腦心同治理論與丹紅注射液研究萬(wàn)海同

腦心同治理論與丹紅注射液對(duì)腦缺血性損傷保護(hù)機(jī)制研究

浙江中醫(yī)藥大學(xué)萬(wàn)海同教授當(dāng)前第1頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

萬(wàn)海同二級(jí)教授首席教授博導(dǎo)所長(zhǎng)院長(zhǎng)

國(guó)家百千萬(wàn)人才工程專家享受國(guó)務(wù)院政府津貼人員國(guó)家中醫(yī)藥管理局“十二五”重點(diǎn)學(xué)科（中醫(yī)工程學(xué)）帶頭人國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)臨床基礎(chǔ)重點(diǎn)學(xué)科帶頭人浙江省高校腦血管病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)腦心同治專業(yè)委員會(huì)主任委員浙江省中西醫(yī)結(jié)合腦病重點(diǎn)學(xué)科負(fù)責(zé)人浙江中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管疾病研究所所長(zhǎng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物工程學(xué)院院長(zhǎng)浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科（中藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)）帶頭人中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥制劑分會(huì)副主任

當(dāng)前第2頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)主要內(nèi)容三丹紅注射液對(duì)腦缺血性損傷保護(hù)機(jī)制研究二腦心同治理論一心腦血管疾病的防治現(xiàn)狀當(dāng)前第3頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

第一部分心腦血管疾病的防治現(xiàn)狀當(dāng)前第4頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)一、心腦血管病是一復(fù)雜、難治性疾病，對(duì)人類危害嚴(yán)重防治腦病已成為社會(huì)和醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的重要課題死亡率居高不下世界范圍：死于心腦血管病1500萬(wàn)人/年；

占全球死亡人數(shù)的三分之一至二分之一；

是危害人類最大疾病。

中國(guó)：死于心腦血管病每天有7000人，每12秒鐘就有1人；首次發(fā)年齡，30%以上在60歲之前。

當(dāng)前第5頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)我國(guó)心腦血管疾病患者已經(jīng)超過(guò)2.7億人！

我國(guó)每年死于心腦血管疾病300萬(wàn)人！幸存下來(lái)的患者：75%不同程度喪失勞動(dòng)能力；50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理；40%重殘。我國(guó)腦中風(fēng)病人出院后第一年的復(fù)發(fā)率是30%，第五年的復(fù)發(fā)率高達(dá)59%；而二級(jí)預(yù)防做得較好的美國(guó)僅為10%。當(dāng)前第6頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)各種危險(xiǎn)因素居高不下中國(guó)目前總共有：1.6億高血壓患者；6000萬(wàn)糖尿病患者；1.6億人群血脂異常；2億人體重超標(biāo)；6000萬(wàn)人肥胖；還有大量煙民、酒客更令人憂慮：城鄉(xiāng)差別不大；中年人與老年人患病率接近；中風(fēng)與心肌梗塞、心力衰竭常伴隨發(fā)生。當(dāng)前第7頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

二、抗血栓治療成為西醫(yī)學(xué)治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦梗死治療的重要基石隨著心腦缺血性血管疾病發(fā)生率增加，越來(lái)越多患者需要長(zhǎng)期應(yīng)用抗血栓藥物，臨床常用抗凝藥物為華法林，抗血栓藥物多為氯吡格雷及阿司匹林等。尤其是抗血小板聚集藥已成為心腦血管疾病常規(guī)治療。當(dāng)前第8頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)三、西醫(yī)學(xué)對(duì)腦梗死內(nèi)科治療仍是抗栓、溶栓等，有一定療效，但也有并發(fā)癥等溶栓

降纖

血栓、栓子血管堵塞缺血損傷抗血栓迅速?gòu)?fù)流腦保護(hù)減慢缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)

限制再損傷

易致出血性梗死并發(fā)癥

再閉塞不足之處不能改善半暗區(qū)血供當(dāng)前第9頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

抗血小板藥物作用機(jī)制圖偱證醫(yī)學(xué)新證據(jù)表明：

抗血栓西藥療效欠佳，并認(rèn)為抗血小板西藥是一把雙刃劍：在降低心腦血管不良事件的同時(shí)，許多抗血小板聚集西藥也帶來(lái)了出血并發(fā)癥?？寡ㄋ幬镏饕郑嚎寡“寰奂?、抗凝血藥、溶血栓藥

