適宜技術(shù)應(yīng)對結(jié)核感染詳解演示文稿

適宜技術(shù)應(yīng)對結(jié)核感染詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)優(yōu)選適宜技術(shù)應(yīng)對結(jié)核感染當(dāng)前第2頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)背景—結(jié)核病流行現(xiàn)狀全球有三分之一人口（20億）感染了結(jié)核桿菌我國現(xiàn)患肺結(jié)核病人達(dá)500萬，占全球病人總數(shù)的1/4當(dāng)前第3頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)背景—結(jié)核病感染、傳播、發(fā)病過程潛伏感染

染肺病或其他疾病潛伏感染復(fù)發(fā)

細(xì)菌在人體復(fù)制播散

Disseminates發(fā)作

Onset康復(fù)

Recovery時間表Time診斷

Diagnosis治療

Treatment痊愈≥2個月（months）當(dāng)前第4頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)背景—當(dāng)前結(jié)核病的研究新型抗結(jié)核藥物(50%)新型快速診斷技術(shù)(40%)新型結(jié)核疫苗(10%)JID2012:205(Suppl2),S147.當(dāng)前第5頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)背景—結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）簡稱為結(jié)核桿菌（tuberclebacilli）。早在1882年，德國細(xì)菌學(xué)家柯赫（RobertKoch）就已證明結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。在微生物分類中，結(jié)核分枝桿菌屬于放線菌門、放線菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬分枝桿菌復(fù)合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型結(jié)核分枝桿菌是人類主要的致病菌當(dāng)前第6頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)背景—結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)（1）結(jié)核桿菌可經(jīng)多途徑感染，由呼吸道、消化道和破損皮膚侵入機(jī)體，最常見為經(jīng)呼吸道感染引起肺結(jié)核。（2）結(jié)核桿菌無內(nèi)毒素和外毒素，也不產(chǎn)生侵襲性酶，其致病性主要與其細(xì)胞壁內(nèi)含大量脂質(zhì)有關(guān)。主要包括：①磷脂：可刺激單核細(xì)胞增生，與結(jié)核結(jié)節(jié)和干酪樣壞死形成有關(guān)②分枝菌酸：與抗酸染色性有關(guān)③索狀因子：可破壞細(xì)胞線粒體膜，與慢性肉芽腫形成有關(guān)④硫酸腦苷酯：抑制吞噬溶酶體形成，具有抗吞噬作用⑤蠟質(zhì)D，可刺激機(jī)體的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。（3）結(jié)核桿菌主要引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，屬于傳染性免疫當(dāng)前第7頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)背景--結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)癥狀：肺結(jié)核病可疑癥狀者，主要指有咳嗽、咳痰二周以上者,或有咯血癥狀者發(fā)現(xiàn)方式：因癥求診、轉(zhuǎn)診和因癥推薦是發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病人的主要方式當(dāng)前第8頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)背景--結(jié)核病患者的診斷肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照新修訂的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2008），肺結(jié)核分確診病例、臨床診斷病例和疑似病例。當(dāng)前第9頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)背景--結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的任務(wù)ProvideEarlyandAccurateDiagnosis提供早期精準(zhǔn)診斷Initiationofrighttreatmentandinterventionearly制定正確治療方案并早期干預(yù)Monitoringtherapyefficacyinapromptmanner迅速的監(jiān)測療效Treatmentanddiagnosiscompanionintuberculosisdrugdevelopment在開發(fā)抗結(jié)核藥物同時發(fā)展新的治療及診斷手段當(dāng)前第10頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)簡介1.結(jié)核抗體2.結(jié)核蛋白芯片3.體外r-干擾素試驗(yàn)4.結(jié)核桿菌分泌抗原1.涂片2.培養(yǎng)3.藥敏4.菌型鑒定細(xì)菌學(xué)免疫學(xué)分子生物學(xué)其他1.HPLC2.質(zhì)譜技術(shù)3.流式技術(shù)1.實(shí)時熒光定量PCR2.DNA3.RNA4.耐藥基因突變5.菌型鑒定6.測序當(dāng)前第11頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌形態(tài)學(xué)檢測1.直接抹片法2.離心制片法1.抗酸染色2.熒光染色1.普通顯微鏡2.熒光顯微鏡3.自動閱片技術(shù)涂片染色鏡檢當(dāng)前第12頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核桿菌形態(tài)學(xué)檢測--離心制片技術(shù)直接涂片法離心制片法合計(jì)陽性陰性陽性41041(15.9%)陰性17199216(84.1%)合計(jì)58（22.6%）199(77.4%)2572015年7月至2015年11月，對本院257例痰液和纖維支氣管鏡灌洗液進(jìn)行直接涂片法和離心制片法比對驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如下：結(jié)論：離心制片法的確能提高結(jié)核桿菌涂片檢測的陽性率。當(dāng)前第13頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核桿菌形態(tài)學(xué)檢測--自動閱片技術(shù)2016年2月至2016年3月，本院對308例涂片進(jìn)行人工閱片和計(jì)算機(jī)自動閱片比對試驗(yàn)；結(jié)果符合的為286例，總符合率為92.58%。當(dāng)前第14頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)—結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)分枝桿菌全自動連續(xù)檢測系統(tǒng)-------BACTECMGIT960操作簡單安全可靠性能優(yōu)異高性能價(jià)格比M=MycobacteriumG=GrowthI=IndicatorT=Tube當(dāng)前第15頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)—結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測對象CO2O2檢測手段顏色熒光發(fā)光元素培養(yǎng)基改良MiddleBrook7H9營養(yǎng)添加劑抑菌劑

