甘蔗斐濟(jì)病檢疫技術(shù)規(guī)范

甘蔗斐濟(jì)病檢疫技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了甘蔗斐濟(jì)病毒（SugarcaneFijidiseasevirus）RT-PCR的檢測(cè)相關(guān)原理、試劑、主要儀器與設(shè)備、樣品的采集和存放、檢測(cè)方法和結(jié)果描述及判定。本文件適用于甘蔗斐濟(jì)病毒（SugarcaneFijidiseasevirus）的RT-PCR快速檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。原理利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)甘蔗斐濟(jì)病毒，將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，RNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增合成目的片段，從而快速、靈敏、高效地對(duì)甘蔗斐濟(jì)病毒（SugarcaneFijidiseasevirus）進(jìn)行檢測(cè)。試劑除非另有規(guī)定，在分析中使用分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)室用水符合GB/T6682—2008中二級(jí)水指標(biāo)，其中涉及PCR的用水應(yīng)符合一級(jí)水指標(biāo)。液氮。植物基因組RNA提取試劑盒。Goldenview核酸染料。2×EasyTaqPCR反應(yīng)預(yù)混液（10mmol/L）。濃度為10mmol/L，其中含有0.05U/μLTaqDNAPolymerase、0.4mmol/LdNTPMixture、4mmol/LMg2+、2×PCRBuffer。1×TE緩沖液。1500bpDNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物。X脂糖，電泳級(jí)。DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；異丙醇、75％乙醇（V:V）。檢測(cè)引物序列：上游引物FDV7F：5’-CCGAGTTACGGTCAGACTGTTCTT-3’；下游引物FDV7R：5’-CAGTGGTGACGAAATGATGGCGA-3’；預(yù)擴(kuò)增片段大小為450bp±5bp。標(biāo)樣：陽(yáng)性對(duì)照為已確定感染甘蔗斐濟(jì)病毒的樣品基因組RNA；陰性對(duì)照為確定未感染甘蔗斐濟(jì)病毒的樣品基因組RNA。主要儀器與設(shè)備PCR擴(kuò)增儀。凝膠成像系統(tǒng)。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：離心力12000g以上。恒溫水浴鍋。冰箱：2℃～4℃、-20℃、-80℃。高壓滅菌鍋。鼓風(fēng)干燥箱。電子天平：感量0.001g。微量加樣器：0.1μL～2.5μL、0.5μL～10μL、10μL～100μL、50μL～1000μL。電泳槽及電源。樣品的采集、保存和運(yùn)輸樣品的采集取甘蔗植株或種苗葉片取最高可見(jiàn)肥厚帶葉（+1葉）中部部位葉片的1.0g～2.0g，放置于樣品袋中備用中部，并進(jìn)行編號(hào)。采樣過(guò)程中為避免樣本交叉污染，采樣及樣品前處理過(guò)程中應(yīng)帶上一次性手套，每采集一個(gè)樣品后，采樣工具需要75％酒精擦拭消毒或更換滅菌過(guò)的工具。樣品保存和運(yùn)輸樣品立即放置于4℃條件下保存，時(shí)間≤24h；長(zhǎng)期保存，需放置在-80℃條件下，不可反復(fù)凍融。長(zhǎng)途運(yùn)輸時(shí)，可采用保溫箱中加干冰或液氮密封后運(yùn)送。檢測(cè)方法樣品RNA提取取蔗葉樣品0.1g，用液氮冷凍研磨至粉末狀，按所選擇的植物基因組RNA的提取試劑盒推薦的操作方法進(jìn)行提取樣品RNA。樣品RNA質(zhì)量檢測(cè)樣品RNA提取后，用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)上鑒定樣品RNA的質(zhì)量。當(dāng)A260/A280比值為1.9～2.0之間時(shí)，適合于RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR檢測(cè)一步法RT-PCR檢測(cè)采用RT-PCR一步法試劑盒進(jìn)行。在0.5mLPCR管中加入1.0μLRNA模板，上、下游引物（10μmol/L）各0.25μL和ddH2O11.0μL，混勻，在PCR擴(kuò)增儀上加熱至99℃變性2min，后立即置于冰上。在以上變性混合液中依次加入5×Buffer5.0μL、10％PVP2.5μL、100mmol/LDDT1.25μL、100％DMSO1.25μL、5％BSA1.0μL、20mmol/LdNTPs0.5μL和復(fù)合酶1.0μL。反應(yīng)總體積為25μL?？瞻讓?duì)照為無(wú)菌一級(jí)水。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測(cè)。以上PCR管中混合物瞬時(shí)離心10s后，將PCR管放入PCR擴(kuò)增儀中，57℃加熱30min，95℃預(yù)熱2min；進(jìn)行35次循環(huán)（95℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min）；72℃延伸10min。取出PCR反應(yīng)管進(jìn)行電泳檢測(cè)或4℃條件下保存?zhèn)溆?。兩步法RT-PCR檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄取1.0μLRNA（濃度2.0μg/μL）、1.0μL反轉(zhuǎn)錄引物（3’-引物）和8.0μLDEPC水加入到無(wú)RNase的PCR管中，70℃加熱15min后冰浴2min，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，按步驟加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液，輕微混勻，然后500g離心30s，再42℃加熱1h，最后75℃延伸8min。反應(yīng)結(jié)束后，可以直接進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，或放于-20℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR檢測(cè)按表1的方法配制20μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)反應(yīng)體系的總體體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系參數(shù)試劑使用量20μL反應(yīng)體系終濃度2×EasyTaqPCR反應(yīng)預(yù)混液8.0μL1×FDV7F（10μmol/L）0.8μL0.8μmol/LFDV7R（10μmol/L）0.8μL0.8μmol/L模板cDNA（25ng/μL）2.0μL2ng/μL一級(jí)水8.4μL/總體積20.0μL/PCR反應(yīng)程序57℃加熱30min；95℃預(yù)熱2min，進(jìn)行35次循環(huán)（95℃預(yù)熱1min；60℃退火1min；然后72℃延伸1min），72℃延伸10min。空白對(duì)照為無(wú)菌一級(jí)水。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)稱取適量X脂糖加入1×TAE緩沖液中，加熱至完全溶解，配制成1.5％的X脂糖溶液；稍適冷卻后倒板，室溫下凝固成X脂糖凝膠。分別取2μL6×上樣緩沖液和5μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物到新的PCR管，振蕩混勻，2000g離心5s。分別將5μLDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物和PCR產(chǎn)物混合液依次加入X脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔后進(jìn)行電泳，電泳使用的電壓為80V，電泳時(shí)間為30min。凝膠成像分析將X脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)成像儀上，根據(jù)DNA分子量標(biāo)記判斷擴(kuò)增出的目的條帶大小，將電泳結(jié)果用拍照系統(tǒng)拍照形成圖片文件存檔。結(jié)果描述及判定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條大小為450bp±5bp條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)條帶時(shí)判定為實(shí)驗(yàn)有效。結(jié)果判定及描述陽(yáng)性：被檢樣品泳道出現(xiàn)一條大小為450bp±5bp條帶時(shí)，判為陽(yáng)性，必要時(shí)進(jìn)行測(cè)序。說(shuō)明該樣品含有甘蔗斐濟(jì)病毒。陰性：被檢樣品沒(méi)有出現(xiàn)一條大小為450bp±5bp條帶，經(jīng)重復(fù)2次PCR檢測(cè)后仍未出現(xiàn)目的條帶時(shí)，判為陰性。說(shuō)該樣品不含有甘蔗斐濟(jì)病毒。

