現代分子生物學實驗原理與技術

現代分子生物學實驗原理與技術第一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第一章緒論

第一節(jié)基因操作技術1.基因操作技術

基因操作技術（重組DNA技術、基因工程）是在DNA水平上闡明生命現象的技術，包括DNA的“切”、“連”、“擴”等。

“切”指限制性內切核酸酶切割DNA。

“連”指用DNA連接酶連接兩個DNA片段。

“擴”是指目的DNA在宿主/載體系統(tǒng)中進行擴增。第二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三2.實驗方案

（1）基因操作實驗的主要目的有三個：

①分離目的基因，獲取DNA信息；

②分析基因結構；

③分析基因功能。（2）試驗流程設計首先，應確定使用怎樣的研究方案；其次，根據試驗規(guī)模和研究室情況；最后，根據研究人員生活規(guī)律確定試驗時間。第三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三3.實驗方法

在設計實驗方法時應考慮

①能否達到實驗目的；

②是否符合實驗室現狀；

③是否符合自己的喜好。

實驗方法精度愛好實驗目的經費預算實驗周期儀器性能準確性速度確定實驗方法時應考慮的因素第四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三4.實驗遵循的原則①忠于實驗流程④設平行對照實驗②關注實驗要點⑤準確的試劑用量③準備充足的實驗材料⑥數據整理注意：⑴第一次實驗成功，第二次實驗馬虎。⑵實驗精度：①必須嚴格按照實驗流程進行的操作；②較嚴格的實驗操作，允許5%的變動；③允許20%變動的實驗操作；④不需要特別注意的實驗操作。⑶酶促反應不順利時，若加入更多的酶或DNA，結果會越來越糟。⑷不設平行對照實驗往往是實驗失敗的原因。⑸樣本標記的零亂也往往是實驗失敗的重要原因。第五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三5.實驗材料的準備購買利用公共服務機構接受饋贈寫求助信要注意：①你需要什么？②及時、真實的將相關信息告訴對方，不能隱瞞。③通常向論文通訊作者尋求幫助。④寫信的稿紙是印有單位標志、名稱、電話號碼等信息的公函紙。第六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)實驗室規(guī)則與安全⒈實驗室規(guī)則⑴保持肅靜⑵保持整潔⑶嚴格操作⑷注意節(jié)約⑸保證安全⒉實驗室常識⑴使用貴重儀器如分析天平、分光光度劑、離心機等倍加愛護，使用前熟知使用方法，使用時嚴格遵守操作規(guī)程，發(fā)生故障時，立即關機。⑵凡揮發(fā)性、有煙霧、有毒和有氣味的實驗，均應在通風柜內進行。第七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三⑶配制試劑時，應對試劑純度、結構式、分子質量等特性熟悉，做到“有的放矢”。⑷量瓶是量器，不要用量瓶做容器。⑸洗凈器皿應倒置架上，使其自然風干。⒊實驗室安全⑴《實驗室生物安全通用要求》查看⑵了解電閘、水閥煤氣總閥門所在處，離開實驗室檢查是否關好。⑶使用電器設備時嚴防觸電。⑷使用高溫高壓鍋滅菌時不得離人。⑸使用可燃物，特別是易燃物，應特別小心。⑹凡使用腐蝕性試劑，必須謹慎操作，防止濺出。⑺廢液特別是強酸強堿，應稀釋后倒入水池。⑻有毒物品應按照實驗室規(guī)定辦理審批手續(xù)后方可領取，使用時嚴格操作，用后妥善處理。第八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三⒋實驗室急救⑴觸電①關閉電源；②用干木棍將導線與被害者分開；③將被害者移至木板上，與地面分離；④急救者必須做好觸電安全措施，手腳必須絕緣。⑵火災隔絕氧氣①起火物與水相容：水、濕布、沙土、滅火器等②起火物與水不相容：不可用水⑶燙傷乙醇消毒，涂2%苦味酸或5%鞣酸，防感染⑷玻璃割傷或其他器械損傷

清理傷口，硼酸水洗凈，涂碘酒，包扎⑸灼傷皮膚①強堿：大量清水稀釋，涂5%硼酸或2%乙酸②強酸、溴：大量清水稀釋，5%NaHCO3或5%氨水⑹煤氣中毒呼吸新鮮空氣第九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三思考題：⒈什么是DNA重組技術？其實驗的主要目的是什么？答案⒉試分析有些人工作很辛苦，但總得不出理想實驗結果的原因。答案⒊如何獲得你需要的實驗材料（特別是未商品化的材料）？答案⒋什么是《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2004）？據此生物學實驗室可分幾級？答案⒌實驗室發(fā)生火災時該如何處理？燙傷、灼傷時該如何處理？答案⒍如何處理對環(huán)境有污染的試劑？答案第十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第二章儀器操作與溶液配制

