結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用培訓(xùn)課件

結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用（優(yōu)選）結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用結(jié)核病檢測技術(shù)發(fā)展歷程分子診斷時代DNA診斷：PCRLAMPGeneXpert基因芯片RNA診斷：TMANASBA免疫學(xué)檢測：AbAgPPDT-SPOT細(xì)菌法：直接鏡檢體外培養(yǎng)SAT19世紀(jì)中葉20世紀(jì)60年代20世紀(jì)80年代20世紀(jì)90年代靈敏度低檢測周期長成本低交叉污染儀器要求復(fù)雜反應(yīng)抑制高靈敏度高特異性交叉污染少血清學(xué)檢測WHO不推薦r-干擾素釋放實驗結(jié)核病檢測技術(shù)發(fā)展歷程一、細(xì)菌法直接涂片

（陽性率低—5000以上細(xì)菌/ml；

不能區(qū)分真假、死活）一、細(xì)菌法結(jié)核菌的培養(yǎng)

結(jié)核病病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)(培養(yǎng)時間長是其軟肋)一、細(xì)菌學(xué)檢測的新方法

—提高陽性率發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）液體培養(yǎng)（可同時縮短培養(yǎng)時間）自動化涂片/染色技術(shù)（夾層杯法）不能區(qū)分真假、死活；培養(yǎng)仍是金標(biāo)準(zhǔn)但耗時長、分枝桿菌固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)比較液體培養(yǎng)（BDMGIT960）固體培養(yǎng)（羅氏L-J）疑似新發(fā)患者報陽時間（d）13.63±7.1428.67±10.04復(fù)診患者報陽時間(d)22.94±9.5528.53±10.40疑似新發(fā)患者陽性率32.00%17.90%復(fù)診患者陽性率9.30%2.60%污染率6.57%4.0%液體培養(yǎng)在提高陽性率、縮短報陽時間上均優(yōu)于固體培養(yǎng)。吳學(xué)兵，陸彬，桂曉虹等。液體MGIT培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用評估。檢驗醫(yī)學(xué)，2013,3（28）：211-214仍然不能滿足臨床快速診斷的需要二、免疫學(xué)檢測

血清學(xué)檢測（抗體、抗原）結(jié)核菌素試驗（靈敏度、特異性？）結(jié)核感染T細(xì)胞檢測（γ干擾素檢測）WHO關(guān)于血清學(xué)檢測聲明2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（WHO）正式聲明，要求禁止將血清學(xué)檢測方法（抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。WHOwarnsagainsttheuseofinaccuratecommercialserologicaltestsforpulmonaryandextra-pulmonaryTB.蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展3、4、7種結(jié)核桿菌優(yōu)勢表位抗原（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、Mtb16.3）制備多靶點蛋白微陣列大量的文獻(xiàn)報道其敏感性特異性均顯著高于涂片與培養(yǎng)法可用于結(jié)核病的臨床輔助診斷，提高痰涂片和痰培養(yǎng)假陰性的檢測率參考文獻(xiàn)略γ-干擾素釋放實驗（IGRAs)10Interferon-GammaReleaseAssays結(jié)核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失RD1和RD2絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌(NTM)也不存在RD1和RD2區(qū)11ESAT-6

:早期抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6）CFP10

:培養(yǎng)濾液蛋白10（CultureFiltrateProtein10）12結(jié)核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10結(jié)核菌群抗原ESAT6CFP-10Mtuberculosis++Mafricanum++Mbovis++BCGsubstrain

gothenburg--moreau--tice--tokyo--danish--glaxo--montreal--pasteur--抗原

ESAT6CFP-10Mabcessus--Mavium--Mbranderi--Mcelatum--Mchelonae--Mfortuitum--Mgordonii++Mintracellulare--++Mmalmoense--Mmarinum++Moenavense--Mcrofulaceum----Mszulgai++Mterrae--Mvaccae--Mxenopi--環(huán)境分枝桿菌MsmegmatisMkansasii--準(zhǔn)確—TSPOT臨床診斷性能

