挖掘新基因資源的方法

隨著生物科技和基因工程技術(shù)的發(fā)展，酶制劑的開(kāi)發(fā)和研究越來(lái)越需要更多的酶基因資源，目前國(guó)內(nèi)研究方法主要有以下幾種：通過(guò)尋找新的微生物資源我們尋找新的基因資源最直接和最傳統(tǒng)的方法就是通過(guò)對(duì)自然界的微生物進(jìn)行篩選，獲得更多的優(yōu)良的微生物資源，然后通過(guò)分子生物學(xué)手段獲取基因資源，早期的研究大多數(shù)局限于此。微生物篩選的基本流程大致如下：根據(jù)不同的目的選取特定的地點(diǎn)采集樣品，常選取比較極端的環(huán)境。對(duì)采集的樣品進(jìn)行處理，稀釋培養(yǎng)，或者富集培養(yǎng)很據(jù)不同的樣品和目的進(jìn)行初篩，復(fù)篩。菌種篩選的手段篩選的手段必需配合不同篩選階段的要求，對(duì)于初篩，要力求快速、簡(jiǎn)便，對(duì)于復(fù)篩，應(yīng)該做到精確，測(cè)得的數(shù)據(jù)要能夠反映將來(lái)的生產(chǎn)水平。1)從菌體形態(tài)變異分析有時(shí)，有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來(lái)。盡管相當(dāng)多的突變菌株并不存在這種相關(guān)性，但是在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。當(dāng)然，這種鑒別方法只能用于初篩。2)平皿快速檢測(cè)法平皿快速檢測(cè)法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見(jiàn)的"形態(tài)"變化。具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長(zhǎng)圈法和抑制圈法等。這些方法較粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初篩，但它們可以大大提高篩選的效率。它的缺點(diǎn)是由于培養(yǎng)平皿上種種條件與搖瓶培養(yǎng)，尤其是發(fā)酵罐深層液體培養(yǎng)時(shí)的條件有很大的差別，有時(shí)會(huì)造成兩者的結(jié)果不一致。平皿快速檢測(cè)法操作時(shí)應(yīng)將培養(yǎng)的菌體充分分散，形成單菌落，以避免多菌落混雜一起，引起"形態(tài)"大小測(cè)定的偏差。細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)，各種代謝產(chǎn)物的測(cè)定。細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，性能測(cè)定，克隆基因，表達(dá)分析。缺點(diǎn)：開(kāi)發(fā)周期太長(zhǎng)；優(yōu)點(diǎn)：操作方法簡(jiǎn)單，獲得較多的菌種資源。大型設(shè)備：電子天平、超凈工作臺(tái)、高低溫恒振蕩培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、可見(jiàn)光分光光度計(jì)、高壓蒸汽滅菌鍋、PCR儀，紫外成像系統(tǒng)。實(shí)例：篩選高溫淀粉酶產(chǎn)生菌及克隆基因（廣西大學(xué)薛蓓2009年碩士畢業(yè)論文）采樣在在高溫環(huán)境（廣西象州溫泉）采樣，共選擇三個(gè)采樣點(diǎn)，即熱泉口（溫度80°C,pH7.0）、溫泉水（溫度73°C,pH6.5）及溫泉旁邊的底泥（溫度65C,pH6.8）。產(chǎn)a-淀粉酶產(chǎn)生菌的菌株篩選將采集的樣品分級(jí)稀釋，涂布在以可溶性淀粉為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上，于60C-80C倒置培養(yǎng)24h,待長(zhǎng)出菌落后，將平板置于4C,直到淀粉板上透明圈明顯后取出，觀察透明圈大小，并測(cè)量菌落直徑（C）及透明圈直徑（H）,計(jì)算透明圈與菌落直徑比值（H/C）作為初篩指標(biāo)，初步篩選出產(chǎn)淀粉酶高的優(yōu)良菌株進(jìn)行進(jìn)一步的純培養(yǎng)。再以這些菌株為材料，液體培養(yǎng)檢測(cè)其淀粉酶的活力以復(fù)篩選出了淀粉酶產(chǎn)量高的菌株。菌株鑒定，酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定選取復(fù)篩優(yōu)良菌株65C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定發(fā)酵液酶活，并初測(cè)其性質(zhì)，并鑒定該菌株。克隆高溫淀粉酶基因根據(jù)GeneBank已公布的與所篩選菌株同源性最高的菌株里淀粉酶的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PRC擴(kuò)增得到目的基因。該基因編碼的淀粉酶在80C下保溫20min,殘留活性在85%以上。宏基因組技術(shù)挖掘新基因資源分子微生物生態(tài)學(xué)的研究業(yè)已證明環(huán)境中大量存在未能培養(yǎng)的微生物，某些環(huán)境中采用現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)能夠培養(yǎng)的微生物不到1%，超過(guò)99%的微生物尚未能培養(yǎng)（AmannRI,LudwigW,1995）,可見(jiàn)基于微生物分離培養(yǎng)的技術(shù)途徑開(kāi)發(fā)利用微生物資源受到了極大的限制。為了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多樣性基因資源，人們?cè)趯ふ倚录夹g(shù)方法上傾注了極大的熱情?！昂昊蚪M”即指生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，目前主要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌的基因組總和（HandelsmanJ.,RondonM.R.Brady,1998）。