其他zm屈鐵軍文章原始數(shù)據(jù)

序列完全一致（圖形鏈球菌（S.mutans）UA159E.coliTop10及pMD-19T質(zhì)粒同第一部分；載體pVA8912為紅霉素抗性，全長約2.9kbmg/L（S.mutans司，；HindIII,SphI,PstI,HincII,SalI,HinfI,XbaI,BamHI,SmaI,KpnI,SacI,MCSMCS圖 873bpGcp19-272氨基酸序列。F-SphI: 1.8變形鏈球菌gcp失活菌株的篩選及鑒P2:5?GCGACTCCGTGCAGATAAAC3?。PCR產(chǎn)物回收后用PstIgcp內(nèi)部片段的克pMDT19/gcpF-SphI、R-EcoRIPCR擴(kuò)增得到gcp編碼區(qū)全長為873bp的內(nèi)部序列。圖

圖 gcpPCR電泳1:PCR產(chǎn)物M:DNA

圖 1:pVA8912/gcpSphI/2:pVA8912SphI/M:DNA桿菌中，但不能在鏈球菌中。采用SphI/EcoRI雙酶切自pMD/gcp質(zhì)中，構(gòu)建gcp打靶載體pVA8912/gcp，酶切鑒定結(jié)果如圖2.1.3。S.mutansUA159gcpmutant

圖2.1.4通過同源重組構(gòu)建gcp失活菌株的原理示意873bp的gcp內(nèi)部片段克隆入SphI/EcoRI雙酶切后的pVA8912質(zhì)粒中，構(gòu)建了gcp打靶載體pVA8912/gcp.轉(zhuǎn)化S.mutans后,載體骨架通過同源重組插入S.mutans組中g(shù)cp內(nèi)部，使gcp失活。S:SphI;E:EcoRI;P1,P2:鑒定用引物。Emr：紅霉素抗性

以通過其上873bp的片段與S.mutans上的同源區(qū)域發(fā)生重組，從而整合到S.mutans上隨之一起。重組后一方面將pVA8912/gcp上的紅霉素抗性引入S.mutans的，使重組菌株產(chǎn)生對于紅霉素的抗性;另一方面,pVA8912/gcp的插入打斷了S.mutans上的gcp，產(chǎn)生由兩個(gè)不完整的gcp結(jié)構(gòu)構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)序列，其間被pVA8912的質(zhì)粒骨架間隔，從而實(shí)現(xiàn)gcp的破壞。如圖2.1.4所示，由于外源的插入，使得gcp被分割為兩部分：在外源的上游是包括gcp的起始區(qū)域、信號肽編碼區(qū)及約462bp的結(jié)構(gòu)根據(jù)序列分析的結(jié)果這部分序列不能表達(dá)出GGDEF蛋白的功能區(qū)；在外源的下游是約2543bp的gcp結(jié)構(gòu)序列，由于缺少了起始區(qū)，PstI酶切位點(diǎn)，為進(jìn)一步的酶切鑒定提供了可能。為了進(jìn)一步從分子水平篩選鑒定gcp失活突變株，本研究設(shè)計(jì)引物P1，P2擴(kuò)增包括gcp起始碼上游639bp至gcp終止碼的片段，以野生型菌株組DNA為模板擴(kuò)增出1913bp片段，而以突變菌株組為模板擴(kuò)增得到5742bp片段，電泳結(jié)果與預(yù)期相符（圖2.1.5a），證實(shí)了外源的插PCRPCRPstI單酶切，2.1.5bPCR產(chǎn)物可以切出四條帶，比野生型菌多出3.8kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。 圖 gcp失活株的PCR鑒定和酶切鑒分別以野生菌和gcp失活菌組為模版，以P1～P2引物進(jìn)PCR擴(kuò)增的結(jié)果。M:DNAMarker，1:gbpD失活菌；2:P1～P2PstI酶切結(jié)果；M1:DL2000Marker,M2:λ-HindⅢDNAMarker生長曲線的測定UA159gcp5mLBHI10mg/LBHI37oC24h200μL5mL新鮮的pH1.0pH5.0～7.0BHI液體培養(yǎng)基。取菌懸液pHpH值的能力，以pH的差值表示。1min，測OD600，以無菌生理鹽水作為對照。生物膜形成量的測定UA159gcp37oC預(yù)熱的新鮮5g/LBHI200μL/1.7×105CFU/mL的菌200μL3min，使結(jié)合的細(xì)菌，傾去染色液后，再次用去離子水洗滌3次以洗去剩余575nm測定光密度值。。UA159gcp1:100（v/v）的比例接種入含件下培養(yǎng)48h取出釉質(zhì)片，用無菌去離子水輕柔洗滌2次，置入戊二醛液中，4oC固定24h。梯度脫水，凍干，噴金，掃描電鏡觀察。。I37（80%20%C210%224h600=1.01%BHI1:13748h23次上清液合并作為水溶性胞外0.5mol/LH3次，合并上清液，作為1.5ml34℃過0.1mol/LH620液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算二者合成的水溶性及水不溶性葡聚糖的含量，對兩組進(jìn)行比較。gcpSPSS10.0軟件分析表明，兩組數(shù)據(jù)無顯著性差異(P=0.991)，說明gcp的失65gcpgcp321000.5 Incubation2.2.1UA159gcpUA159gcp失活菌株在不同pH條件下的產(chǎn)酸能力及耐酸能0.05，3210