特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508)

靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)13陰性預(yù)測值：93.9%（478/509）陽性預(yù)測值：95.4%（624/654）TSPOT相關(guān)指南TSPOT?.TB是采用γ干擾素釋放試驗（IGRA）原理，獲得美國FDA認(rèn)證、歐盟CE認(rèn)證和首個中國CFDA認(rèn)證的商業(yè)化產(chǎn)品列入歐美25個國家結(jié)核診療指南2011年英國NICE指南、2010年美國最新結(jié)核診療指南、2010年加拿大結(jié)核指南美國CDC推薦—卡介苗（BCG）接種人群結(jié)核感染檢測首選國內(nèi)風(fēng)濕科和消化科已列入專家共識14快速—TSPOT的實驗步驟用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血單個核細(xì)胞結(jié)核特異抗原（ESAT-6/CFP10）刺激結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞使其分泌γ-干擾素效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌的γ-干擾素與膜板預(yù)包被的抗γ-干擾素抗體結(jié)合并固定在細(xì)胞周圍1個斑點=1個效應(yīng)T細(xì)胞加入顯色液，觀察結(jié)果過夜孵育，洗板，加入酶標(biāo)二抗15DNA需要一段時間降解4%（624/654）GeneXpert應(yīng)用一個斑點=一個結(jié)核效應(yīng)淋巴細(xì)胞自動化涂片/染色技術(shù)（夾層杯法）gothenburgJOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Jan.2011年英國NICE指南、2010年美國最新結(jié)核診療指南、2010年加拿大結(jié)核指南（優(yōu)選）結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用三、結(jié)核DNA檢測技術(shù)Msmegmatis顯色目測或SYBRGreenI等熒光染料不能區(qū)分是活動性和潛伏性結(jié)核求禁止將血清學(xué)檢測方法（抗原，抗體，蛋白芯片等）用TB—SAT檢測技術(shù)Mcrofulaceum美國CDC推薦—卡介苗（BCG）接種人群結(jié)核感染檢測首選2011年英國NICE指南、2010年美國最新結(jié)核診療指南、2010年加拿大結(jié)核指南—無其它結(jié)核患病證據(jù)復(fù)診患者報陽時間(d)實驗效果圖陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對照（PHA）一個斑點=一個結(jié)核效應(yīng)淋巴細(xì)胞T-SPOT結(jié)果的解讀-陽性結(jié)果活動性結(jié)核病

—典型結(jié)核中毒癥狀

—影像學(xué)支持

—排除其他診斷MTB感染狀態(tài)

—典型結(jié)核中毒癥狀

—未發(fā)現(xiàn)結(jié)核患病證據(jù)潛伏性結(jié)核感染

—無結(jié)核中毒癥狀

—無其它結(jié)核患病證據(jù)陳舊性結(jié)核

—無結(jié)核中毒癥狀

—既往TB史或明確TB證據(jù)NTM（四種）感染高孟秋，γ-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果的臨床意義解讀，中華結(jié)核和呼吸雜志，2014T-SPOT結(jié)果解讀-陰性結(jié)果除外結(jié)核感染

