建立PCR實驗室的基本條件

建立PCR實驗室的基本條件第一篇：建立pcr實驗室的基本條件建立pcr實驗室的基本條件臨床基因擴增實驗室采用pcr技術(shù)用于臨床基因診斷，由于pcr技術(shù)對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現(xiàn)實驗室污染導致臨床檢測標本假陽性結(jié)果；另外由于pcr技術(shù)要求高、影響因素多（特別是rna標本），實驗過程處理不當易導致核酸模板無擴增現(xiàn)象，導致臨床標本假陰性結(jié)果。因此臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)驗收和規(guī)范化管理是pcr技術(shù)本身需要，也是在臨床上順利應(yīng)用該技術(shù)前提。二、pcr實驗室驗收準備工作（一）硬件準備——實驗室基本建設(shè)1.根據(jù)文件要求，臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)；標本制備區(qū)；擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)；擴增產(chǎn)物分析區(qū)，如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。2.各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。3.進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一流向進行，即試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。4.不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。5.工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標準試劑貯存和準備區(qū)2～8℃和-15℃冰箱：混勻器；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。標本制備區(qū)2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速臺式冷凍離心機；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；超凈工作臺，消耗品；一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)核酸擴增儀；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。擴增產(chǎn)物分析區(qū)視檢測方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下：微量加樣器（覆蓋1～200μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（二）軟件建設(shè)——質(zhì)量手冊編寫與實施、人才資源（上崗證培訓與相關(guān)知識學習）1.臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量手冊編寫質(zhì)量手冊是闡明臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量方針，并描述過其質(zhì)量體系的文件。質(zhì)量手冊規(guī)定了質(zhì)量體系的基本結(jié)構(gòu)，是實施和保持質(zhì)量體系應(yīng)長期遵循的文件。臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量手冊編寫應(yīng)依照衛(wèi)生部下發(fā)兩個文件，并結(jié)合本實驗室實際情況編寫適合本實驗室的切實可行的質(zhì)量手冊。質(zhì)量手冊的提綱應(yīng)包括三部分：質(zhì)量方針和宗旨；工作制度；標準操作文件（sop）（1）質(zhì)量方針和宗旨制定臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量管理目標和質(zhì)量保證體系的結(jié)構(gòu)體系和總方針。（2）工作制度一般應(yīng)包括以下文件：實驗室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu)；實驗室內(nèi)務(wù)管理制度；實驗室的人員配置及管理制度；生物的防護與安全制度；實驗室廢棄物處理制度；實驗室清潔消毒制度；儀器設(shè)備的管理制度；儀器、試劑、耗材購置程序及管理制度；臨床標本的管理制度；實驗室記錄的管理制度；質(zhì)量控制工作管理制度；結(jié)果報告管理制度；抱怨的內(nèi)部處理制度；負責人及質(zhì)檢員職責；崗位設(shè)置和責任制等??（3）標準操作程序（sop）一般包括：消毒液配制標準操作程序：消毒標準操作程序；超凈工作臺使用標準操作程序；超凈工作臺維護和保養(yǎng)標準操作文件；pcr儀使用標準操作程序；pcr儀維護和保養(yǎng)標準操作程序；高速低溫離心機使用標準操作程序；移液器使用標準操作程序；冰箱維護和保養(yǎng)標準操作程序；電熱恒溫水浴箱操作程序；電子天平使用和校正操作程序；可移動紫外消毒車使用操作程序；加樣器校準標準操作程序；離心機維護保養(yǎng)操作程序；溫度計校準程序；試劑的質(zhì)檢操作程序；標本唯一標識編號編制規(guī)則；臨床標本的采集及處理操作程序；臨床標本的保存程序；乙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序；丙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序；結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測標準操作程序；沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測標準操作程序等??（4）引用圖表。pcr擴增可接受標本記錄表；pcr擴增拒收標本記錄表；室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表；室間質(zhì)控記錄表；消耗性材料驗收記錄表；試劑驗收記錄表；故障處理表；臺階式高速離心機使用記錄表；臺式高速冷凍離心機使用記錄表；擴增儀維護保養(yǎng)記錄表；人員培訓計劃及培訓記錄表；實驗室工作人員一覽表；主要設(shè)備一覽表；實驗室清潔消毒記錄表；工作區(qū)溫度、濕度記錄表；抱怨記錄表；標本超低溫保存記錄表；應(yīng)急處理記錄表；垃圾處理記錄表；冰箱溫度記錄表；水浴箱溫度記錄表；移動紫外消毒車記錄表；設(shè)備校正記錄表；檢測結(jié)果報告流程；報告單樣張；臨床送檢標本流程圖；實驗室組織結(jié)構(gòu)圖。為了對以個特定序列進行pcr做重復檢測，需要三個不同的區(qū)域，每一個區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細列出.1、樣品準備區(qū)這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施：1）pcr產(chǎn)物和帶有要擴增序列的dna克隆不能在這個房間操作。2）組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取dna或rna。