靈敏，快速，安全陰性培養(yǎng)無熒光或弱熒光陽性培養(yǎng)FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2強(qiáng)熒光傳感器肉湯上部空間當(dāng)前第16頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)—結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)簡單的工作流程當(dāng)前第17頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)—結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)BACTECMGIT960陽性結(jié)果判讀1.抗酸染色2.普通培養(yǎng)—血平板3.MPB64抗原檢測當(dāng)前第18頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)—結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)BACTEC9120只能做血培養(yǎng)？標(biāo)本：血液、無菌體液我可以的！------普通細(xì)菌、真菌分枝桿菌當(dāng)前第19頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)核桿菌體外藥敏試驗(yàn)MIC測定法固體培養(yǎng)法液體儀器法液體微量法當(dāng)前第20頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)藥敏系統(tǒng)采用NCCLs推薦的比例法(MOP)，判斷的臨界值為1%藥敏試劑包括:SIREKit(Streptomycin,Isoniazid,RifampinandEthambutol)4-13天PZAKit4-21天SIRESusceptibilityoptions:另有單獨(dú)包裝的高濃度藥物S，I，E(在低濃度耐藥情況下，可用于高濃度實(shí)驗(yàn))BACTECMGIT960藥敏系統(tǒng)當(dāng)前第21頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)MGITPlasticTubesBACTEC960SIREKITMyco/FLytic25packBACTEC960PZAKit960directLISBACTEC960forG&DManualMGITBACTEC460TBBACTEC9000MB2003BDisalwaystheLEADER結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)----MGIT960EpiCenterforthe960當(dāng)前第22頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)

DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml

10-3++++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible當(dāng)前第23頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)1234

挑取菌落磨菌、稀釋接種菌液孵育7-10天顯色，讀取結(jié)果結(jié)核分枝桿菌液體微量藥敏當(dāng)前第24頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌液體微量顯色法藥敏試驗(yàn)

收集我院2015年8月至11月的臨床分離菌株511例，使用液體微量顯色法進(jìn)行了利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫異煙胺對氨基水楊酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四種抗結(jié)核藥物的體外藥敏試驗(yàn)

。其中MDR-TB菌株75例（14.7%）。藥物RFPINHSMEMBCPMOFXETHPASLVFMOFRFBAMIKANCLO耐藥例數(shù)80146945850614149536260111387耐藥率%15.728.618.411.49.811.98.09.610.412.111.72.22.517.0當(dāng)前第25頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌液體微量顯色法藥敏試驗(yàn)比對實(shí)驗(yàn)

收集臨床分離菌株和國家參比室的質(zhì)控菌株117例，使用液體微量顯色法和羅氏比例法進(jìn)行了利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫異煙胺、對氨基水楊酸、左氧氟沙星、莫西沙星、