當(dāng)前第10頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)主要副作用：口服抗血栓藥物引起顱內(nèi)出血的發(fā)生率在9-13％，死亡率超過(guò)50％抗凝溶栓對(duì)已形成血栓無(wú)直接溶栓作用，且溶栓易致出血性梗死(腦出血6.4%-19.8%，腦死亡率50%）和再閉塞等危險(xiǎn)阿司匹林藥物抵抗率達(dá)5.5%-61%當(dāng)前第11頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)藥物種類藥物作用機(jī)制試驗(yàn)狀況谷氨酸鈉拮抗劑CGS19755競(jìng)爭(zhēng)性NMDA拮抗劑三期無(wú)效YM-872AMPA受體拮抗劑三期無(wú)效ApiganelNMDA通道阻滯劑三期無(wú)效鎂NMDA受體拮抗劑三期無(wú)效GV150526NMDA拮抗劑三期無(wú)效電壓門(mén)鈣通道拮抗劑尼莫地平減少鈣離子內(nèi)流三期無(wú)效鉀通道激動(dòng)劑BMS-204352減少鈣離子內(nèi)流三期無(wú)效鈉通道拮抗劑磷酸苯妥英降低興奮性氨基酸釋放三期無(wú)效5羥色胺能受體激動(dòng)劑Repinotan三期無(wú)效伽馬氨基丁酸激動(dòng)劑氯美噻唑降低興奮性氨基酸釋放三期無(wú)效自由基清除劑替拉扎特降低自由基團(tuán)的損傷三期無(wú)效依布硒啉三期無(wú)效依達(dá)拉奉三期有效NXY-059三期無(wú)效星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑ONO-2506三期無(wú)效一氧化氮供體硝酸甘油二期無(wú)效一氧化氮阻滯劑蘆貝魯唑減少NO介導(dǎo)損傷三期無(wú)效目前臨床上還缺少療效滿意的西藥,通常采用中西醫(yī)結(jié)合的方法當(dāng)前第12頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)三、步長(zhǎng)腦心通膠囊、丹紅注射液等活血化瘀、或益氣活血中藥已廣泛用于心腦血管疾病，如缺血性心臟病、缺血性中風(fēng)等）及血栓性疾病等，具有較好療效。當(dāng)前第13頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

第二部分腦心同治理論當(dāng)前第14頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)一、腦心同治理論繼承和發(fā)展了中醫(yī)的整體觀、辨證施治理論“天人合一”的整體觀“因時(shí)因地因人”辨證施治激發(fā)人體自身抗御疾病的特點(diǎn)

中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)當(dāng)前第15頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)二、腦心同治理論的依據(jù)中風(fēng)（腦卒中）胸痹（冠心?。馓撗鲎C證屬益氣活血化瘀通絡(luò)治則證同治則同異病同治趙步長(zhǎng)教授認(rèn)為腦心同治理論對(duì)中風(fēng)、胸痹的認(rèn)識(shí)腦心同治理論的機(jī)制研究氣虛、血瘀、痰濁、絡(luò)阻病機(jī)益氣、活血、化痰、通絡(luò)治則探討氣、血、痰（及瘀）、絡(luò)的相互關(guān)系現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)《腦心同治》理論核心：

從整體觀角度來(lái)詮釋心腦血管病（中風(fēng)、胸痹）的證屬與病機(jī)、治則（一）中醫(yī)角度

當(dāng)前第16頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（二）中醫(yī)腦心同治理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)的相關(guān)性

中風(fēng)（腦卒中）胸痹（冠心病）氣虛血瘀證證屬益氣活血化瘀通絡(luò)治則證同治則同異病同治趙步長(zhǎng)教授認(rèn)為宏觀準(zhǔn)確性微觀精確性腦心同治理論對(duì)中風(fēng)胸痹認(rèn)識(shí)：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)心、腦血管病認(rèn)識(shí)：內(nèi)皮損傷血小板凝集、活化、血栓形成血漿成分通透性增強(qiáng)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞被激活VEGF，淋巴循環(huán)泡沫細(xì)胞平滑肌細(xì)胞移行、增生脂蛋白變性纖維肌性內(nèi)膜增厚膠原蛋白彈性應(yīng)蛋白防御結(jié)構(gòu)的障礙（HDL）異常粥樣硬化灶動(dòng)脈狹窄、阻塞或痙攣臨床發(fā)作冠心病、腦梗塞等PDGF高脂血癥、高血壓、吸煙等當(dāng)前第17頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)動(dòng)脈粥樣瘢塊形成及其后果瘢塊開(kāi)始形成穩(wěn)定瘢塊不穩(wěn)定瘢塊瘢塊破裂當(dāng)前第18頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)當(dāng)前第19頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)危險(xiǎn)因素:高血壓、血脂異常糖尿病、吸煙、肥胖（中心型）動(dòng)脈粥樣硬化左室肥厚冠脈病變心肌缺血冠脈栓塞心肌、腦梗死心腦血管病事件鏈(continuum)神經(jīng)體液激活心律失常心肌損失心性猝死心臟重構(gòu)心室擴(kuò)大心衰心臟病終末期當(dāng)前第20頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)無(wú)癥狀自然消退或增大復(fù)原功能不良短期死亡（≤28天）晚期復(fù)發(fā)（﹥28天）晚期死亡（﹥28天）疾病狀態(tài)血管內(nèi)粥樣瘢塊不斷發(fā)展瘢塊或血栓的表面破裂癥狀性缺血