3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。4）dna樣品應(yīng)該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。5）大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。6）管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。7）任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經(jīng)常清洗。2、樣品準備和rna-pcrrna-pcr的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在rna-pcr中應(yīng)用ung以防止污染的方法也有報道。3、前pcr區(qū)必須有專門用于準備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前pcr區(qū)必須要有試劑和準備，特別是專門用于前pcr區(qū)的正壓活塞式移液管。4、pcr實驗室試劑的操作1）所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和（或）核酸酶（dnase和rnase）污染。2）所有pcr試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應(yīng)。4）所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。5）所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。6）新配制的試劑在用于準備新的標本之前應(yīng)該加以檢驗。7）樣品準備和前pcr區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。5、在前pcr區(qū)建立pcr混合物1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。2）如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的pcr成分。3）作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和pcr前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。4）陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在pcr產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。5）當做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。6）由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點應(yīng)該予以考慮。6、控制污染的方法已設(shè)計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用ung，這一技術(shù)能有效地消除由pcr產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。7、pcr儀的位置8、后pcr區(qū)pcr完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后pcr活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前pcr活動。熒光定量pcr實驗室所需儀器設(shè)備清單（衛(wèi)生部推薦）序號儀器設(shè)備、輔助材料名稱放置地點1冰箱試劑準備區(qū)2紫外線消毒燈試劑準備區(qū)3混勻器試劑準備區(qū)4可調(diào)式移液器（1-10μl），（5-40ul），（20-200ul）一套三把試劑準備區(qū)5高速臺式離心機試劑準備區(qū)6專用工作服和衣柜試劑準備區(qū)7冰箱樣品準備區(qū)8紫外線消毒燈樣品準備區(qū)9生物安全柜b2級樣品準備區(qū)10冷凍高速離心機（丙肝專用）樣品準備區(qū)11恒溫金屬浴樣品準備區(qū)12混勻器樣品準備區(qū)13可調(diào)式移液器（5-40ul），（20-200ul），（200-1000ul）一套樣品準備區(qū)14專用工作服和衣柜樣品準備區(qū)15紫外線消毒燈pcr擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)16可調(diào)式移液器（1-10μl），（5-40ul），（20-200ul）一套pcr擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)17專用工作服和衣柜pcr擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)18熒光定量pcr檢測儀pcr擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)所有四區(qū)均需準備的儀器設(shè)備為：專用工作服和工作鞋專用辦公用品一次性手套、一次性吸水紙可移動紫外燈（近工作臺面）微量加樣器一套（覆蓋1~1000ul）以上物品各一套。試劑貯存和準備區(qū)2~8℃和-15℃冰箱混勻器（可加熱）耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）天平高壓鍋標本制備區(qū)2~8℃冰箱和-20℃或-80℃冰箱高速臺式冷凍離心機混勻器水浴箱或pcr儀耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）生物安全柜b2級超凈工作臺超聲波水浴儀（處理大分子dna用）三、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)核酸擴增儀耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）國產(chǎn)離心機四、擴增產(chǎn)物分析區(qū)酶標儀、洗板機、恒溫箱（pcr—elisa）加樣器吸頭（帶濾心）電泳儀及電泳槽雜交儀核酸轉(zhuǎn)移儀國產(chǎn)離心機第二篇：建立pcr實驗室的基本條件建立pcr實驗室的基本條件臨床基因擴增實驗室采用pcr技術(shù)用于臨床基因診斷，由于pcr技術(shù)對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現(xiàn)實驗室污染導致臨床檢測標本假陽性結(jié)果；另外由于pcr技術(shù)要求高、影響因素多（特別是rna標本），實驗過程處理不當易導致核酸模板無擴增現(xiàn)象，導致臨床標本假陰性結(jié)果。因此臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)驗收和規(guī)范化管理是pcr技術(shù)本身需要，也是在臨床上順利應(yīng)用該技術(shù)前提。（一）硬件準備--實驗室基本建設(shè)1、根據(jù)文件要求，臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)；標本制備區(qū)；擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)；擴增產(chǎn)物分析區(qū)，如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。