第一節(jié)常用器皿與儀器1、塑料制品Eppendrof管第十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三2、微量移液器（槍）使用方法調節(jié)時，自大到小。由小值調到大值時，應多調1/3圈，再反調至設定值。第十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三3、恒溫水浴鍋

多用于酶促反應，將Eppendrof管插入浮漂中進行反應。第十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三4、小型離心機

離心甩干是指短時間（1~3s）的離心操作，目的是使附著于管壁的液體沉入管底。第十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三5、離心干燥機目的是使DNA樣品快速干燥。第十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三6、旋渦混合器利用不對稱的旋轉將管內液體混勻。第十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三7、振蕩器

攪拌離心管內液體，加速難容物溶解，清洗浸泡于溶液中的不潔器皿。第十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三8、真空泵

利用真空吸走液體，作用與離心干燥機或凝膠干燥機類似。第十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三9、紫外發(fā)光裝置防護板（貼有起保護作用的保鮮膜）過濾板

紫外線可分為短波、中波、長波等類型，短波光線強，對DNA損傷大。實驗室一般使用中波，使用時應戴上防護眼鏡。因燈管和過濾板有使用壽命，用完后及時關閉。第十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三10、一次性手套11、紙巾①防止危險試劑沾到手上。②防止試劑受到污染。

吸走殘余液體，一般衛(wèi)生紙就可以。擦拭實驗用品（如玻璃板）時，要用專用、不帶毛屑的面巾紙。第二十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)溶液1、實驗用水一蒸水：多用于大腸桿菌培養(yǎng)基的制備、電泳緩沖液的配制、器皿的漂洗的實驗。二蒸水：用于生物化學及組織培養(yǎng)實驗。第二十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三2、儲液3、試劑稱量精度一般稱量精度為3位有效數字。4、試劑滅菌不可高溫高壓滅菌的試劑有：①遇熱易分解的試劑②易揮發(fā)的試劑③有機溶劑④腐蝕性、刺激性強的試劑。第二十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三問題：1、如何正確使用微量移液器？使用中應特別注意哪些事項？2、如何改變微量移液器的移液量？應自大調到小，還是自小調到大？為什么？答案3、哪些試劑需要高溫高壓滅菌？哪些試劑不能采用高溫高壓滅菌？對于不能采用高溫高壓方式滅菌的試劑如何滅菌？滅菌后試劑如何保存？是否需要分裝？答案4、分子生物學實驗中，哪些簡易儀器或裝置可以替代真空泵的作用？答案5、分子生物學實驗中，哪些溶液可以用旋渦混合器混勻？為什么？6、配制培養(yǎng)基時，通常使用哪種級別的水？為什么？答案第二十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第三章大腸桿菌培養(yǎng)與保存準備1）制作平板（稱試劑、溶解、滅菌）2）清潔超凈工作臺3）配制液體培養(yǎng)基培養(yǎng)平板培養(yǎng)保存穿刺培養(yǎng)

液體小量培養(yǎng)（制作初始菌）DNA擴增甘油保存液體大量培養(yǎng)蛋白質表達第二十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)培養(yǎng)前準備1、大腸桿菌菌株主要來自K12，根據菌體表面糖蛋白成分（O抗原、H抗原、K抗原等）分類。2、培養(yǎng)大腸桿菌所需的物品微量移液器液體培養(yǎng)基槍尖盒1）操作臺第二十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三油性記號筆、小木棒、70%乙醇、涂布棒、接種環(huán)、煤氣燈、牙簽抗生素（-20℃保存）平板（蓋子朝上），保持干燥2）滅菌方法高溫高壓滅菌（培養(yǎng)基、試劑、槍尖、小木棒、牙簽等）干熱滅菌（玻璃器皿及金屬器皿）火焰滅菌（試管瓶口、接種環(huán)等）紫外線滅菌（器械及培養(yǎng)基）乙醇滅菌（實驗人員手、器械、操作臺）第二十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三3）接種工具接種環(huán)用于液體培養(yǎng)基的接種及平板劃線。小木棒用于從平板向液體轉接細菌。牙簽用于從菌落中挑選需要的單菌落。涂布棒用于向平板上涂布液體菌體。固體液體涂布棒小木棒牙簽第二十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三3、培養(yǎng)基種類1）液體培養(yǎng)基用于大量繁殖菌株以提取質粒DNA或表達的目的蛋白質。2）固體培養(yǎng)基目的是使菌落增殖到一定大小，以獲取質粒斑或分離出單菌落。3）抗生素配制：A無菌水溶解抗生素，吸入注射器針筒內。

