血液一般檢驗-血涂片制備和染色課件

第二章血液一般檢驗第一節(jié)血涂片制備和染色一.血涂片制備◆載玻片要求◆血涂片制備方法◆方法學(xué)評價◆質(zhì)量保證二.血涂片染色◆染料◆染色方法◆方法學(xué)評價◆質(zhì)量保證

本節(jié)內(nèi)容

新玻片上有游離堿質(zhì)，須清洗后使用。使用時切勿用手觸及玻片表面。一.血涂片的制備載玻片的要求手工涂片法厚血膜涂片法

自動涂片法薄血膜推片法制備方法

血涂片的制備方法手工薄血涂片法取EDTA抗凝血滴血約50μl推片干燥30~45°兩玻片的角度以30-45°為宜，輕輕將雙凹片向前勻速推進(jìn)，即涂成血液薄膜。血涂片手工厚血涂片法全自動推片染片機(jī)根據(jù)HCT可以設(shè)定8個水平的推片方案方法評價薄血膜推片法用血量少、操作簡單，臨床應(yīng)用最廣，主要用于觀察血細(xì)胞形態(tài)及儀器法檢測結(jié)果異常時的復(fù)查。某些抗凝劑可使血細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，分類時應(yīng)注意鑒別。白細(xì)胞減低患者的標(biāo)本經(jīng)離心后取棕黃層（有核細(xì)胞和血小板集中層）涂片，可提高異常細(xì)胞的陽性檢出率。厚血膜涂片法對瘧原蟲、微絲蚴等的陽性檢出率高。儀器自動涂片法血涂片中細(xì)胞分布均勻、形態(tài)完好，且推片與染色可和血液分析儀構(gòu)成流水線作業(yè)，適用于大批量標(biāo)本的處理。但需要較高的投入。血涂片制備的方法學(xué)評價總體要求：血膜由厚到薄逐漸過度，應(yīng)厚薄適宜，頭、體、尾分明

良好血涂片的“標(biāo)準(zhǔn)”

①血膜至少長25mm，至玻片兩側(cè)邊緣的距離約為5mm。②血膜邊緣要比玻片邊緣窄，且邊緣光滑，適用于油鏡檢查。③血細(xì)胞從厚區(qū)到薄區(qū)逐步均勻分布，末端呈方形或羽毛狀。④血膜末端無粒狀、劃線或裂隙。⑤在鏡檢區(qū)域內(nèi)，白細(xì)胞形態(tài)應(yīng)無人為異常改變。⑥無人為污染。

血涂片制備的質(zhì)量保證瘧原蟲檢查血涂片要求

1）厚血膜：血量4.0～5.0μl，位于右1/3處，直徑0.8～1.0cm，外出圓形厚薄均勻，無劃痕。過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。2）薄血膜：血量1.0～1.5μl，位于1/2～1/3處，外觀舌狀厚薄均勻，無劃痕。血涂片制備的質(zhì)量保證◆涂片前：載玻片中性、潔凈、無油膩，邊緣無破碎。血液標(biāo)本推薦用非抗凝靜脈血或毛細(xì)管血，也可用EDTA抗凝靜脈血。標(biāo)本采集后4小時內(nèi)制片?！敉科校嚎刂坪醚瘟?、推片速度和角度。血滴越大、推片角度大、速度越快，血膜越厚◆涂片后：血涂片需及時干燥、固定，妥善保存。血涂片制備操作要求不良血涂片用力不均，厚薄不均刷尖，推片邊緣不光滑角度大,速度快,太厚,太短載玻片有油膩血量多，血滴未展開血滴展開不均勻玻片中間未干燥血涂片質(zhì)量問題原因不規(guī)則的間斷和尾部過長推片污染、推片速度不均勻、載玻片污染有空泡（空洞）載玻片被油脂污染血膜偏長或偏短推片角度小、血滴未完全展開即開始推片時血膜偏長；推片角度大、血滴太小時血膜偏短血膜無尾部血滴太大兩側(cè)無空隙推片太寬或血滴展開太寬血膜偏厚或偏薄血滴大、血液黏度高、推片角度大、推片速度快，血膜厚；相反則血膜偏薄血涂片質(zhì)量問題及可能的原因染料性質(zhì)常見品種作用堿性染料陽離子染料亞甲藍(lán)、天青、蘇木素細(xì)胞內(nèi)的酸性成分結(jié)合，用于細(xì)胞核染色酸性染料陰離子染料伊紅Y、伊紅B與細(xì)胞內(nèi)堿性成分結(jié)合并染色復(fù)合染料同時具有陰離子型、陽離子型的染料Wright染料、Giemsa染料細(xì)胞染色后可獲得紅藍(lán)分明、色澤艷麗的染色效果染料二.血涂片染色■瑞氏染色法（Wright’sstain）■吉姆薩染色法（Giemsa’sstain）■瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色法染色方法瑞氏染液是瑞氏染料溶于甲醇而成。■細(xì)胞染色原理：物理吸附作用；

