代謝調(diào)節(jié)與代謝工程演示文稿

代謝調(diào)節(jié)與代謝工程演示文稿代謝調(diào)節(jié)與代謝工程當(dāng)前第1頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)優(yōu)選代謝調(diào)節(jié)與代謝工程當(dāng)前第2頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(1)同功酶調(diào)節(jié)——isoenzyme定義：催化相同的生化反應(yīng)，而酶分子結(jié)構(gòu)有差別的一組酶。意義：在一個(gè)分支代謝途徑中，如果在分支點(diǎn)以前的一個(gè)較早的反應(yīng)是由幾個(gè)同功酶催化時(shí)，則分支代謝的幾個(gè)最終產(chǎn)物往往分別對(duì)這幾個(gè)同功酶發(fā)生抑制作用?！骋划a(chǎn)物過量僅抑制相應(yīng)酶活，對(duì)其他產(chǎn)物沒影響。舉例：大腸桿菌的天冬氨酸族氨基酸合成的調(diào)節(jié)當(dāng)前第3頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程當(dāng)前第4頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(2)協(xié)同反饋抑制定義：分支代謝途徑中幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過量時(shí)才能抑制共同途徑中的第一個(gè)酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。舉例：谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum） 多粘芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa） 天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制和阻遏。當(dāng)前第5頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程

天冬氨酸 E,R

4-磷酸天冬氨酸

E 天冬氨酸半醛 E,R E二氫吡啶二羧酸 同型絲氨酸 同型絲氨酸磷酸

E,R R O-琥珀酰同型絲氨酸 蘇氨酸

E,R六氫吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸

R

二氨基庚二酸 同型半胱氨酸

R

賴氨酸 甲硫氨酸 異亮氨酸天冬氨酸族

（谷氨酸棒桿菌）當(dāng)前第6頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程當(dāng)前第7頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程合作反饋抑制定義：兩種末端產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，共同的反饋抑制作用大于二者單獨(dú)作用之和。舉例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反饋抑制，二者共同存在時(shí)，可以完全抑制該酶的活性。而二者單獨(dú)過量時(shí)，分別抑制其活性的70%和10%。當(dāng)前第8頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(3)積累反饋抑制定義：每一分支途徑末端產(chǎn)物按一定百分比單獨(dú)抑制共同途徑中前面的酶，所以當(dāng)幾種末端產(chǎn)物共同存在時(shí)它們的抑制作用是積累的，各末端產(chǎn)物之間既無協(xié)同效應(yīng)，亦無拮抗作用。當(dāng)前第9頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程Try16%CTP14%氨甲酰磷酸13%AMP41%……積累反饋抑制——E.coli谷氨酰胺合成酶的調(diào)節(jié)當(dāng)前第10頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(4)順序反饋抑制一種終產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致前一中間產(chǎn)物的積累，通過后者反饋抑制合成途徑關(guān)鍵酶的活性，使合成終止。舉例：枯草芽孢桿菌芳香族氨基酸合成的調(diào)節(jié)當(dāng)前第11頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程分支途徑上游的某個(gè)酶受到另一條分支途徑的終產(chǎn)物，甚至于本分支途徑幾乎不相關(guān)的代謝中間物的抑制或激活，使酶的活力受到調(diào)節(jié)，此即代謝互鎖。

(5)代謝互鎖當(dāng)前第12頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的多樣性代謝調(diào)節(jié)與代謝工程當(dāng)前第13頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程避開微生物固有代謝調(diào)節(jié)，過量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行。人工控制代謝的手段：改變微生物遺傳特性(遺傳學(xué)方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）；改變細(xì)胞膜透性；當(dāng)前第14頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程工業(yè)發(fā)酵的目的——大量地積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。在正常生理?xiàng)l件下

微生物通過其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)用于合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)行生長和繁殖，它們通常不浪費(fèi)原料和能量，也不積累中間代謝產(chǎn)物代謝的人工控制人為地打破微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行當(dāng)前第15頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程（1）對(duì)于直線式代謝途徑：選育營養(yǎng)缺陷性突變株只能積累中間代謝產(chǎn)物

AaBbCcDdE

1)營養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用

末端產(chǎn)物E對(duì)生長乃是必需的，所以，應(yīng)在培養(yǎng)基中限量供給E，使之足以維持菌株生長，但又不至于造成反饋調(diào)節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產(chǎn)物C。遺傳學(xué)方法當(dāng)前第16頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程(2)分支代謝途徑：情況較復(fù)雜，可利用營養(yǎng)缺陷性克服協(xié)同或累加反饋抑制積累末端產(chǎn)物，亦可利用雙重缺陷發(fā)酵生產(chǎn)中間產(chǎn)物ABCDEFG當(dāng)前第17頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程各圖成立的條件：1.限量添加E；2.限量添加E；3.限量添加E和G；4.限量添加E和G；5.限量添加I“┄”表示營養(yǎng)缺陷突變位置；“≠”表示反饋調(diào)節(jié)解除要根據(jù)其不同反饋控制機(jī)制當(dāng)前第18頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程谷氨酸棒桿菌的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn)E：表示反饋抑制；R：表示反饋?zhàn)瓒?/p>