B注射器嘴上安裝微量過濾器（過濾滅菌）。

C按每份1ml量分裝到Eppendorf管中，保存于-20℃冰箱。第二十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三使用：在接種前加入到液體培養(yǎng)基中，在配制固體培養(yǎng)基時，待滅菌后加入抗生素。4、培養(yǎng)基的配制

1)液體培養(yǎng)基的配制小體積LB培養(yǎng)基的配制（2ml為例）材料：試管及瓶塞藥匙

1L燒杯攪拌器及攪拌轉子試劑步驟：①胰蛋白酶10g

酵母提取物5g1L燒杯

NaCl10g第二十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三②加雙蒸水至刻度，用攪拌器混合均勻。③用分裝器分裝至試管，每份2ml。④高溫高壓滅菌，室溫保存。大體積LB培養(yǎng)基的配制（800ml為例）材料：藥匙

2L三角瓶鋁箔紙電動攪拌器及攪拌轉子試劑步驟：①胰蛋白酶8g

酵母提取物4g三角瓶

NaCl8g第三十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三②加雙蒸水至800ml，混合均勻。③高溫高壓滅菌，室溫保存。2)制作平板材料：煤氣燈或酒精燈水平臺面

1L三角瓶鋁箔紙直徑9cm的培養(yǎng)基藥匙試劑瓊脂粉步驟：①胰蛋白酶8g

酵母提取物4g三角瓶

NaCl8g

瓊脂粉第三十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三②鋁箔紙封口，混勻，滅菌。③待冷卻至60℃左右，分裝至培養(yǎng)皿。④水平臺上凝固。⑤倒置塑料袋中4℃保存。注意：1、若需要加入抗生素，待冷卻至60℃，分裝前加入。2、直徑9cm的平皿，每皿25ml為宜。3、盡量縮短平皿開蓋時間，分裝的培養(yǎng)基很快凝固，因此操作要快。4、凝結在蓋上的水珠可能至污染，故倒轉存放。5、氨芐青霉素易失活，添加后的平皿應在數周內使用。第三十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)大腸桿菌培養(yǎng)無菌操作前用70%乙醇消毒臺面。離酒精燈較近距離進行無菌操作。開蓋前和開蓋后用酒精燈灼燒瓶口2至3次。瓶口傾斜，不得垂直向上。使用平皿時盡量去除凝結在蓋子上的水珠，并不得混淆蓋子。1、培養(yǎng)

1）小量液體培養(yǎng)材料：接種針或小木棒煤氣燈第三十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三

搖床

2mlLB液體培養(yǎng)基長有細菌的平皿步驟：①用接種針接種燒紅接種針的鉑金絲輕觸平皿邊緣挑起一個菌落灼燒試管口，開蓋將鉑金絲伸進液體培養(yǎng)基

37℃震蕩過夜②用小木棒接種灼燒瓶口，取一根木棒木棒挑起單菌落同上第三十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三2)大量液體培養(yǎng)基材料：煤氣燈搖床少量初始菌