化學(xué)親和作用。■染色易受pH影響：偏酸環(huán)境染色偏紅，偏堿環(huán)境偏藍(lán)?！鋈鹗先旧ǎ╓right’sstain）瑞氏染料:酸性染料伊紅和堿性染料美藍(lán)組成的復(fù)合染料。Wright染色血細(xì)胞著色的原理

成分著色原理堿性物質(zhì)與伊紅結(jié)合染成紅色，該物質(zhì)稱為嗜酸性物質(zhì)，如血紅蛋白及嗜酸性顆粒等酸性物質(zhì)與亞甲藍(lán)結(jié)合而染成藍(lán)紫色，該物質(zhì)稱為嗜堿性物質(zhì)，如淋巴細(xì)胞胞質(zhì)及嗜堿性顆粒等中性顆粒呈等電狀態(tài)，與伊紅、亞甲藍(lán)均結(jié)合，染成淡紫紅色，該物質(zhì)稱為嗜中性物質(zhì)細(xì)胞核主要由DNA和堿性強(qiáng)的組蛋白等組成，后者與伊紅結(jié)合染成紅色，但因細(xì)胞核中含有少量的弱酸性物質(zhì)，與亞甲藍(lán)作用染成藍(lán)色，因含量太少，藍(lán)色反應(yīng)極弱，故細(xì)胞核染成紫紅色紅細(xì)胞①原始紅細(xì)胞和早幼紅細(xì)胞胞質(zhì)含有較多的酸性物質(zhì)，與亞甲藍(lán)親和力強(qiáng)，故染成較濃厚的藍(lán)色②晚幼紅細(xì)胞和Ret含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)，可同時與亞甲藍(lán)和伊紅結(jié)合，故染成紅藍(lán)色或灰紅色③成熟紅細(xì)胞的酸性物質(zhì)完全消失，只與伊紅結(jié)合，染成橙紅色用蠟筆在已干的血膜兩端劃線。瑞氏染液2～5滴，染0.5～1min。加等量或稍多的緩沖液，混勻，染10～15min。流水沖去染液，干后鏡檢。Wright染色步驟正常血膜外觀為淡紫紅色。鏡下RBC和嗜酸性顆粒染粉紅色，嗜堿性顆粒染紫黑色，中性顆粒染淡紫紅色，細(xì)胞核染紫紅色。Wright染色法染色結(jié)果血涂片的染色效果與血涂片中細(xì)胞數(shù)量、血膜厚度、染液質(zhì)量、染色時間、染液濃度、pH等密切相關(guān)，在染色的全過程（前、中、后）均需嚴(yán)格按要求操作，否則將導(dǎo)致染色效果不佳。

Wright染色法質(zhì)量保證■血涂片：血涂片血膜厚度、細(xì)胞數(shù)量要恰當(dāng)。血膜徹底干透后方可染色。

涂片后1小時內(nèi)染色?！鋈疽嘿|(zhì)量：染液放置時間越久，亞甲藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

天青B越多，染色效果越好。Wright染色法質(zhì)量保證---染色前項目質(zhì)量保證時間與濃度染液濃度低、室溫低、細(xì)胞多、有核細(xì)胞多，則染色時間要長；反之，則染色時間要相應(yīng)短。染色過程血涂片應(yīng)水平放置；染液不能過少，以免蒸發(fā)后染料沉淀，不易沖洗掉，使細(xì)胞深染或胞漿中有大量堿性顆粒出現(xiàn)；加染料后可用洗耳球輕吹，讓染液覆蓋全部血膜；加緩沖液后要讓緩沖液和染液充分混勻，兩者比例約為（1～1.5）:1pH值偏酸或偏堿均可導(dǎo)致染色效果不佳沖洗染液①應(yīng)用流水將染液與緩沖液沖去，而不能先倒掉染液后再用流水沖洗，以免染料沉著于血涂片上，干擾檢查②水流不宜太快，水壓不宜太高，避免水流垂直沖到血膜上，而導(dǎo)致血膜脫落③沖洗時間不宜過長，以免脫色④沖洗后的血涂片應(yīng)立即立于玻片架上，防止血涂片被剩余水分浸泡脫色⑤若見血膜上有染料顆粒沉積，用甲醇或Wright染液溶解，但應(yīng)立即用水沖洗脫色與復(fù)染①染色過深：可用甲醇或Wright染液適當(dāng)脫色，也可用清水沖洗一定時間；②染色過淺：可以復(fù)染，復(fù)染時應(yīng)先加緩沖液，后加染液，或加染液與緩沖液的混合液，不可先加染液Wright染色法質(zhì)量保證---染色中評價方式染色良好特征肉眼觀察血膜外觀為淡紫紅色顯微鏡觀察細(xì)胞分布均勻，血細(xì)胞無人為形態(tài)改變，紅細(xì)胞呈淡粉紅色，白細(xì)胞胞質(zhì)能顯示各自特有的色彩，白細(xì)胞核呈紅色或紫紅色，核染色質(zhì)清晰可見，細(xì)胞內(nèi)外無或少見染料沉著血涂片染色良好特征