2、各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。3、進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一流向進行，即試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。4、不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。5、工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標準：（1）試劑貯存和準備區(qū)2～8℃和-15℃冰箱：混勻器；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（2）標本制備區(qū)2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速臺式冷凍離心機；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；超凈工作臺，消耗品；一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（3）擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)核酸擴增儀；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（4）擴增產(chǎn)物分析區(qū)視檢測方法不同而定。基本儀器設(shè)備如下：微量加樣器（覆蓋1～200μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（二）軟件建設(shè)--質(zhì)量手冊編寫與實施、人才資源（上崗證培訓與相關(guān)知識學習）臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量手冊編寫質(zhì)量手冊是闡明臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量方針，并描述過其質(zhì)量體系的文件。質(zhì)量手冊規(guī)定了質(zhì)量體系的基本結(jié)構(gòu)，是實施和保持質(zhì)量體系應(yīng)長期遵循的文件。臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量手冊編寫應(yīng)依照衛(wèi)生部下發(fā)兩個文件，并結(jié)合本實驗室實際情況編寫適合本實驗室的切實可行的質(zhì)量手冊。質(zhì)量手冊的提綱應(yīng)包括三部分：質(zhì)量方針和宗旨；工作制度；標準操作文件（sop）。（1）質(zhì)量方針和宗旨制定臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量管理目標和質(zhì)量保證體系的結(jié)構(gòu)體系和總方針。（2）工作制度一般應(yīng)包括以下文件：實驗室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu)；實驗室內(nèi)務(wù)管理制度；實驗室的人員配置及管理制度；生物的防護與安全制度；實驗室廢棄物處理制度；實驗室清潔消毒制度；儀器設(shè)備的管理制度；儀器、試劑、耗材購置程序及管理制度；臨床標本的管理制度；實驗室記錄的管理制度；質(zhì)量控制工作管理制度；結(jié)果報告管理制度；抱怨的內(nèi)部處理制度；負責人及質(zhì)檢員職責；崗位設(shè)置和責任制等......（3）標準操作程序（sop）一般包括：消毒液配制標準操作程序：消毒標準操作程序；超凈工作臺使用標準操作程序；超凈工作臺維護和保養(yǎng)標準操作文件；pcr儀使用標準操作程序；pcr儀維護和保養(yǎng)標準操作程序；高速低溫離心機使用標準操作程序；移液器使用標準操作程序；冰箱維護和保養(yǎng)標準操作程序；電熱恒溫水浴箱操作程序；電子天平使用和校正操作程序；可移動紫外消毒車使用操作程序；加樣器校準標準操作程序；離心機維護保養(yǎng)操作程序；溫度計校準程序；試劑的質(zhì)檢操作程序；標本唯一標識編號編制規(guī)則；臨床標本的采集及處理操作程序；臨床標本的保存程序；乙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序；丙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序；結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測標準操作程序；沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測標準操作程序等。（4）引用圖表。pcr擴增可接受標本記錄表；pcr擴增拒收標本記錄表；室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表；室間質(zhì)控記錄表；消耗性材料驗收記錄表；試劑驗收記錄表；故障處理表；臺階式高速離心機使用記錄表；臺式高速冷凍離心機使用記錄表；擴增儀維護保養(yǎng)記錄表；人員培訓計劃及培訓記錄表；實驗室工作人員一覽表；主要設(shè)備一覽表；實驗室清潔消毒記錄表；工作區(qū)溫度、濕度記錄表；抱怨記錄表；標本超低溫保存記錄表；應(yīng)急處理記錄表；垃圾處理記錄表；冰箱溫度記錄表；水浴箱溫度記錄表；移動紫外消毒車記錄表；設(shè)備校正記錄表；檢測結(jié)果報告流程；報告單樣張；臨床送檢標本流程圖；實驗室組織結(jié)構(gòu)圖。第三篇：pcr實驗室基本要求pcr實驗室基本要求1、主體結(jié)構(gòu)：主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。2、標準的三區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：將pcr過程分成試劑準備、標本制備和pcr擴增檢測三個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個pcr實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和pcr擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調(diào)的回風口，空氣通過回風口向室內(nèi)換氣。3、消毒：在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū)還設(shè)置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。4、機械連鎖不銹鋼傳遞窗：試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。5、地面地面建議使用pvc卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。6、照明燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。標準的pcr實驗室在建設(shè)的過程中應(yīng)注意：●規(guī)范的安裝流程和全面的服務(wù)流程?！