性。進(jìn)一步研究證明，F(xiàn)A是一種噬菌體，稱為P22，它對(duì)親本菌株之一是溶源性的。支持這個(gè)結(jié)論的證據(jù)是：(1)FA的大小和質(zhì)量與P22相同；(2)FA用抗P22血清處理后失活。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalizedtransduction)和特殊性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specializedtransduction)兩大類。當(dāng)前第70頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)當(dāng)前第71頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

1.普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)在噬菌體感染的末期，細(xì)菌染色體被斷裂成許多小片段，在形成噬菌體顆粒時(shí)，少數(shù)噬菌體將細(xì)菌的DNA誤認(rèn)做是它們自己的DNA，并以其外殼蛋白將其包圍，從而形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。由于可以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌染色體組的任何不同部分，因此稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種假噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒(transducingparticle)。這種顆粒既然不攜帶噬菌體基因，對(duì)受體細(xì)菌就沒有有害的影響。當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒將它的內(nèi)含物注入受體細(xì)菌后，形成一個(gè)部分二倍體，導(dǎo)入的基因經(jīng)過重組，整合到宿主的染色體上。由此形成的具有重組遺傳結(jié)構(gòu)的細(xì)菌細(xì)胞叫做轉(zhuǎn)導(dǎo)體(transductant)。當(dāng)前第72頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個(gè)基因同在一起轉(zhuǎn)導(dǎo)稱為合轉(zhuǎn)導(dǎo)(cotransduction)，合轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率愈高，表明兩個(gè)基因在染色體上的距離愈近，連鎖愈密切；相反，如果兩個(gè)基因的合轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率很低，就說明它們之間距離較遠(yuǎn)。通過觀察兩因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(two-factortransduction)，計(jì)算并比較每?jī)蓚€(gè)基因之間的合轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，就可以確定三個(gè)基因或三個(gè)以上基因在染色體上的排列順序。例如a基因和b基因的合轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率很高，和c基因的合轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率也很高，而b和c很少或完全不在一起轉(zhuǎn)導(dǎo)，這三個(gè)基因的次序就應(yīng)為bac。如果研究三因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(three-factortransduction)，只需分析一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就可以推出三個(gè)基因的次序。當(dāng)前第73頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

例如,供體大腸桿菌具有基因型a+b+c+，受體的基因型為a-b-c-。供體用P1噬菌體感染，P1的后代再用來感染受體細(xì)胞，然后把受體細(xì)胞接種在選擇培養(yǎng)基上。如果通過中斷雜交已知三個(gè)基因中的一個(gè)如a不在中間，就可對(duì)a+進(jìn)行選擇，即在對(duì)a+進(jìn)行選擇的選擇培養(yǎng)基上，把可以生長(zhǎng)的a+細(xì)胞選出來。然后，再把被選擇的受體細(xì)胞重復(fù)接種在其他對(duì)b+或c+進(jìn)行選擇的選擇培養(yǎng)基上，檢查a+細(xì)胞是否同時(shí)具有b+和c+。最少的一類轉(zhuǎn)導(dǎo)體應(yīng)當(dāng)代表最難于轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)體是同時(shí)發(fā)生交換次數(shù)最多的一類。它的兩邊應(yīng)為供體基因，而中間為受體基因，如正確次序?yàn)閍bc，就應(yīng)為a+b-c+。假定由實(shí)驗(yàn)得到的最少的轉(zhuǎn)導(dǎo)體類別為a+b+c-，那么就可以確定，這三個(gè)基因的正確次序應(yīng)當(dāng)是acb或bca，而不是abc。當(dāng)前第74頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)前第75頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)如果把三個(gè)基因中每?jī)蓚€(gè)基因的合轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率算出來，還可推算出三個(gè)基因之間的物理距離。若兩個(gè)基因緊密連鎖，就可能經(jīng)常在一起轉(zhuǎn)導(dǎo)，合轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率將接近于1。如果兩個(gè)基因從來或者幾乎不包含在同一轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA片段中，它們的合轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率接近于或等于0。利用這種關(guān)系可以求出同一染色體上兩個(gè)基因之間的物理距離。經(jīng)推導(dǎo)，得到以下計(jì)算公式：d=同一染色體上兩基因之間的物理距離。L=轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA的平均長(zhǎng)度。.X=兩個(gè)基因合轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率。轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒DNA的平均長(zhǎng)度(約為1個(gè)病毒基因組的大小)知道后，就可以依上述公式估算出兩個(gè)較近基因間的分子距離。當(dāng)前第76頁\共有85頁\編于星期六\8點(diǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

p1噬菌體可以攜帶大腸桿菌DNA的任何部分，在分析大腸桿菌基因的連鎖關(guān)系上是很有效的。例如,先利用普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體P1，侵染帶有l(wèi)eu+、thr+、aziR三個(gè)基因的大腸桿菌，再用來自后者(供體)的P1侵染帶有l(wèi)eu-、thr-、aziS

的三個(gè)標(biāo)記基因的大腸桿菌(受體)，然后將受體細(xì)菌進(jìn)行特定培養(yǎng)，以測(cè)定該三個(gè)基因的連鎖關(guān)系。其方法是把受體細(xì)菌培養(yǎng)在一種可以選擇1-2個(gè)標(biāo)記基因而不選擇其余標(biāo)記基因的培養(yǎng)基上。例如，把受體細(xì)菌放在沒有疊氮化鈉(azi)但加有蘇氨酸(thr)的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，于是leu就成為選擇的標(biāo)記基因，因?yàn)樵谠撆囵B(yǎng)基上只有l(wèi)eu+細(xì)胞才能生長(zhǎng)。thr和azi是未選擇的標(biāo)記基因，因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)基內(nèi)有thr時(shí)，其標(biāo)記基因可能是thr+或thr–；當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)無疊氮化鈉時(shí)，其標(biāo)記基因可能是aziR或aziS。對(duì)每個(gè)選擇的標(biāo)記基因進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，以確