Wright染色法質(zhì)量保證---染色后

血涂片染色不佳的原因及糾正措施染色效果原因糾正措施染色偏藍(lán)血膜偏厚、染色時間長、沖洗用水的pH過高、沖洗時間過短、稀釋染液未用緩沖液、貯存的染液暴露于陽光下用含1%硼酸的95%乙醇溶液沖洗2次，再用中性蒸餾水沖洗，待干后鏡檢染色偏紅儲存染液質(zhì)量不佳、沖洗時間過長、沖洗用水的pH過低、血涂片干燥前加封片規(guī)范操作，使用中性蒸餾水，保證染液質(zhì)量染色偏淺染色時間偏短、沖洗時間過長復(fù)染染料沉積染料沉淀、染料陳舊、甲醇濃度偏低、染液未過濾、涂片被污染、溫度較高用甲醇沖洗2次，并立即用水沖掉甲醇，持干后復(fù)染藍(lán)色背景固定不當(dāng)、血涂片未固定而儲存過久、使用肝素抗凝劑注意血涂片的固定，使用EDTA抗凝劑Giemsa染色法■染色原理：與Wright染色法基本相同，Giemsa染色法加強(qiáng)了天青的作用，提高了噻嗪類染料的效果。■試劑：Giemsa染料1.0g;甘油66ml;甲醇66ml?！鋈旧?）標(biāo)記血涂片：用蠟筆在的血涂片一端編號。2）固定血膜：用甲醇固定3～5分鐘。3）血膜染色：將固定的血涂片置于被pH6.4～6.8磷酸鹽緩沖液稀釋10～20倍的Giemsa染液中，浸染10～30分鐘，取出后用流水沖洗，干燥后備用。Wright-Giemsa染色法在Wright染色過程中，以稀釋Giemsa染液代替緩沖液，或先用Wright染色法染色后，再用稀釋的Giemsa染液復(fù)染，或者在Wright染液配方的基礎(chǔ)上，每1.0gWright染料添加0.3gGiemsa染料，染色步驟同Wright染色法。

方法評價Wright染色法最常用的染色方法，染色時間短，對胞質(zhì)成分及中性顆粒等染色效果好，但對胞核的染色不如Giemsa染色法Giemsa染色法染色過程易控制，不易被污染，對胞核和寄生蟲等著色較好，結(jié)構(gòu)更清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒著色較差，染色保存時間久，但染色時間長，價格高。Wright-Giemsa染色法對胞質(zhì)、顆粒、胞核均著色鮮艷，對比鮮明，但此法染液變性快、易污染，為臨床一般檢驗次選方法血涂片染色的方法學(xué)評價第二節(jié)改良牛鮑血細(xì)胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)和使用

本節(jié)內(nèi)容

一.計數(shù)板結(jié)構(gòu)◆結(jié)構(gòu)◆區(qū)域劃分二.計數(shù)板使用

◆使用◆計數(shù)順序與原則◆質(zhì)量保證◆評價◆考核方法一、改良Neubauer計數(shù)板結(jié)構(gòu)計數(shù)板上下各一個計數(shù)池1mm1mm計數(shù)板結(jié)構(gòu)區(qū)域劃分二、計數(shù)板使用準(zhǔn)備計數(shù)扳稀釋血液充液靜置顯微鏡計數(shù)計數(shù)原則“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”計數(shù)順序計數(shù)順序與原則計數(shù)板使用質(zhì)量保證1．計數(shù)板（1）計數(shù)板合格性鑒定