宏基因組文庫(kù)既包含了可培養(yǎng)的又包含了未能培養(yǎng)的微生物基因，避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)的問(wèn)題，極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間。目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲蟲(chóng)、人唾液等環(huán)境樣品成功構(gòu)建了宏基因組文庫(kù)，已篩選到的生物活性物質(zhì)有各種酶類及一些次生代謝產(chǎn)物，包括脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、幾丁質(zhì)酶、核酸酶、膜蛋白、4-羥基丁酸代謝酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗腫瘤活性物質(zhì)及抗生素抗性基因等。宏基因組文庫(kù)技術(shù)的主要流程如下：從環(huán)境中提取宏基因組DNA；先采集環(huán)境樣品，處理，裂解，抽提總DNA，一般按處理樣品方式的不同劃分為直接提取法和間接提取法。顧名思義，直接提取法就是直接對(duì)樣品進(jìn)行裂解，釋放其中的DNA；間接提取法則是先分離樣品中的微生物，后對(duì)微生物進(jìn)行裂解用核酸內(nèi)切酶切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段并連接到合適的載體上。轉(zhuǎn)化宿主菌，形成一個(gè)重組的DNA文庫(kù)即宏基因組文庫(kù)。將提取的高質(zhì)量的總DNA用合適的酶切、回收，然后和處理好的合適的載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化宿主。宏基因組文庫(kù)篩選。由于環(huán)境樣品中微生物種類繁多，宏基因組文庫(kù)容量一般較大，活性克隆子的篩選是新活性物質(zhì)篩選的瓶頸，根據(jù)研究目的,可從生物活性水平、化合物結(jié)構(gòu)水平以及DNA序列水平設(shè)計(jì)不同的篩選方案。生物活性水平的篩選又稱為功能驅(qū)動(dòng)篩選(function-drivenscreening),根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)行篩選。采用各種活性檢測(cè)手段檢測(cè)挑選活性物活性克隆子，進(jìn)行生化分析和插入DNA片段序列分析，進(jìn)而對(duì)其深入研究。這一策略以生為線索能夠發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)或基因，能夠快速鑒別有開(kāi)發(fā)潛力的克隆子，但工作量大，效率低，并且受檢測(cè)手段的局限。DNA序列水平的篩選又稱為序列驅(qū)動(dòng)篩選(sequence-drivenscreening),以序列相似性為基礎(chǔ)，執(zhí)行某類功能的酶可能具有相識(shí)的基因序列。根據(jù)某些已知的相關(guān)功能基因的保守序列或相似序列設(shè)計(jì)雜交探針或PCR引物，通過(guò)雜交或PCR擴(kuò)增挑選陽(yáng)性克隆。這一策略有可能篩選到某一類結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)中的新分子，而且基于DNA的操作有可能利用基因芯片技術(shù)大大提高篩選效率，但必須對(duì)相關(guān)基因序列有一定的了解，較難發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)。儀器設(shè)備：恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，無(wú)菌工作臺(tái)，低溫冰箱,恒溫水浴鍋,制冰機(jī),分光光度計(jì)，微量移液槍，PCR儀，精密移液器等。該方法的難點(diǎn)是提取到高質(zhì)量的DNA及高通量的篩選方法的建立。優(yōu)點(diǎn)：篩選范圍廣，獲得全新基因資源幾率大缺點(diǎn)：對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員要求高，技術(shù)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)較昂貴目前也有很多研究者直接省略構(gòu)建文庫(kù)的步驟，以宏基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)兼并引物或其他引物探針進(jìn)行擴(kuò)增基因。如華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)研究所（林俊芳，2009年7月）就從海南，廣州，新疆等地的環(huán)境樣品中克隆到12個(gè)漆酶基因片段。從蛋白質(zhì)純化著手的方法（純化后克?。┏Ｒ?guī)的基因克隆都是先通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)或者PCR技術(shù)克隆到基因，然后通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行分析，來(lái)展開(kāi)對(duì)該基因所編碼的蛋白質(zhì)研究。隨著蛋白質(zhì)化學(xué)和蛋白質(zhì)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究者從天然的蛋白質(zhì)出發(fā)，然后對(duì)蛋白質(zhì)部分或者全部測(cè)序，從而分子生物學(xué)手段獲取基因。若研究者可得到足夠多的純化目的蛋白可根據(jù)目的蛋白的生物學(xué)功能,利用同位素標(biāo)記的配體來(lái)篩選受體表達(dá)的陽(yáng)性克隆。