猝死動(dòng)脈硬化性心腦血管病自然進(jìn)程

基礎(chǔ)病變促發(fā)因素急性事件中期和晚期發(fā)展（幾年至幾十年）（幾秒鐘或幾小時(shí)）（幾秒鐘或幾小時(shí)）（幾天至幾年）時(shí)間順序當(dāng)前第21頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)三、中醫(yī)藥防治心腦血管病常用藥益氣藥：黃芪、太子參等活血化瘀藥：水蛭、蜈蚣、地龍、全蝎當(dāng)歸、川芎、丹參、紅花、

赤芍、桃仁、雞血藤、牛膝等理氣、通陽(yáng)藥：乳香、沒(méi)藥、桂枝當(dāng)前第22頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)配伍用藥是中藥復(fù)方（或方劑）發(fā)揮藥效的關(guān)鍵，是中醫(yī)處方用藥的核心方劑配伍基本內(nèi)容：“七情合和”與“君臣佐使”理論“君臣佐使”則表明中藥配伍中藥組分有主有次。主藥在治病中發(fā)揮主導(dǎo)作用，輔藥在治療中促使主藥藥力得以充分發(fā)揮，同時(shí)抑制主藥的毒副作用。

中醫(yī)重視復(fù)方用藥及其中藥配伍理論當(dāng)前第23頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

丹紅注射液、腦心通膠囊等中藥制劑相對(duì)于西藥抗血小板作用機(jī)制單一，具有多組分、多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)。意味著本品可能有更少耐藥性和更少副作用。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)的作用特征當(dāng)前第24頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)四、中藥目前面臨的困惑“？”中藥在醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域的作用逐漸被國(guó)內(nèi)外同行認(rèn)可和關(guān)注。困惑：中藥如何發(fā)揮作用？這些作用如何科學(xué)表達(dá)？中醫(yī)藥如何合理使用？如何達(dá)到中藥清楚定位并做到“精準(zhǔn)用藥”？目前這些問(wèn)題尚不十分清楚國(guó)內(nèi)外同行基本一致認(rèn)同是：中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)說(shuō)不清中藥作用機(jī)理說(shuō)不清中藥（組分）相互作用說(shuō)不清質(zhì)量控制、安全問(wèn)題說(shuō)不清當(dāng)前第25頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)中醫(yī)藥應(yīng)該在臨床有效的基礎(chǔ)上，更須多關(guān)注這些尚未能解決的中醫(yī)藥臨床應(yīng)用的疑難問(wèn)題，以便更好地為中醫(yī)臨床應(yīng)用服務(wù)。換言之:中醫(yī)藥在這些方面的問(wèn)題得到解決，將會(huì)有力推動(dòng)中醫(yī)藥學(xué)科的快速發(fā)展，也會(huì)得到國(guó)際國(guó)內(nèi)同行和社會(huì)對(duì)中醫(yī)藥更為廣泛認(rèn)同的效果。當(dāng)前第26頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)開(kāi)展了丹紅注射液、腦心通膠囊發(fā)揮治療冠心病、缺血性中風(fēng)等血瘀病證的系統(tǒng)研究如：丹紅注射液如何發(fā)揮組分相互作用，組分體內(nèi)過(guò)程如何，哪些是具有生物活性的代謝產(chǎn)物，最終通過(guò)哪些環(huán)節(jié)、途徑發(fā)揮活血化瘀效應(yīng)最終實(shí)現(xiàn)整合調(diào)節(jié)治療冠心病、缺血性中風(fēng)等問(wèn)題。當(dāng)前第27頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)第三部分丹紅注射液對(duì)腦缺血性損傷保護(hù)機(jī)制研究1丹紅注射液的主要適用病證

2丹紅注射液中化學(xué)成分及代謝產(chǎn)物研究4丹紅注射液對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用5

丹紅注射液抗腦缺血性損傷的機(jī)制研究6科研項(xiàng)目、論文、專利情況3丹紅配伍的理論依據(jù)當(dāng)前第28頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)一、丹紅注射液的主要主要適用病證