gcpgcppH5pH5.5pH6pH6.52.2.2apH值條件下野生型和突變型變形鏈球菌產(chǎn)酸能力分析3210

gcpgcp pH5pH5.5pH6pH6.52.2.2bpH值條件下野生型和突變型變形鏈球菌耐酸能力分析962.2.3gcpOD值（0.40±0.10）顯著低于野生菌（0.59±0.27表明gcp失活對變形鏈球菌UA159的生物膜形成有重要影響0

2.2.3UA159gcp（UA159野生菌相比，P50 2.2.4UA159gcp失活菌株水不溶性多糖的定量檢測（UA159野生菌相比，P<0.01）48h2.2.4。在低倍視野下可見變形鏈球菌UA159野生菌在釉質(zhì)表面的黏附量多于gcp失**黏附率黏附率0 gcp2.3.1UA159gcp失活菌對唾液包被的羥基磷灰石表面的黏附率（*UA159野生菌相比，P<0.01）

2.2.4UA159gcp失活菌在玻璃、釉質(zhì)表面形成生物膜的掃描電鏡(a),(b):UA159生物膜；(c),(d):gcp失活菌在玻璃表面的生物膜(e),(f):gcp失活菌在釉質(zhì)表面的生物膜C 2.3.3UA159gcp失活菌對唾液包被羥基磷灰石變形鏈球菌gcp在大腸桿菌中的表pPROEXHTb-gcp1.2.2.1線性化雙粘末端pPROEXHTb載體，酶切反應(yīng)體系：純化的pPROEXHTb質(zhì)粒 17μL10×K 2 0.5 0.537oC酶切4h后，10g/L1.2.2.2線性化雙粘末端gcp片段，酶切反應(yīng)體系：純化的pMD19T-gcp質(zhì)粒 43μL10×K 5 1 1在實(shí)驗(yàn)一中，為了快速鑒定gcp序列，pMD19T-simple/gcp質(zhì)粒未引入酶切位點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)中引入酶切位點(diǎn)后連接至表達(dá)載體并。線性化雙粘末端pPROEXHTb載體片段4線性化雙粘末端gcp片 11Ligation 5混勻后16oC連接30min連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞（方法同實(shí)驗(yàn)一）轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)14-16h后，從Amp+的LB平板上隨機(jī)挑取陽性菌落，分別接種于Amp+的LB培養(yǎng)液，37oC震蕩培養(yǎng)過夜。分別取菌液各500μL，12000r/min離minmin12000mol/L，TritonX-10050mL/L為pPROEXHTb-gcp。pPROEXHTb-gcpml，加適量去離子水混勻，定溶至50ml，1.5mlEP管分裝，-20℃保存。5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液：每100mL94g，100g/LSDS50mL，Tris堿15.1g。45mL45mL，冰醋酸10mL考馬斯亮藍(lán)染色液：考馬斯亮藍(lán)R-2500.25g，溶于100ml甲醇/醋酸脫色液中，Whatmal1號濾紙過濾。電轉(zhuǎn)移緩沖液：甘氨酸2.9g，Tris堿5.8g，SDS0.37g，甲醇200ml，去離子水定溶至1000ml。封閉液（BlokingBuffer）：TBS+5%脫脂奶粉（w/v）麗春紅染液：麗春紅s2g，三氯乙酸30g，璜基水楊酸30g，加去離子水至 mmol/L，PMSF1mmol/L。10%分離 5%濃縮去離子 1.9 1.4300g/L丙烯酰 1.7 0.33 1.3(1.5mol/L,