鑒定周期：每隔1年，要求計數(shù)室的玻面光滑、透明、劃線清晰，劃線面積準(zhǔn)確。1）蓋玻片檢查：包括厚度和平整度，要求蓋玻片應(yīng)具有一定的重量，平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一致。2）計數(shù)室深度：高度誤差應(yīng)在±2%（±2μm）以內(nèi)。3）計數(shù)室劃線：每個大方格邊長的誤差應(yīng)小于1%。1．計數(shù)板（2）保證計數(shù)板和蓋玻片清潔：防止計數(shù)板污染，致使充液時產(chǎn)生氣泡。如使用血液充液，計數(shù)板和蓋玻片使用后應(yīng)依次用95%（V/V）乙醇、蒸餾水棉球擦拭，最后用清潔紗布手揩凈。（3）加蓋玻片：WHO推薦采用推式法，以保證充液的高度為0.10mm。當(dāng)蓋玻片蓋在計數(shù)板上時，若兩層玻璃之間見到彩色條帶（Newton環(huán)），說明計數(shù)板和蓋玻片清潔良好。計數(shù)板使用質(zhì)量保證1．計數(shù)板2．充液

（1）平放計數(shù)板。充液前應(yīng)適當(dāng)用力、快速振蕩細(xì)胞懸液30秒，使其充分混勻，但不能產(chǎn)生過多氣泡，以免影響充液和準(zhǔn)確計數(shù)，也要防止劇烈振蕩以免破壞細(xì)胞。（2）一次完成充液，如充液過少、過多、有氣泡或出現(xiàn)任何碎片，應(yīng)拭凈計數(shù)板及蓋玻片后重新操作。（3）充液后不能移動蓋玻片。計數(shù)板使用質(zhì)量保證1．計數(shù)板3．靜置計數(shù)板白細(xì)胞和紅細(xì)胞計數(shù)一般需沉淀2～3分鐘，血小板計數(shù)應(yīng)沉淀10～15分鐘，同時需注意保濕。（1）如果細(xì)胞嚴(yán)重分布不均，應(yīng)重新充液計數(shù)。如白細(xì)胞總數(shù)在正常范圍內(nèi)時，各大方格的細(xì)胞數(shù)不得相差8個以上。兩次重復(fù)計數(shù)誤差：白細(xì)胞不超過10%，紅細(xì)胞不超過5%。（2）計數(shù)原則

計數(shù)細(xì)胞時應(yīng)遵循計數(shù)原則，并注意與非細(xì)胞成分相區(qū)別。4．計數(shù)計數(shù)板使用質(zhì)量保證1．計數(shù)板5．計數(shù)誤差（1）技術(shù)誤差（technicalerror）：由于操作不規(guī)范或使用器材不準(zhǔn)確造成的誤差稱為技術(shù)誤差。這類誤差通過主觀努力可以避免或顯著減小，屬系統(tǒng)誤差。（2）固有誤差（inherenterror）：包括計數(shù)域誤差、計數(shù)室誤差和吸管誤差。計數(shù)板使用質(zhì)量保證血細(xì)胞計數(shù)常見的技術(shù)誤差與原因1）計數(shù)域誤差（fielderror）：又稱分布誤差，屬于偶然誤差。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，血細(xì)胞在計數(shù)室內(nèi)分布的不均一性符合泊松分布：（m為細(xì)胞多次計數(shù)的均值）計數(shù)域誤差變異系數(shù)（CV）與細(xì)胞計數(shù)的數(shù)量成反比，細(xì)胞計數(shù)數(shù)量越多，計數(shù)范圍越廣，誤差越小；反之，誤差越大計數(shù)板使用質(zhì)量保證2）計數(shù)室誤差和吸管誤差：同一稀釋血液采用多支吸管稀釋，在多個計數(shù)板內(nèi)計數(shù)，較同一稀釋液在同一計數(shù)板進(jìn)行多次計數(shù)所得的結(jié)果更接近真值。以白細(xì)胞計數(shù)為例，固有誤差總變異系數(shù)的計數(shù)公式為：nb：計數(shù)的白細(xì)胞總數(shù)，

nc：計數(shù)板使用次數(shù)，

np：吸管使用次數(shù)計數(shù)板使用質(zhì)量保證計數(shù)板使用評價優(yōu)點(diǎn)：為WHO推薦的參考方法，設(shè)備簡單、費(fèi)用低廉、簡便易行，在嚴(yán)格規(guī)范條件下，可用于校準(zhǔn)血液分析儀及其結(jié)果異常的復(fù)查，多次重復(fù)（10-20次）測定的均值可作為校正血細(xì)胞分析儀的參考值。適用于日檢測量少的基層醫(yī)療單位和分散檢測。缺點(diǎn)：費(fèi)時，受吸血量和血細(xì)胞計數(shù)板的質(zhì)量、細(xì)胞分布狀態(tài)以及檢驗