利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四種抗結(jié)核藥物的比對實(shí)驗(yàn)?？偡下食^90%。當(dāng)前第26頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷一、結(jié)核分枝桿菌探針溶解曲線技術(shù)當(dāng)前第27頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷結(jié)果判斷當(dāng)前第28頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷溶解曲線法比例法藥敏敏感度特異度陽性預(yù)測值%陰性預(yù)測值%總符合率%敏感耐藥%%INH敏感110490.598.295.596.696.1耐藥238RFP敏感103295.897.294.198.196.8耐藥346收集我院樣本庫的臨床分離菌株154例，進(jìn)行了溶解曲線法耐藥基因突變分析以及羅氏比例法藥敏試驗(yàn)，總符合率在96%以上。并對耐藥結(jié)果不相符的11株菌進(jìn)行了基因測序分析，均證實(shí)有耐藥基因突變。當(dāng)前第29頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷二、結(jié)核分枝桿菌RNA檢測(TB-RNA)RNA作為臨床分子診斷靶標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)：RNA拷貝數(shù)≥DNA拷貝數(shù)更具臨床意義:生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍RNA遠(yuǎn)不如DNA穩(wěn)定，病原體死亡，RNA很快降解

1.交叉污染少

2.較好的愈后指標(biāo)當(dāng)前第30頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷

統(tǒng)計(jì)今年我院住院患者179例，分析涂片、培養(yǎng)和TB-RNA檢測報(bào)告，結(jié)果如下：患者類型例數(shù)TB-RNA陽性例數(shù)陽性率涂片陽性272385.2%涂片陰性1424128.9%培養(yǎng)陽性686291.1%培養(yǎng)陰性11121.8%我院涂片、培養(yǎng)陽性率分別為：15.1%和37.9%；TB-RNA的總陽性率為35.8%。當(dāng)前第31頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷三、EasyNATTB-DNA檢測（恒溫?cái)U(kuò)增法）原理：將病原體DNA擴(kuò)增、核酸雜交和核酸試紙條檢測三種技術(shù)有機(jī)地融為一體，在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中加入兩對TB特異性引物、一對特異性探針，同時一次性完成TBDNA的擴(kuò)增及雜交過程，然后用一次性核酸檢測裝置進(jìn)行定性診斷。檢測目標(biāo)片段:目標(biāo)為結(jié)核分枝桿菌

特異性IS6110片段。當(dāng)前第32頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷操作步驟當(dāng)前第33頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷

2015年6月，我科參加CTCTC“EasyNAT?結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒現(xiàn)場應(yīng)用評估”項(xiàng)目,結(jié)果如下：

患者類型例數(shù)EasyNATTB-DNA檢測陽性率%陽性陰性涂片陽性770100.0涂片陰性432414.7培養(yǎng)陽性1091*90.0培養(yǎng)陰性400400.0注*：1例培養(yǎng)陽性最終鑒定為非結(jié)核分枝桿菌當(dāng)前第34頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷四、Gen-XpertMTB/RIF進(jìn)行標(biāo)本處理、實(shí)時PCR和利福平耐藥性檢測的完整平臺痰標(biāo)本可以直接放入模塊中，而無需與任何試劑進(jìn)行混合處理GeneXpert設(shè)備可進(jìn)行標(biāo)本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB實(shí)時擴(kuò)增、應(yīng)用分子燈塔檢測耐藥相關(guān)的突變?nèi)菀资褂?，不需要進(jìn)行分子生物學(xué)培訓(xùn)操作完全自動化，使用起來既容易又安全。當(dāng)前第35頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與PCRTB-DNA檢測的比較：陽性符合率＝99.03％，陰性符合率＝92.61％，總符合率＝95.31％Gen-XpertPCRTB-DNA合計(jì)陽性陰性陽性20421225陰性2263265合計(jì)206284490當(dāng)前第36頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷涂片陽性肺結(jié)核:Xpert檢出率=99.35％涂片陰性肺結(jié)核:Xpert檢出率=35.32％Gen-Xpert涂片結(jié)果合計(jì)陽性陰性陽性15271223陰性1130131合計(jì)153201354當(dāng)前第37頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與BD960液體培養(yǎng)比較實(shí)驗(yàn)：陽性符合率＝95.52％，陰性符合率＝95.51％，總符合率=95.51％Gen-Xpert培養(yǎng)+鑒定結(jié)果合計(jì)陽性陰性陽性21312225陰性10255265合計(jì)223267490當(dāng)前第38頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與比例法藥敏比較實(shí)驗(yàn)：陽性符合率