—所用抗原為MTB特異性抗原

—機(jī)體沒有結(jié)核特異抗原致敏的T淋巴細(xì)胞

—目前未感染結(jié)核分枝桿菌假陰性：感染階段不同（窗口期）少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/基礎(chǔ)疾病的情況，如HIV感染者、腫瘤患者、嬰幼兒等特殊肺外結(jié)核：結(jié)核性腦膜炎、粟粒性結(jié)核靈敏度相對較低實驗非正常操作：細(xì)胞計數(shù)不夠等高孟秋，γ-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果的臨床意義解讀，中華結(jié)核和呼吸雜志，2014TSPOT的應(yīng)用優(yōu)點使用血液標(biāo)本，取樣簡單；可用于肺內(nèi)和肺外結(jié)核檢測；陰性預(yù)測值很高，可用于排除結(jié)核感染。缺點陽性預(yù)測值約80%，不能用于結(jié)核的確診不能確定是否是肺結(jié)核（肺外）不能區(qū)分是活動性和潛伏性結(jié)核不能區(qū)分某些非結(jié)核分枝桿菌（堪薩斯、蘇氏、戈登、海分枝桿菌）操作復(fù)雜，時間長；對于原發(fā)感染初期或免疫低下人群，可能存在假陰性。能否療效監(jiān)測？——無大量數(shù)據(jù)

三、結(jié)核DNA檢測技術(shù)測序——金標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法（LAMP）基因芯片檢測鑒定技術(shù)基因XpertMTB/RIF檢測技術(shù)1.熒光定量PCR是應(yīng)用最為廣泛的TBDNA定量PCR檢測方法具有靈敏度高（10CFU/ml）、特異性強(qiáng)、線性關(guān)系好、操作簡單等優(yōu)點。

2.環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法（LAMP）

是在恒溫下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此操作更為簡便，反應(yīng)更加快速。65℃擴(kuò)增40min即可用肉眼觀察結(jié)果。擴(kuò)增陽性標(biāo)本呈現(xiàn)綠色熒光，反之為陰性。是結(jié)核分枝桿菌DNA檢測技術(shù)的代表靈敏、快速、特異、簡捷將會極大地推動結(jié)核病的防治工作DNA檢測LAMP結(jié)果判讀：顯色目測或SYBRGreenI等熒光染料LAMP法和其他PCR法的比較LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用臨床試驗——

LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結(jié)果靈敏度＝89.54%陽性結(jié)果預(yù)期值＝98.13%特異性＝98.93%陰性結(jié)果預(yù)期值＝93.77%總符合率＝95.31%26

JournalofClinicalMicrobiology.2010,48(10):3654–3660.結(jié)核

胞內(nèi)通量：可同時檢測16-22種常見分枝桿菌速度：6小時靈敏度：103CFU/ml可自動或肉眼判讀結(jié)果

3.基因芯片檢測技術(shù)檢測全程僅需6小時MSM恥垢分枝桿菌MTC結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTR次要分枝桿菌MIN胞內(nèi)分枝桿菌MAV鳥分枝桿菌MGA胃分枝桿菌MKA堪薩斯分枝桿菌MSC瘰癘分枝桿菌MUA母牛分枝桿菌MCH龜分枝桿菌龜亞種MAB龜分枝桿菌膿腫亞種MSZ蘇爾加分枝桿菌MMA海/潰瘍分枝桿菌MXE蟾蜍分枝桿菌MDI迪氏分枝桿菌MFO偶發(fā)/豬分枝桿菌MGI淺黃分枝桿菌MSI猿猴分枝桿菌MTE土分枝桿菌MPH草分枝桿菌CC質(zhì)控點MNO不產(chǎn)色分枝桿菌MGO戈登分枝桿菌同時鑒定MTC與21種NTM擴(kuò)增陽性標(biāo)本呈現(xiàn)綠色熒光，反之為陰性。多數(shù)研究報告提示：耐藥的發(fā)生與結(jié)核桿菌的基因突變有關(guān)。蔡杏珊,馬品云,張院良，譚耀駒