丹紅注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026866），是臨床上常用的、有效的中藥制劑。是銷售額最高的中藥制劑之一，近年，年銷售超過(guò)10億元。具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)功效。用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)，證見(jiàn)：胸痛，胸悶，心悸，口眼歪斜，言語(yǔ)蹇澀，肢體麻木，活動(dòng)不利等癥。治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞，缺血性腦病、腦血栓及肺心病所瘀諸癥。當(dāng)前第29頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)運(yùn)動(dòng)是一箭多雕的成本效價(jià)比最高的預(yù)防心血管病的措施高血壓高血脂糖尿病肥胖丹紅注射液一箭多雕預(yù)防心腦血管病機(jī)理？腦梗死冠心病當(dāng)前第30頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)丹紅注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026866），為臨床上常用的、有效的中藥制劑。是銷售額最高的中藥制劑之一。丹紅注射液處方用量配比:丹參750g，紅花250g。二、丹紅配伍的理論依據(jù)當(dāng)前第31頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

丹參：味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，功效活血化瘀、涼血消腫、寧心安神。紅花：味辛，性溫，歸心、肝經(jīng)，辛散溫通，入血分，能活血祛瘀化滯、通調(diào)經(jīng)脈。二藥共奏活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功當(dāng)前第32頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（一）HPLC-DAD測(cè)定丹紅注射液中的有效成分6種有效成分紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

250300350400450500550600650A波長(zhǎng)/nm6種對(duì)照品混合溶液的濃度250300350400450500550600650B波長(zhǎng)/nm250300350400450500550600650C波長(zhǎng)/nm吸光度（A)250300350400450500550600650D波長(zhǎng)/nm250300350400450500550600650E波長(zhǎng)/nm吸光度（A)250300350400450500550600650F波長(zhǎng)/nmA.丹參素鈉；B.原兒茶醛；C.咖啡酸；D.迷迭香酸；E.丹酚酸B；F.丹酚酸A

名稱丹參素鈉原兒茶醛咖啡酸迷迭香酸丹酚酸丹酚酸濃度（mg·mL-1）1.3100.1010.00410.1090.2193.360結(jié)果表明：丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；咖啡酸、迷迭香酸檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm。三、丹紅注射液中化學(xué)成分及代謝產(chǎn)物研究當(dāng)前第33頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)混合對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

05101520253035401256t/minA051015202530354034Bt/min0510152025303540156t/minC051015202530354003t/minD

1.丹參素；2.原兒茶醛；3.咖啡酸；4.迷迭香酸；5.丹酚酸B；6.丹酚酸AA.對(duì)照品溶液(280nm)；B.對(duì)照品溶液(330nm)；C.供試品溶液(NO.110934280nm)；D.供試品溶液(NO.110934330nm)

色譜條件：色譜柱：EclipseXDB-C18

(4.6×150mm，5μm)

；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液；柱溫為30℃；流速為1.0mL?min-1.時(shí)間0~6min6~16min16~30min30~40min濃度5%A~5%A5%A~15%A15%A~26%A26%A~27%A

流動(dòng)相梯度洗脫程序結(jié)果表明：該色譜條件下，樣品液中6種成分與其他共存峰得到很好的分離。當(dāng)前第34頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)10批丹紅注射液中6種成分及總黃酮含量(n=3)批號(hào)丹參素μg?mL-1原兒茶醛μg?mL-1咖啡酸μg?mL-1迷迭香酸μg?mL-1丹酚酸Bμg?mL-1丹酚酸Aμg?mL-1總黃酮μg?mL-1111050110934110928110937111042111033110858110926110927110950平均1464.981238.031391.211363.291378.931308.491346.361570.801390.561309.611376.23300.54369.17445.82345.23235.84268.05260.56412.30364.07367.06336.865.404.687.985.394.975.525.055.436.135.495.60262.17215.75236.16286.24237.06246.85163.51300.25233.68259.71244.13573.65270.41297.53396.47517.43441.90305.84399.65310.21402.57391.574650.414220.464067.065634.775083.914458.793845.145083.644711.884851.214660.72101971047092771162896869839958311799104181166310456丹紅注射液樣品中有效成分含量的HPLC-DAD測(cè)定丹紅注射液中6種成分的含量結(jié)果表明：色譜條件下，樣品液6種成分中丹酚酸A含量最高，咖啡酸含量最低，含量高低依次是丹酚酸A、丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛、迷迭香酸、咖啡酸。當(dāng)前第35頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（二）對(duì)7批丹紅注射液進(jìn)行指紋圖譜檢測(cè)

1.標(biāo)定了28個(gè)共有峰，7批丹紅注射液指紋圖譜相似度均大于0.980，表明工藝較穩(wěn)定、質(zhì)量可控。

7批丹紅注射液指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜當(dāng)前第36頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)2.7批血漿、腦、肝臟組織樣品特征圖譜相似度均在0.92以上，說(shuō)明特征指紋圖譜相對(duì)穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可用于體內(nèi)成分定性分析