駠栏癜凑找?guī)范科學設(shè)計的安裝流程。●安裝前需要確定以下安裝條件，如。電源電壓，電源進線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進線位置，進水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風孔、進水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸和通風口尺寸。pcr實驗室基本要求2.1pcr實驗室依據(jù)所使用的方法可分為試劑準備、標本制備、擴增、產(chǎn)物分析等三或四個區(qū)域。只是使用實時熒光pcr儀、hiv病毒載量測定儀的pcr實驗室，有上述前面三個區(qū)域即可。各區(qū)域應(yīng)完全獨立分隔，不應(yīng)有任何的空氣直通。2.2標準的pcr實驗室產(chǎn)物分析區(qū)或三個區(qū)域的最后一個區(qū)域（即擴增及產(chǎn)物分析區(qū)），空氣流向應(yīng)由室外向室內(nèi)，可通過在室內(nèi)設(shè)置通風櫥、排風扇或其他排風系統(tǒng)達到空氣流由室外向室內(nèi)流動的要求。2.3pcr實驗室各區(qū)域儀器設(shè)備配備通常如下：2.3.1標準的pcr實驗室試劑準備區(qū)。儀器設(shè)備主要應(yīng)有加樣器、冰箱、天平、低速離心機、混勻器、可移動紫外燈等?？墒褂贸瑑艄ぷ髋_作為試劑配制操作臺面。2.3.2標準的pcr實驗室標本制備區(qū)儀器設(shè)備主要應(yīng)有生物安全柜（最好為b2，可避免提取核酸在柜內(nèi)反復循環(huán)，造成標本間交叉“污染”，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外還應(yīng)配備加樣器、臺式高速離心機（冷凍及常溫）、臺式低速離心機、恒溫設(shè)備（水浴和/或干浴儀）、冰箱、混勻器和可移動紫外燈等。2.3.3標準的pcr實驗室擴增區(qū)主要儀器就是核酸擴增熱循環(huán)儀（pcr儀，實時熒光或普通的）。熱循環(huán)儀的電源應(yīng)專用，并配備一個穩(wěn)壓電源或ups，以防止由于電壓的波動對擴增測定的影響。此外，根據(jù)工作需要，還可配備加樣器、超凈臺等。2.3.4標準的pcr實驗室產(chǎn)物分析區(qū)：本區(qū)所使用的儀器設(shè)備可能有加樣器、電泳儀（槽）、電轉(zhuǎn)印儀、雜交爐或雜交箱、水浴箱、dna測序儀、酶標儀和洗板機等。在理想情況下，pcr實驗室試劑準備、標本制備、擴增三個區(qū)域可設(shè)置緩沖間。在緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。pcr實驗室平面布置示意圖一般實驗室間隔材料分：彩鋼板，不銹鋼板，理化板等，價格依次而上，主要考慮不產(chǎn)塵，不滋菌，容易清理就行一般實驗室間隔材料分：彩鋼板，不銹鋼板，理化板等，價格依次而上，主要考慮不產(chǎn)塵，不滋菌，容易清理就行**衛(wèi)生部pcr研究員李金明（衛(wèi)生部臨床檢驗中心臨床免疫室主任，研究員）的pcr建設(shè)方案再說吧。國外的資料不一定是最好。個人覺得李金明的實驗室區(qū)正壓（擴增分析區(qū)因為沒有緩沖，所以為負壓），緩沖間負壓的作法可以更好的防止氣體的外泄及防止試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、產(chǎn)物擴增區(qū)、擴增分析區(qū)四區(qū)之間的氣體相互滲漏。pcr實驗室也可以分為三個區(qū)，即第三、四區(qū)合為一區(qū)，必須設(shè)立緩沖間。有條件建設(shè)實驗室采用三十萬級的標準來建設(shè)?？照{(diào)系統(tǒng)采用制冷劑各區(qū)獨立循環(huán)，可以防止氣流交叉。**疾病預(yù)防控制中心實驗室建設(shè)之pcr實驗室基本要求：pcr實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組pcr實驗，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要，還應(yīng)增加樣品粉碎過程。第四篇：pcr實驗室要求和基本設(shè)備pcr實驗室的基本設(shè)備與要求一、臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設(shè)置原則（一）臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設(shè)置原則1、試劑儲存和準備區(qū)2、標本制備區(qū)3、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并。（二）各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。（三）進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行即試劑儲存和準備區(qū)—>標本制備區(qū)—>擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)—>擴增產(chǎn)物分析區(qū)。（四）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。二、工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標準（一）試劑儲存和準備區(qū)1、2-8c和-15c冰箱2、混勻器3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）4、移動紫外燈（近工作臺面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）6、專用工作服和工作鞋7、專用辦公用品（二）標本制備區(qū)1、2-8c冰箱、-20c或-80c冰箱2、高速臺式冷凍離心機3、混允器4、水浴箱或加熱模塊5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）6、可移動紫外燈（近工作臺面）7、超凈工作臺8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）9、專用工作服和工作鞋10、專用辦公用品，如需處理大分子dna，應(yīng)具有超聲波水浴儀。（三）擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)1、核酸擴增儀2、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）3、可移動紫外燈（近工作臺面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）5、專用工作服和工作鞋6、專用辦公用品（四）擴增產(chǎn)物分析區(qū)視檢驗方法不同而定，基本儀器設(shè)備如下：1、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）2、可移動紫外燈（近工作臺面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）4、專用工作服和工作鞋5、專用辦公用品臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理（一）試劑貯存和準備區(qū)下述操作在該區(qū)進行。貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。貯存試劑和用于標本制備的材料應(yīng)直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴增反應(yīng)數(shù)來決定。主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術(shù)（在第一個高溫變性步驟后加入酶），聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調(diào)至實驗臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。（二）標本制備區(qū)下述操作在該區(qū)進行。臨床標本的保存，核酸（rna、dna）提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定rna時cdna的合成。要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內(nèi)。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料（原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等）如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。對實驗臺適當?shù)淖贤庹丈洌?54nm波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染?？梢苿幼贤饩€管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。用于rna擴增檢測的樣本制備好以后，應(yīng)立即進行cdna合成，因為cdna鏈較rna穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標本制備區(qū)設(shè)置一個以上的溫育裝置。cdna合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的dna聚合酶進行逆轉(zhuǎn)錄，其較cdna合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進行擴增發(fā)生污染的可能性降低。待測rna的cdna拷貝須保存在標本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進行pcr擴增。（三）擴增區(qū)下述工作在本區(qū)內(nèi)進行。dna或cdna擴增。此外，已制備的dna模板和合成的cdna（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式pcr測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。不能從本區(qū)再進入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。打開預(yù)處理過的反應(yīng)混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。（四）擴增產(chǎn)物分析區(qū)下述操作在本區(qū)內(nèi)進行。擴增片段的測定。核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法（同位素標記或非同位素標記）、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法，即pcr-elisa方法，也有膜上探針雜交方法。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用pcr-elisa方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/lhc1中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠離pcr實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/lhcl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實驗人員的安全防護。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負壓條件或減壓情況下（如安裝排風扇）可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性。第五篇：pcr實驗室簡介pcr實驗室又叫基因擴增實驗室。pcr是聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction）的簡稱。是一種分子生物學技術(shù)，用于放大特定的dna片段，可看作生物體外的特殊dna復制。通過dna基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)條件1、必須擁有標準的的pcr熒光實驗室;實時熒光定量pcr技術(shù)于1996年由美國appliedbiosystems公司推出由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了pcr從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)pcr相比，它有特異性更強、有效解決pcr污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹2、檢測設(shè)備必須符合標準pcr熒光實驗室設(shè)置要求;熒光定量pcr儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構(gòu)成pcr-dna/rna實時熒光定量檢測系統(tǒng)。3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓并取得合格證書;pcr實驗室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。pcr實驗室通過驗收，實驗室至少必須應(yīng)有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。pcr實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（sop）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行5、必須在無菌無塵環(huán)境下進行操作功能能夠?qū)颊卟∏檫M行科學、準確、實時的掌控，并結(jié)合抗hbv與t細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復制模板難以治療，人體免疫耐受狀態(tài)不易打破等醫(yī)學難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉(zhuǎn)換速度，殺滅血液及肝細胞內(nèi)的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化進程。建立方法1、建立樣品準備區(qū)這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提