中國防癆雜志,2014,36(6):458-461不能區(qū)分某些非結(jié)核分枝桿菌（堪薩斯、蘇氏、戈登、海分枝桿菌）—無其它結(jié)核患病證據(jù)TB-SAT顯著提高結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率，對早期發(fā)現(xiàn)傳染性肺結(jié)核患者，控制結(jié)核病傳染源有極其重要的意義是在恒溫下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此操作更為簡便，反應(yīng)更加快速。耐藥分子診斷檢測的靈敏度：103CFU/ml一個斑點=一個結(jié)核效應(yīng)淋巴細(xì)胞1%(297/306)2009更新關(guān)于分子診斷技術(shù)在TB實驗室診斷的指南50-70%katG基因突變擴(kuò)增陽性標(biāo)本呈現(xiàn)綠色熒光，反之為陰性。TB是采用γ干擾素釋放試驗（IGRA）原理，獲得美國FDA認(rèn)證、歐盟CE認(rèn)證和首個中國CFDA認(rèn)證的商業(yè)化產(chǎn)品優(yōu)點使用血液標(biāo)本，取樣簡單；環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法（LAMP）GABRIELLEM.固液體培養(yǎng)（時間、生物安全等）——LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結(jié)果DNA需要一段時間降解非結(jié)核分枝桿菌（NTM）：4.XpertMTB/RIF檢測技術(shù)

GeneXpert應(yīng)用1、TB復(fù)合群鑒定。2、利福平耐藥檢測。3、WHO推薦4、Xpert?MTB/RIF檢測試劑的陽性檢出率低于人們對分子生物學(xué)診斷試劑高敏感度的預(yù)期值，（1000CFU/ml）DNA用于臨床檢驗的不足“死菌檢測呈陽性”，與臨床相關(guān)性差不能區(qū)分“潛伏感染”“活動性感染”

易交叉污染

反應(yīng)易受抑制NASBA（國外）TMA（國外）SAT（國內(nèi)）四、常見的RNA檢測技術(shù)SAT技術(shù)是將核酸恒溫擴(kuò)增和實時熒光檢測相結(jié)合的一種新型RNA檢測技術(shù)。TB—SAT檢測技術(shù)TB-RNA釋放恒溫擴(kuò)增實時檢測超聲波（300W）15min痰液預(yù)處理42℃40min與反應(yīng)液混合60℃10min42℃5minTB-SAT操作流程50μl稀釋液全程2小時，會做PCR，就學(xué)的會SATTBSAT檢測技術(shù)優(yōu)點RNA診斷技術(shù)的優(yōu)勢靈敏度高：RNA≥DNA拷貝數(shù)與臨床相關(guān)性好：區(qū)分“死活菌”：

減少抗生素濫用可以診斷“活動性感染”：

活動性感染：RNA轉(zhuǎn)錄活躍

潛伏感染：RNA不轉(zhuǎn)錄不易污染：靶標(biāo)和擴(kuò)增產(chǎn)物都是RNATBSAT檢測區(qū)分MTB和NTM結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）：人型結(jié)核分枝桿菌牛型結(jié)核分枝桿菌非洲型結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌（NTM）：研究表明，TB-SAT可以區(qū)分如下NTM：堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜分枝桿菌、戈登分枝桿菌、海分枝桿菌等18種活菌檢測技術(shù)，可用作肺結(jié)核治療效果評估據(jù)文獻(xiàn)報道每個結(jié)核分枝桿菌含有約2000個拷貝rRNA研究表明rRNA與結(jié)核分枝桿菌的生活力有著很好的相關(guān)性，rRNA可以反映結(jié)核分枝桿菌的死菌活菌狀態(tài)研究表明在用藥治療期內(nèi)，隨著結(jié)核分枝桿菌的死亡，rRNA大約在7天左右時間全部降解。而DNA含量幾乎保持不變VIVIANJONAS,etal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Sept.1993,p.2410-2416CLAUDIOPIERSIMONI,etal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Jan.1997,p.193–196.GABRIELLEM.E.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Sept.1994,p.1959-1965