7批丹紅注射液15min血液中指紋圖譜對(duì)照指紋圖譜

7批丹紅注射液60min腦中指紋圖譜對(duì)照指紋圖譜7批丹紅注射液60min肝中指紋圖譜對(duì)照指紋圖譜當(dāng)前第37頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)3.LC-MS（QTrap4500）質(zhì)譜分析丹紅注射液成分及其體內(nèi)代謝物當(dāng)前第38頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)4.EMS-IDA-EPI掃描模式：所有色譜峰可掃描到EPI譜圖，EMS展示107個(gè)掃描到最高峰化合物丹紅注射液主要有效成分列表當(dāng)前第39頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)丹參素提取離子流圖(XIC,m/z197)及MS2

通過(guò)丹參素特征碎片離子m/z179掃描可以找到結(jié)構(gòu)類似物當(dāng)前第40頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)原兒茶醛提取離子流圖(XIC,m/z137)及MS2

羥基紅花黃色素A提取離子流圖(XIC,m/z611→491)及MS2

當(dāng)前第41頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)丹酚酸B提取離子流圖(XIC,m/z717)及MS2

MS3掃描：丹酚酸A：RT10.4min，判斷二級(jí)碎片來(lái)源，比如二級(jí)碎片m/z159及m/z185來(lái)源小結(jié)：丹紅注射液中有效成分主要是水溶性的酚酸類組分，極性較大。當(dāng)前第42頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)5.丹紅注射液代謝產(chǎn)物分析丹紅注射液中水溶性酚酸類有效成分較多，極性較大；體內(nèi)I相代謝反應(yīng)，通過(guò)氧化、

還原、水解等途徑引入極性，使原藥極性增大，利于排泄。主要以丹參素，迷迭香酸，原兒茶醛，原兒茶酸為目標(biāo)組分，尋找相應(yīng)代謝物.，丹紅注射液代謝產(chǎn)物列表丹參素(Danshensu,DSS)代謝物提取離子流圖及二級(jí)質(zhì)譜當(dāng)前第43頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)原兒茶酸(Protocatechuicacid,DBA)代謝物提取離子流圖及二級(jí)質(zhì)譜原兒茶醛(Protocaterchuicaldehyde,PA)代謝物提取離子流圖及二級(jí)質(zhì)譜當(dāng)前第44頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)迷迭香酸(Rosmarinicacid,RA)代謝物提取離子流圖及二級(jí)質(zhì)譜特征II相代謝物含量隨給藥時(shí)間變化的趨勢(shì)(Area：MRM)小結(jié)：EMS-IDA-EPI，MRM-IDA-EPI,Pre/NL-IDA-EPI等多種掃描模式結(jié)合，發(fā)現(xiàn)注射液中含量較高的有效成分丹參素，原兒茶酸，原兒茶醛，迷迭香酸的II相代謝物，主要是甲基化，硫酸化，甲基化后硫酸化，葡萄糖醛酸化等一系列代謝物。各時(shí)間點(diǎn)代謝樣品中丹參素與迷迭香酸原形在代謝樣品未檢測(cè)到，僅檢測(cè)到代謝物。初步鑒定丹紅注射液中有效成分32個(gè)，同時(shí)鑒定了主要有效成分的代謝產(chǎn)物。當(dāng)前第45頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)CombinationsParametersCom1Com2Com3Com4Com5Com6Com7Com8Com9Emax(U/ml)0.7310.6430.4750.4780.7550.70.6920.7420.701EC50(μg/ml)0.1551.4230.310.120.280.4526.羥基紅花黃色素A與MDA相關(guān)的藥效動(dòng)力學(xué)參數(shù)9個(gè)組方時(shí)間-羥A藥物濃度-MDA三維動(dòng)態(tài)模型當(dāng)前第46頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（1）丹紅注射液對(duì)神經(jīng)功能缺損癥狀的影響

四、丹紅注射液對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用Day0Day3Day7Day10Day14

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

MCAO

大腦中動(dòng)脈栓塞模型（MCAO）示意圖

在MCAO模型再灌之后的1d、3d、7d、10d和14d進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:1.自主活動(dòng)(0-3)2.四肢運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性(0-3)3.前肢外伸(0-3)4.爬動(dòng)(1-3)5.身體觸覺(jué)(1-3)6.震動(dòng)覺(jué)(1-3)

其中3分最差，18分正常

Garciaetal.Stroke,1995.26(4):627-634

Day1Day3Day7Day10Day14

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

當(dāng)前第47頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)注：*P<0.01vsSham，ΔP<0.05vsIRU，#P<0.01vsDHI-1各組在大鼠腦缺血后不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評(píng)分變化曲線11當(dāng)前第48頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（2）丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血后腦梗死體積的影響A假手術(shù)組B模型組C丹紅注射液0.5ml/kgD丹紅注射液1.0ml/kgE丹紅注射液2.0ml/kgMCAO法制作大腦中動(dòng)脈局灶性栓死模型

丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血后腦梗死體積的影響組別劑量（ml/kg）n總梗死體積（mm3）假手術(shù)組NS1000模型組NS10213.572.4*丹紅低劑量組0.510152.753.8#丹紅中劑量組1.010116.547.6##▲丹紅高劑量組2.010103.254.2##▲注：*P<0.05，**P<0.01,與對(duì)照組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)；#P<0.05,##P<0.01，與模型組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)?！鳳<0.05，與低劑量組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)。

丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血后腦梗死的影響結(jié)果可見(jiàn)：丹紅注射液可使梗死總體積減少,與模型組相比具有顯著性差異。當(dāng)前第49頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)五、丹紅注射液抗腦缺血性損傷的機(jī)制研究自由基過(guò)度形成炎癥反應(yīng)纖溶系統(tǒng)受損興奮性氨基酸毒性細(xì)胞凋亡神經(jīng)系統(tǒng)損傷當(dāng)前第50頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（1）丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)SOD活力和MDA含量影響

丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)SOD活力和MDA含量的影響(X±SD)組別劑量（ml/kg）nSOD（NU/mg）MDA（nmol/mg.）假手術(shù)組NS10541.8±48.5411.6±36.5模型組NS10272.4±35.1*947.2±86.4*丹紅低劑量組0.510312.2±42.21858.3±93.9丹紅中劑量組1.010364.5±45.89#782.3±95.4丹紅高劑量組2.010397.1±50.61#689.3±95.4#▲注：*P<0.05，**P<0.01,與對(duì)照組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)；▲P<0.05，與低劑量組組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)。

丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)SOD活力的影響丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)MDA含量的影響結(jié)果表明：（1）腦缺血再灌注組與假手術(shù)組相比，SOD活力、MDA含量均具有顯著差異。（2）丹紅注射液可顯著提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)SOD活力，高劑量組顯著降低腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)MDA含量。當(dāng)前第51頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（2）丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)6-Keto-PGFlα含量的影響

丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦6-Keto-PGFlα含量的影響(X±SD)組別劑量（ml/kg）n6-Keto-PGFlα假手術(shù)組NS1086.31±8.31模型組NS1034.07±5.23*丹紅低劑量組0.51051.11±6.81#丹紅中劑量組1.01059.23±7.83##丹紅高劑量組2.010

65.36±7.52##▲注：*P<0.05，**P<0.01,與對(duì)照組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)；▲P<0.05，與低劑量組組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)。結(jié)果表明：（1）腦缺血再灌注組與假手術(shù)組相比具有顯著差異；（2）丹紅注射液各組能顯著提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)6-Keto-PGF1α的含量；（3）丹紅注射液中、高劑量與低劑量相比具有顯著差異。

丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦6-Keto-PGFlα含量的影響當(dāng)前第52頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（3）丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血漿t-PA活性和PAI活性的影響

丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注大鼠血漿t-PA活性和PAI活性的影響(X±SD)組別劑量（ml/kg）nt-PA（IU/ml）PAI（IU/ml）PAI/t-PA假手術(shù)組NS100.912±0.0730.652±0.0490.715模型組NS100.511±0.079*0.921±0.065*1.802丹紅低劑量組0.5100.632±0.072#0.891±0.0751.410丹紅中劑量組1.0100.689±0.082#0.842±0.0711.222丹紅高劑量組2.0100.697±0.083#0.762±0.068#1.093注：*P<0.05，**P<0.01,與對(duì)照組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)；#P<0.05，與模型組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)。

t-PA：組織型纖溶酶原激活物；PAI：纖溶酶原激活物抑制因子結(jié)果表明：（1）腦缺血再灌注組與假手術(shù)組相比均具有顯著差異；（2）丹紅注射液各組與腦缺血再灌注組相比，可顯著提高t-PA活性，降低PAI活性，具有增強(qiáng)機(jī)體的纖溶功能、促進(jìn)血栓溶解的作用。當(dāng)前第53頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（4）丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注后Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的作用

各組缺血側(cè)大腦皮層Bcl-2、Bax免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)組別劑量（ml/kg）nBcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Bcl-2/Bax假手術(shù)組NS1055.912.73模型組NS1084.415.6*86.815.2**0.97丹紅注射液1.010126.118.2#47.312.9#2.66注：*P<0.05，**P<0.01與假手術(shù)組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，F(xiàn)檢驗(yàn)。