0.25(0.5mol/L,100g/L100g/L將pPROEXHTb-gcp質(zhì)粒及空載體pPROEXHTb分別轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布Amp+的LB瓊脂平板。37oC倒置培養(yǎng)16h出現(xiàn)菌落。隨機(jī)挑取單菌落接種于5mL、Amp+的LB培養(yǎng)液中，37oC振蕩培養(yǎng)過夜（120-150r/min）。取100μL過夜菌轉(zhuǎn)接種于10mLAmp+的LB培養(yǎng)液中，37oC振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6-0.8。每管中各取菌液1mL，室溫離心5000r/min5min，棄上清，沉淀中加入1×上樣緩沖液200μL，煮沸5min，離心12000r/min5min，取上清作為未誘導(dǎo)樣本，-20oC保存?zhèn)溆谩ＪＳ嗑屑覫PTG誘導(dǎo)劑,使終濃度分別為1mmolL和0.1mmol/L，37oC繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h，分別于加入IPTG后2、4h各取1mL菌液，將所取菌液同上述方法處理。將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后不同時(shí)間的樣本進(jìn)行按同樣方法,取20mLIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h的菌液，4oC離心10000r/min5min收菌，濕菌稱重，按照10mL/g加入超聲裂解緩沖液重懸細(xì)菌，在冰浴下超聲裂菌，4oC離心，10000r/min10min，上清加入2上樣緩沖液，沉淀中加入1上樣緩沖液，SDS蛋白凝膠電泳。1.2.2.3使用bandscanversion5.0（Glyko，USA）軟件分析SDS圖 pPROEXHTb-gcp質(zhì)粒構(gòu)建示意重組質(zhì)粒pMD19T-gcp用BamHI/SalI雙酶切，回收目的片段，定向插入BamHI/SalI酶切后的原核表達(dá)載體pPROEXHTb中，構(gòu)建重組融合表達(dá)質(zhì)粒1.2.11.2.2b）；以該重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出約2.0kb的單一條帶（圖1.2.2a）。以上結(jié)

PCR鑒定MDL2000Marker1：PCR產(chǎn)物

M1:λ-HindⅢDNAMarkerM2:DNAMarkerDL2,0001:pProEXHTb-BamHI/SalI2:pProEX-gcp-圖 pPROEXHTb-gcp重組質(zhì)PCR圖1.2.2.5pPROEXHTb-gcp質(zhì)粒中g(shù)cpRV-M結(jié)將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒及空載體分別轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布Amp+的LB瓊脂平板。37oC倒置培養(yǎng)過夜,在相對分子量為77KDa處出現(xiàn)一條新生的蛋，與預(yù)計(jì)的融合蛋白大小相符使用b