免疫法常有既往感染問題SAT更有利于治愈判斷窗口期時間示意相對濃度示意抗體RNADNA病原體感染前后各檢測靶標(biāo)的含量變化死菌的RNA快速降解，有助治愈判斷用藥治療DNA需要一段時間降解RNA快速降解65℃擴(kuò)增40min即可用肉眼觀察結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）：同時鑒定MTC與21種NTM與臨床相關(guān)性好：區(qū)分“死活菌”：TB-SAT檢測體液、病灶組織標(biāo)本的靈敏度GABRIELLEM.—既往TB史或明確TB證據(jù)結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程.耐藥分子診斷檢測的靈敏度：103CFU/ml2011年英國NICE指南、2010年美國最新結(jié)核診療指南、2010年加拿大結(jié)核指南四、常見的RNA檢測技術(shù)擴(kuò)增陽性標(biāo)本呈現(xiàn)綠色熒光，反之為陰性。減少抗生素濫用結(jié)核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10BCGsubstrainT-SPOT結(jié)果解讀-陰性結(jié)果AssessmentofMycobacterialViabilitybyRNAAmplification.4、Xpert?MTB/RIF檢測試劑的陽性檢出率低于人們對分子生物學(xué)診斷試劑高敏感度的預(yù)期值，（1000CFU/ml）相比DNA,RNA檢測能更好的體現(xiàn)療效服用利福平和氧氟沙星后，第三天和第七天DNA和RNA的滴度變化，相比DNA,RNA與藥物濃度變化的符合率更高，RNA檢測能更好的進(jìn)行療效評估。GABRIELLEM.E.Assessment

of

Mycobacterial

Viability

by

RNA

Amplification.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Sept.1994,p.1959-1965

DNARNASAT與培養(yǎng)的監(jiān)測結(jié)果一致，可應(yīng)用于療效評估監(jiān)測項目陽性患者數(shù)（%）0月0.5月1月2月4月6月集菌涂片150（100.0）53（35.3）20（13.3）9（6.0）4（2.7）6（4.0）羅氏培養(yǎng)150（100.0）83（55.3）32（21.3）16（10.7）12（8.0）12（8.0）TB-PCR148（98.7）84（56.0）47（31.3）20（13.3）12（8.0）13（8.7）SAT法150（100.0）86（57.3）35（23.3）16（10.7）12（8.0）12（8.0）胡永領(lǐng)，劉成永，成松.應(yīng)用RNA恒溫擴(kuò)增實時熒光檢測技術(shù)觀察抗結(jié)核藥物的療效.海峽藥學(xué),2015年第27卷第1期SAT在抗結(jié)核治療藥物效果檢測方面，雖不能直接作出藥物敏感試驗，但可以最快地直接判斷所用藥物的療效，及時調(diào)整藥物使用，可大大降低醫(yī)療成本和耐藥產(chǎn)生的機(jī)會，大幅度減少醫(yī)療時間和費用。TB-SAT檢測體液、病灶組織標(biāo)本的靈敏度蔡杏珊,馬品云,張院良，譚耀駒

中國防癆雜志,2014,36(6):458-461小結(jié)TBSAT是國內(nèi)唯一的結(jié)核分枝桿菌RNA檢測產(chǎn)品，2小時報告結(jié)果，可以快速對開放性肺結(jié)核患者進(jìn)行排查。TBSAT可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌，準(zhǔn)確鑒別出肺結(jié)核患者。中國防癆協(xié)會與結(jié)核病權(quán)威專家推崇TBSAT用于早期發(fā)現(xiàn)傳染性肺結(jié)核，減少肺結(jié)核導(dǎo)致的公共衛(wèi)生安全問題。美國CDC關(guān)于RNA檢測技術(shù)

在TB診斷的指南1996美國首個結(jié)核病的RNA檢測技術(shù)通過FDA認(rèn)證，配合培養(yǎng)法對涂陽患者進(jìn)行診斷2000美國CDC指出RNA檢測技術(shù)用于TB疑似患者(涂陽、涂陰)痰液檢測、DNA檢測技術(shù)僅用于涂陽患者的痰液檢測2009更新關(guān)于分子診斷技術(shù)在TB實驗室診斷的指南至少一個痰液樣本使用分子診