（資料性）

甘蔗斐濟(jì)病相關(guān)信息病毒粒體形態(tài)特征甘蔗斐濟(jì)病毒粒體為客面球狀，直徑約66nm～70nm，具有直徑為53nm～54nm、染色較深的核心。粒子內(nèi)含RNA（可能為雙鏈），基因組由10條dsRNA片段組成。寄主范圍自然寄主為甘蔗屬中的熱帶種（Saccharumofficinarum）、大莖野生種（Saccharumrobustum）、中國(guó)種（Saccharumsinensis）和割手密（Saccharumspontaneum）。實(shí)驗(yàn)寄主包括蔗茅屬（Erianthussp.）、小麥、燕麥、大麥、水稻和高粱等。在寄主植物內(nèi)的分布主要局限于組織的韌皮部?jī)?nèi)。寄主癥狀感染斐濟(jì)病毒的甘蔗，蔗莖顯著矮化，上部葉片短，如劍狀，最后葉片集中呈扇狀。在病葉的下表皮長(zhǎng)出很多大小不一的癭（腫瘤），長(zhǎng)可達(dá)50mm，寬2mm～3mm，高1mm～2mm。最大的往往發(fā)生在下表皮中脈上。從帶病種或病叢宿根長(zhǎng)出的蔗株成簇生長(zhǎng)，只長(zhǎng)劍狀短葉，不長(zhǎng)蔗莖。分布地區(qū)甘蔗斐濟(jì)病因最初（1894年）在XX太平洋斐濟(jì)島發(fā)現(xiàn)而得其名。1908~1909年，此病在該島普