高絲氨酸脫氫酶（HSDH）天冬氨酸激酶（AK)賴氨酸生產(chǎn)菌:高絲氨酸缺陷型當(dāng)前第19頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程分支途徑——①賴氨酸發(fā)酵

(谷氨酸棒桿菌的代謝調(diào)控)當(dāng)前第20頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程分支途徑——②肌苷酸發(fā)酵

（IMP合成途徑的代謝調(diào)控）調(diào)控理論的實(shí)踐應(yīng)用當(dāng)前第21頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程P124表3-12用營養(yǎng)缺陷型菌株生產(chǎn)的各種氨基酸當(dāng)前第22頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程2)抗反饋控制突變株的應(yīng)用★抗反饋控制突變株——是指對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐?，或兩者兼有之的菌株?！锟狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和營養(yǎng)缺陷性回復(fù)突變株中獲得。★獲得方法及其原理：當(dāng)前第23頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物賴氨酸S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC)蘇氨酸-氨基--羥基戊酸（AHV)異亮氨酸乙硫氨酸精氨酸D-精氨酸苯丙氨酸對(duì)氟苯丙氨酸當(dāng)前第24頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株調(diào)節(jié)酶的變構(gòu)特性是由其結(jié)構(gòu)基因決定的，如果調(diào)節(jié)酶的基因發(fā)生突變而失活，則有兩種可能性：一是催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的基因均發(fā)生突變；另一種可能僅僅是催化亞基發(fā)生突變。一是催化亞基和調(diào)節(jié)亞基恢復(fù)到第一次突變前的活性水平。如果前者發(fā)生回復(fù)突變，則又有兩種可能性另一種是催化亞基得以恢復(fù)，而調(diào)節(jié)亞基喪失了調(diào)節(jié)的功能。營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變當(dāng)前第25頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程DABCEFG2.生物化學(xué)方法添加前體繞過反饋控制點(diǎn)：亦能使某種代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生(-)(-)(-)發(fā)酵與分離過程耦合：控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分：當(dāng)前第26頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程控制細(xì)胞膜滲透性使胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物迅速滲漏出去,解除末端產(chǎn)物的反饋抑制。(1).用生理學(xué)手段——直接抑制膜的合成或使膜受缺損如:在Glu發(fā)酵中把生物素濃度控制在亞適量可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改變細(xì)胞膜的成分，進(jìn)而改變膜透性；當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時(shí)采用適量添加青霉素的方法；再如：產(chǎn)氨短桿菌的核苷酸發(fā)酵中控制因素是Mn2+；Mn2+的作用與生物素相似。(2).利用膜缺損突變株——油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細(xì)胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產(chǎn)量。甘油缺陷型菌株的細(xì)胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量滲漏。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。當(dāng)前第27頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程控制細(xì)胞膜的通透性生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的輔基，該酶催化乙酰CoA的羧化生成丙二酸單酰CoA，進(jìn)而合成細(xì)胞膜磷脂的主要成分脂肪酸只要控制生物素的含量就可以改變細(xì)胞膜的成分，進(jìn)而改變膜的通透性，影響到代謝產(chǎn)物的分泌。甘油缺陷型菌株添加適量的青霉素油酸缺陷型菌株當(dāng)前第28頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程谷氨酸發(fā)酵一、谷氨酸發(fā)酵菌種：CorynebacteriumpekinenseCorynebacteriumglutamicumBrevibacteriumflavu二、發(fā)酵機(jī)理：①谷氨酸以-酮戊二酸為碳架；當(dāng)以糖質(zhì)為發(fā)酵原料時(shí)，合成途徑包括EMP,HMP,TCA循環(huán),乙醛酸循環(huán)等；②谷氨酸產(chǎn)生菌的-酮戊二酸脫氫酶活力很弱或缺少，而谷氨酸脫氫酶的活力要很高；③生物素是谷氨酸產(chǎn)生菌必需的一種維生素，在谷氨酸生物合成中起著重要作用，缺乏或量太高都會(huì)使谷氨酸合成受阻。生物素通過影響細(xì)胞膜的通透性而影響谷氨酸發(fā)酵。當(dāng)前第29頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程回補(bǔ)順序谷氨酸+NH3谷氨酸脫氫酶-酮戊二酸脫氫酶當(dāng)前第30頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程1.谷氨酸生產(chǎn)菌中存在2個(gè)糖酵解途徑EMP/HMP生物素參與糖代謝作用：增加糖代謝的速度而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變丙酮酸積累乳酸積累2.α-酮戊二酸脫氫酶缺失TCA環(huán)阻斷，α-酮戊二酸積累當(dāng)前第31頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程3.四碳二羧酸的來源Δ在生產(chǎn)菌中檢出CO2固定反應(yīng)酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和蘋果酸酶谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.7%Δ