＝96.88％，陰性符合率

＝95.53％，總符合率

＝95.73％，Gen-Xpert利福平藥敏試驗(yàn)合計(jì)耐藥（陽性）敏感（陰性）耐藥（陽性）31839不確定022敏感（陰性）1171172合計(jì)32179211當(dāng)前第39頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷WHO關(guān)于XpertMTB/RIF的建議XpertMTB/RIF應(yīng)該用于MDR-TB的高危人群、以便盡早發(fā)現(xiàn)MDR-TB患者，有效控制疫情。XpertMTB/RIF在MDR或HIV問題不十分嚴(yán)重的地區(qū)，可以考慮作為顯微鏡檢查基礎(chǔ)之上的后續(xù)檢測，特別是用于涂陰標(biāo)本的進(jìn)一步檢測。當(dāng)前第40頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)蛋白質(zhì)水平結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TBGoldin-tube(QFT-GI)當(dāng)前第41頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)γ

干擾素檢測陰性γ干擾素檢測陽性TB抗原多肽T細(xì)胞活化T細(xì)胞γ干擾素當(dāng)前第42頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)

特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508)

靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)當(dāng)前第43頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對照（PHA）實(shí)驗(yàn)效果圖當(dāng)前第44頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)檢測特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測靈敏度的提高有利于臨床對結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴(kuò)散快速48小時出結(jié)果當(dāng)前第45頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)

陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：①感染階段不同；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/疾??；③實(shí)驗(yàn)非正常操作。

陽性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測指標(biāo)綜合判斷。假陽性結(jié)果：4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）當(dāng)前第46頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)WHO2014《潛伏結(jié)核感染管理指南》建議：1、在HIV感染人群、與肺結(jié)核患者密切接觸的成人和兒童、開始接受抗腫瘤壞死因子（TNF）治療的患者、接受透析治療的患者、準(zhǔn)備接受器官或血液移植的患者、以及硅肺患者中開展LTBI系統(tǒng)檢測和治療。檢測LTBI建議使用γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）或結(jié)核菌素皮試（TST）。2、對于羈押人員、醫(yī)務(wù)人員、來自結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家的移民、無家可歸者、以及吸毒人員，可以有條件地開展LTBI系統(tǒng)檢測和治療。3、對于糖尿病人、酒精依賴者、吸煙成癮者、低體重者，如果他們不屬于以上1和2的情況，并不建議常規(guī)開展LTBI的系統(tǒng)檢測。當(dāng)前第47頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)LTBI篩查和診斷的建議流程

當(dāng)前第48頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)Menzies等在2007年發(fā)表的一篇納入8項(xiàng)研究的meta分析論文中指出，IGRA對于普通人群，尤其是曾經(jīng)接種過卡介苗的人群診斷LTBI具有較高的特異度；但和TST一樣，IGRA的敏感度差強(qiáng)人意，兩者均不能區(qū)別LTBI和活動性結(jié)核病

----MenziesD,PaiM,ComstockG.Meta-analysis:newtestsforthediagnosisoflatenttuberculosisinfection:areasofuncertaintyandrecommendationsforresearch.AnnInternMed,2007,146:340-354.

IGRA診斷LTBI的價(jià)值當(dāng)前第49頁\共有51頁\編于星期四\23點(diǎn)體外r-干擾素釋放試驗(yàn)IGRA診斷活動性結(jié)核病的價(jià)值

在南非進(jìn)行的1項(xiàng)募集到491例痰涂陰疑為肺結(jié)核患兒的研究中，結(jié)合臨床資料、胸片以及TST結(jié)果診斷肺結(jié)核的曲線下面積為85%（95%CI80%–90%）。該研究最重要的價(jià)值在于發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB相對于臨床資料、胸片以及TST的綜合判斷價(jià)值而言，并沒有增加額外的診斷價(jià)值。

LingDI,NicolMP,PaiM,etal.IncrementalvalueofT-SPOT.TBfordiagnosisofactivepulmonar