ABcl-2假手術(shù)組，BBcl-2模型組，CBcl-2丹紅注射液組，DBax組，EBax-假手術(shù)組，F(xiàn)Bax-丹紅注射液組

結(jié)果表明：（1）假手術(shù)與模型組相比，模型組缺血側(cè)大腦皮層Bcl-2免疫組化陽(yáng)性反映細(xì)胞數(shù)顯著增多。（2）丹紅注射液組與腦缺血再灌注模型組相比Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多。（3）丹紅注射液與模型組相比，可使Bax蛋白的表達(dá)降低。（4）丹紅注射液具有顯著調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，保護(hù)腦組織的作用。

當(dāng)前第54頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)圖2微透析套管埋植123123混合對(duì)照品溶液和透析液的HPLC圖注：1.天門(mén)冬氨酸；2.谷氨酸；3.γ-氨基丁酸；A.人工腦脊液溶液

B.對(duì)照品溶液；C.空白大鼠頭部透析液圖1大腦中動(dòng)脈阻塞模型（MCAO）0100200300400500600700800900-50050100150200模型組丹紅組丹紅注射液對(duì)腦缺血大鼠腦海馬區(qū)Asp釋放的影響050100150200250300350400-50050100150200模型組

丹紅注射液對(duì)腦缺血大鼠腦海馬區(qū)Glu釋放的影響min丹紅組02000400060008000100001200014000-50050100150200模型組丹紅組丹紅注射液對(duì)腦缺血大鼠腦海馬區(qū)GABA釋放的影響（5）丹紅注射液對(duì)腦部微透析液氨基酸遞質(zhì)釋放的影響丹紅注射液通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)的含量，對(duì)腦缺血起到一定的保護(hù)作用。當(dāng)前第55頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)丹紅注射液抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，丹紅注射液對(duì)炎癥的抑制在腦缺血后恢復(fù)的過(guò)程中起著重要的作用。

開(kāi)展的部分相關(guān)研究?jī)?nèi)容（6）丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織TNF-α和IL-1β炎癥因子的影響丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血后腦組織中TNF-α和IL-1β含量的影響當(dāng)前第56頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)（7）丹紅注射液對(duì)大鼠大腦缺血后葡萄糖代謝的影響

分子影像技術(shù)能夠無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)細(xì)胞和分子水平的生化過(guò)程，尤其是18F-FDG-PET（正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)）能夠定量地?zé)o創(chuàng)監(jiān)測(cè)葡萄糖代謝的變化，被廣泛應(yīng)用于腦血管病療效的評(píng)價(jià)。當(dāng)前第57頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)MACODay0Day3Day7Day10Day14

PETScanPETScanPETScan

利用18F-FDG-PET來(lái)研究丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的作用，丹紅注射液組的R/N變化值在給藥后7d、14d較模型組顯著增加，較好地促進(jìn)了梗死區(qū)葡萄糖代謝的恢復(fù)。大鼠腦部FDG-PET橫斷切面的圖像

R/N變化值當(dāng)前第58頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

梗死區(qū)周邊的GFAP（膠質(zhì)纖維酸性蛋白）免疫組化染色分析圖

(#P<0.01vsSham,**P<0.01vsIRU,ΔP<0.05vsDHI-1)ShamIRUDHI-2DHI-1DHI-4GFAP（200x）（8）丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

丹紅注射液促使腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步活化，大量表達(dá)GFAP，從而促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。當(dāng)前第59頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)丹紅注射液能夠明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡進(jìn)程和和G1/S期阻滯，且呈劑量依賴性。內(nèi)皮細(xì)胞100×兔抗鼠Ⅷ因子抗體鑒定******采用原代培養(yǎng)的乳鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，建立缺氧損傷模型。（9）丹紅注射液對(duì)乳鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用正常組模型組尼莫地平組100uL/mL組50uL/mL組25uL/mL組當(dāng)前第60頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

A正常組B模型組C丹紅注射液100uL/mL組丹紅注射液對(duì)缺氧細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響（6K×）組別C/(uL.mL?1)SOD(U/mg)MDA(nmol/mL)正常組

－85.55±3.584.09±0.50模型組

－29.35±1.04▲▲10.18±1.35▲▲丹紅注射液組2533.97±4.208.80±1.00

5057.26±4.70**6.75±0.55**

10070.05±3.38**5.49±0.51**與正常組比較：▲▲P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05**P＜0.01

丹紅注射液對(duì)缺氧損傷的rBMECsSOD活性和MDA水平的影響（x±s，n=6）A正常組B模型組C丹紅注射液100uL/mL組當(dāng)前第61頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