DCA循環(huán)標(biāo)志酶：異檸檬酸裂解酶在谷氨酸發(fā)酵中，DCA環(huán)一方面可以作為TCA循環(huán)有缺陷時(shí)C4二羧酸的補(bǔ)充在谷氨基酸生產(chǎn)菌的生長中提供能量作用谷氨酸生成期中要封閉DCA環(huán)？通過DCA環(huán)提供C4二羧酸時(shí)谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率僅為54.4%當(dāng)前第32頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程4.異檸檬酸脫氫酶活力強(qiáng)提供NADPH,用于還原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化還原共扼體系5.氨的導(dǎo)入合成谷氨酸的反應(yīng)有3種：α-酮戊二酸+NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP++谷氨酸脫氫酶α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶當(dāng)前第33頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程生產(chǎn)菌中谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活力低，轉(zhuǎn)氨作用可以不考慮谷氨酸合成酶由于不受高濃度谷氨酸抑制，其作用值得重視谷氨酸脫氫酶是合成積累谷氨酸的主要酶氨的導(dǎo)入時(shí)生物素缺乏，NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度高效合成谷氨酸生物素充足時(shí)，NH4+不影響糖代謝速度6.谷氨酸合成的調(diào)節(jié)機(jī)制谷aa比天冬aa優(yōu)先合成谷aa脫氫酶谷aa對(duì)其反饋抑制和反饋?zhàn)瓒魴幟仕岷铣擅窽CA的關(guān)鍵酶，受能荷調(diào)節(jié)，谷aa反饋?zhàn)瓒簦瑸躅^酸反饋抑制異檸檬酸脫氫酶α-酮戊二酸反饋抑制α-酮戊二酸脫氫酶先天喪失或微弱PEP受天冬aa反饋抑制，受谷aa和天冬aa反饋?zhàn)瓒舢?dāng)前第34頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程7.細(xì)胞膜通透性控制當(dāng)前第35頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程生物素阻斷脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成表面活性劑對(duì)生物素有拮抗阻斷脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成在對(duì)數(shù)生長期添加青霉素抑制細(xì)胞壁合成細(xì)胞膜損傷甘油缺陷型磷脂的合成受阻影響細(xì)胞膜的合成油酸缺陷型阻斷不飽和脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成當(dāng)前第36頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程三磷酸腺苷(ATP)是為許多反應(yīng)提供能量的高能磷酸化物,細(xì)胞中的ATP、ADP和AMP含量處于相對(duì)平衡的狀態(tài)——細(xì)胞中的能量狀態(tài)能荷（Energycharge）能荷（Energycharge）來表示細(xì)胞中的能量狀態(tài)。能荷（EC）可用下式來表示：

系統(tǒng)中只有ATP時(shí)，EC值為1；只有AMP時(shí)，EC值等于0。當(dāng)前第37頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程能荷不僅能調(diào)節(jié)分解代謝形成ATP的酶活性，也能調(diào)節(jié)合成代謝利用ATP的酶活性。細(xì)胞能荷可調(diào)節(jié)酶活性高能荷抑制異檸檬酸脫氫酶和磷酸果糖激酶等檸檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制劑，從而限制了葡萄糖的利用速度。有氧條件下，大量合成ATP，細(xì)胞能荷增加異檸檬酸脫氫酶受到ATP抑制，導(dǎo)致檸檬酸的積累當(dāng)前第38頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程在厭氧條件下，酵母菌無法通過呼吸鏈產(chǎn)生ATP，細(xì)胞能荷較低。ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生產(chǎn)酒精的速度加快。當(dāng)前第39頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程第十二章工業(yè)微生物發(fā)酵產(chǎn)品調(diào)節(jié)點(diǎn)主要在三個(gè)激酶，即己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶。它們是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，是糖酵解途徑的三個(gè)不可逆步驟糖代謝的調(diào)節(jié)主要是能荷的控制當(dāng)前第40頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程無機(jī)聚磷酸的代謝與功能磷酸鹽和能量的儲(chǔ)存。重金屬陽離子的解毒作用。當(dāng)前第41頁\共有45頁\編于星期五\23點(diǎn)代謝調(diào)節(jié)與代謝工程活性污泥中的聚磷菌

生活在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中，在將進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)，為大量分裂作準(zhǔn)備，細(xì)胞能從廢水中大量攝取溶解態(tài)的正磷酸鹽，在細(xì)胞內(nèi)合成多聚磷酸鹽。細(xì)菌經(jīng)過對(duì)數(shù)生長期而進(jìn)入靜止期時(shí)，若環(huán)境中的磷源仍有剩余，細(xì)胞又有一定的能量時(shí)，仍能從外界吸收磷元素，這種對(duì)