8mlLB液體培養(yǎng)基步驟：①小量培養(yǎng)數小時至過夜。②稍微打開盛有大體積培養(yǎng)液的三角瓶瓶蓋，灼燒瓶口。③打開有初始培養(yǎng)菌的試管口，灼燒，將初始培養(yǎng)菌轉入大量培養(yǎng)基中，蓋上蓋子，再灼燒瓶口。④37℃震蕩過夜。3）菌落測定第三十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三①在煤氣燈旁用微量移液器吸培養(yǎng)液，轉至Eppendrof管。②打開分光光度計，調整波長至600nm。③吸取未接菌的培養(yǎng)基至比色杯中，調整光吸收值為零。④取Eppendrof管內的菌液于比色杯中，測A600值。4）平板培養(yǎng)劃線培養(yǎng)材料：接種針、煤氣燈或酒精燈、新的LA平板、菌誘導期對數生長期平臺期死亡期結果：A=0.2~1.0時為指數生長期，A＞1.0為平臺期。A=1.0為10個/ml。8600600600第三十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三步驟：①用煤氣燈將接種針燒紅，輕觸平板一側，冷卻。②用鉑金絲挑去平板上的單菌落，在培養(yǎng)基表面劃線。③再灼燒鉑金絲，冷卻。④與前面所劃線的一部分交叉劃線，以減少菌數。⑤重復上步驟。⑥37℃倒置培養(yǎng)過夜。第三十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)大腸桿菌菌株保存1、平板保存材料：新平板、圓形標簽紙、牙簽、封口膜或膠帶、長有大腸桿菌的初始平皿步驟：①在平板底部貼標簽，做標記。②用牙簽挑單菌落，接種到平板。③37℃過夜后4℃保存。涂布培養(yǎng)材料：涂布棒、新的平板、酒精燈或煤氣燈、菌液步驟：①將平板翻轉過來，置于蓋上，50℃干燥20至30分鐘。②取100ul菌液，滴于平板上。③用涂布棒涂布均勻。④37℃倒置過夜。第三十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三3、穿刺保存材料：含0.7%瓊脂的LB培養(yǎng)基、鉑金絲、封口膜、玻璃瓶。步驟：①玻璃瓶內裝2/3培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。②接種針火焰滅菌，在培養(yǎng)基中冷卻。③挑取單菌落后刺入培養(yǎng)基底部。④37度下培養(yǎng)12至18小時。⑤蓋緊瓶蓋，封口膜封口，室溫避光保存。2、甘油管保存材料：2ml凍存管、滅菌的80%甘油、封口膜、菌液步驟：①過夜培養(yǎng)2ml菌液后，取1ml至凍存管。②加入200ul80%甘油，混勻。③擰緊管帽，用封口膜封口，保存于-70℃或-20℃。第三十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三問題：1、用于基因克隆的大腸桿菌菌株主要有哪些？它們各自有什么主要特征？2、配制氨芐青霉素等抗生素時是否需要滅菌？如何滅菌?3、在進行大腸桿菌培養(yǎng)時，何時需要大量培養(yǎng)？何時需要小量培養(yǎng)？4、在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，應注意哪些問題？5、當用平板培養(yǎng)大腸桿菌時，培養(yǎng)皿必須倒置，為什么？6、大腸桿菌的保存方法主要有哪些？第四十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第四章基因操作中的酶學反應

第一節(jié)常用酶的保存注意：1、常規(guī)儲存于-20℃

，也有4℃或8℃

。2、儲存的冰箱不能選用自動除霜類。3、不與通常樣品保存在同一冰箱。4、盡可能在短時間內完成全部操作。5、直接在冰箱內吸取需要的酶量。6、可用冰盒或金屬制的冰空盛裝Eppendrof管，以便在冰箱之外吸取酶液。第四十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)限制性內切核酸酶1、定義：是一類識別DNA上3~8個特異核苷酸序列，并產生切割反應的內切核酸酶的總稱。2、修飾酶：與限制性內切核酸酶識別的DNA序列相同，產生修飾反應的酶叫修飾酶，主要是甲基化酶。3、限制-修飾系統(tǒng)：限制性內切核酸酶對病毒等外來DNA起切割反應，但自身基因組DNA因修飾酶的修飾作用而不能被切割，這種防御機制叫~第四十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三1、識別序列

Ⅱ型限制性內切核酸酶的識別序列長度通常為4~8個核苷酸，對數具有對稱的回文結構。識別序列越長，其序列在DNA中出現的概率就越低。4、限制性內切酶的命名EcoRⅠE代表Escherichia屬

co代表coli種

R代表RY13株用羅馬數字區(qū)別不同特異性的酶第四十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三2、DNA片段的末端結構如EcoRⅠ切割后產生5ˊ粘性末端：PstⅠ切割后產生3ˊ粘性末端：第四十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三

有一些酶沿對稱軸切斷DNA，產生平端或鈍端（Bluntend）,如SmaⅠ：3、反應條件

添加緩沖液濃度：10×儲液

反應最適溫度：37℃

第四十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)限制性內切核酸酶消化DNA實驗

1、單個酶的切割反應材料:37℃恒溫水浴箱

pBlueScriptⅡSK（DNA）雙蒸水

EcoRⅠ10×H添加緩沖液步驟：①按以下順序混合試劑：雙蒸水13uLDNA4uL10×H緩沖液2uLEcoRⅠ1uL②混勻。③37℃保溫1小時。+第四十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期三④確認酶是否切完全（取1~4uL進行瓊脂糖凝膠電泳）。⑤剩余的反應液用于以后的實驗。本實驗中注意：1、酶較昂貴，注意節(jié)約，加樣中可能會失敗，故最后添加酶。2、反應體系中加入的酶量不能超過總體積的1/10。（否則將導致第二活力）。3、酶試劑中添加有甘油，應適當離心后混勻，切忌用旋渦混合器等劇烈震蕩，否則可致酶失