RT-PCR法檢測(cè)P53、MMP-9、ICAM-1mRNA的表達(dá)擴(kuò)增曲線圖溶解曲線圖擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，整體平行性好，基線平而無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)象，曲線指數(shù)期斜率與擴(kuò)增效率成正比，各反應(yīng)管的擴(kuò)增曲線平行性好，表明擴(kuò)增效率良好且相近。溶解曲線直接表示了引物的特異性，TM值基本都在80-90度之間，三個(gè)引物都出現(xiàn)單一峰，說(shuō)明特異性擴(kuò)增良好。當(dāng)前第62頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

下調(diào)P53mRNA表達(dá)來(lái)抑制rBMEC早期凋亡和G1/S期阻滯；

下調(diào)ICAM-1mRNA表達(dá)介導(dǎo)黏附反應(yīng)、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、降低內(nèi)皮細(xì)胞活性；

下調(diào)MMP-9mRNA表達(dá)促進(jìn)血管生成。以正常組為對(duì)照進(jìn)行相對(duì)定量分析，丹紅注射液100、50uL/mL均能明顯降低MMP-9、ICAM-1、P53mRNA的表達(dá)水平。當(dāng)前第63頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)

橋粒連接

絨毛電鏡觀察（Caco-221d200×）光鏡觀察藥物通過(guò)小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑示意圖體外Caco-2細(xì)胞模擬體內(nèi)吸收，考察丹紅注射液的主要有效成分配伍在口服給藥后的吸收效果?？诜o藥吸收

小腸生物利用度指導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)樣品HPLC檢測(cè)（10）丹紅注射液主要有效成分配伍體外吸收特性當(dāng)前第64頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)R2X(cum)=0.646R2Y(cum)=0.75,Q2=0.58（R2Y和Q2大于0.5時(shí)，說(shuō)明模型較好）負(fù)離子模式下血清的PLS-DA得分圖(11）丹紅注射液調(diào)節(jié)血脂代謝的作用

以高脂血癥大鼠為模型，通過(guò)生化、分子生物學(xué)及代謝組學(xué)技術(shù)與方法，探討丹紅注射液在調(diào)節(jié)血脂代謝方面的作用機(jī)理，為其治療脂代謝相關(guān)疾病提供科學(xué)理論依據(jù)。當(dāng)前第65頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)六、

科

研

項(xiàng)

目項(xiàng)目名稱來(lái)源基于中西藥相互作用的谷紅注射液多組分藥物代謝與藥效相關(guān)性研究國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81373898）基于藥物相互作用的丹紅注射液對(duì)腦缺血性損傷保護(hù)機(jī)制研究國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81173647）丹參、川芎（參芎注射液）活性物質(zhì)配伍方的多成分藥物代謝動(dòng)力學(xué)與對(duì)腦缺血性損傷保護(hù)作用的相關(guān)性研究國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81274176）丹參紅花多組分配伍方（丹紅注射液為示范）藥物體內(nèi)過(guò)程與抗血栓效應(yīng)相關(guān)性研究國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81473587）基于K+/Glu激活鈣信號(hào)通路的丹紅注射液腦靶向活性成分篩選及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.Y13H280035）中藥（丹紅配伍為例）多成分藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)相關(guān)聯(lián)的方法學(xué)研究浙江省科技廳項(xiàng)目（No.2013C33244）當(dāng)前第66頁(yè)\共有71頁(yè)\編于星期四\22點(diǎn)已正式發(fā)表20余篇，待發(fā)表論文15篇HeY,WanH,DuY.etal.ProtectiveeffectofDanhonginjectiononcerebralischemia-reperfusioninjuryinrats.JournalofEthnopharmacology,2012,144(2):387-394.（SCI收錄，影響因子3.014）黃翔,何昱,楊潔紅,等.HPLC-DAD法與UV-VIS法對(duì)丹紅注射液有效成分和有效部位的質(zhì)量控制研究.中華中醫(yī)藥雜志,2013,04(28）（國(guó)家一級(jí)）周鵬,周惠芬,何昱,等.丹紅注射液對(duì)乳鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用.中草藥,2013,44(19):2727-2731.（國(guó)家一級(jí)）ZefengWang,FahuanSong,JinhuiLi,etal.PETDemonstratesFunctionalRecoveryafterTreatmentbyDanhongInjectioninaRatModelofCerebralIschemic-ReperfusionInjury，Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine,2014

(2014),ArticleID

430757,9（SCI收錄,影響因子4.774）JuanChen,JunDeng，YuyanZhang,etal.Lipid-loweringeffectsofDanhonginjectiononhyperlipidemiarats.JournalofEthnopharmacology，2014，154(2)：437-442.（SCI收錄，影響因子3.014）汪興宇,張宇燕,萬(wàn)海同,等.參芎注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.中國(guó)中藥雜志，2014，39（3）：503-506.（國(guó)家一級(jí)）周鵬,周惠芬,何昱,等.羥基紅花黃色素A在Caco-2細(xì)胞單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)研究.中草藥，2014