當(dāng)所分離的目的蛋白較難大量獲得,但純度較高時(shí),可利用其中的一段氨基酸序列,反推出其基因序列,據(jù)此合成寡核苷酸用于cDNA文庫(kù)的篩選；或根據(jù)所獲得的基因序列，指導(dǎo)5'端的引物合成，根據(jù)mRNA3'端poly2A序列指導(dǎo)合成poly2T的3'端引物，用PCR技術(shù)從制備細(xì)胞的mRNA或直接從胞漿內(nèi)溶物物中合成相應(yīng)的cDNA,將該cDNA克隆到表達(dá)載體上進(jìn)行產(chǎn)物表達(dá)。方法流程：培養(yǎng)微生物，收集培養(yǎng)物。分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，檢測(cè)蛋白性質(zhì)和純度。蛋白純化主要有超濾，鹽析（硫酸銨沉淀等），有機(jī)溶劑沉淀，離子交換層析，凝膠過(guò)濾層析，親和層析等方法，一般在純化過(guò)程中，以上方法組合使用。將純化后的蛋白進(jìn)行N端測(cè)序或者質(zhì)譜分析，獲得蛋白質(zhì)全序列或者部分肽鏈序列。分析測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增基因（合成基因），進(jìn)行表達(dá)分析。以Bacillussp.酸性淀粉酶克隆為例：（廣西大學(xué)2010年謝建華碩士畢業(yè)論該方法中，純化蛋白和設(shè)計(jì)合適的兼并引物是關(guān)鍵和難點(diǎn)。儀器設(shè)備：恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，PCR儀，凝膠成像儀，冷凍離心機(jī)，核酸電泳儀，超凈臺(tái)，水浴鍋，臺(tái)式離心機(jī)，蛋白純化系統(tǒng)等優(yōu)點(diǎn)：目的明確，創(chuàng)新性強(qiáng)缺點(diǎn)：費(fèi)用高，流程復(fù)雜基因組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展使得生物數(shù)據(jù)庫(kù)中基因和基因組序列數(shù)據(jù)呈爆炸式增長(zhǎng)。根據(jù)基因組測(cè)序計(jì)劃統(tǒng)計(jì)網(wǎng)站GOLD（）截止到2012年3月12日的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，已有3173種生物的全基因組完成測(cè)序，其中2874種屬于細(xì)菌，353種屬于古細(xì)菌，173種屬于真核生物；而全球正在進(jìn)行的全基因組測(cè)序計(jì)劃還有10479個(gè)．另有1970個(gè)宏基因組測(cè)序計(jì)劃正在進(jìn)行或已經(jīng)完成。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示(http:///Genbank/index.html).截止到2011年4月.該網(wǎng)站中傳統(tǒng)的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有近1.3億多條序列.而全基因組鳥(niǎo)槍法(wholegenomeshotgun,WGS)測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)記錄的來(lái)自個(gè)體和宏基因組的序列已有6200多萬(wàn)條.堿基數(shù)量累計(jì)1480億個(gè)。在如此龐大的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)疑包含著海量的工業(yè)酶基因資源。新的基因資源的發(fā)現(xiàn)也從“挖土”篩選微生物轉(zhuǎn)向從數(shù)據(jù)庫(kù)中“挖基因”,也就是所謂的“基因組打獵”(genomehunting)或”數(shù)據(jù)挖掘”(datamining),該方法實(shí)際上是根據(jù)某一已知的探針酶的基因序列去搜索數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能類似的同源酶的編碼序列。在此基礎(chǔ)上，研究者可以方便地設(shè)計(jì)引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)從目標(biāo)物種中大量地?cái)U(kuò)增獲得目的酶基因.并進(jìn)行異源重組表達(dá)?；玖鞒?從數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank,EMBL,DDBJ等)中查詢目標(biāo)酶在不同物種中的編碼基因信息和序列(或者相關(guān)生物的基因組數(shù)據(jù))。分析相關(guān)的基因(同源基因或物種相近的基因)序列，從中尋找目標(biāo)酶的編碼基因的全ORF或EST序列。設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增或者進(jìn)行基因合成，表達(dá)分析。實(shí)例克隆堿性脂肪酶基因:查閱現(xiàn)有的相關(guān)堿性脂肪酶報(bào)道文獻(xiàn)，了解堿性脂肪酶的信息?？稍贕enBank,EMBL,DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索堿性脂肪酶基因信息。以GenBank為例檢索。在/genbank/的檢索框里輸入alkalinelipase如圖:搜索的結(jié)果如下:Results：1to20of66 Page1of4Next>OAFUA2G060101alkalinelipase[AspergiHusfumigatusAf293]OtherAliases:AFUA_2G06010,Afu2g06010Chromosome:2Annotation:Chromosome2,NC_007195.1(1701552.1702608)ID：3506955nAB57-■alkalinelipase[AcinetobacterbaumanniiAB0057]OtherAliases:AB57_2667Genomiccontext:ChromosomeAnnotation:NC_011586.1(2756265.2757494,complement)ID：7044280O￥E1342孑lipase[Yersiniaenterocofiticasubsp.enterocofitica8081]OtherAliases:YE1842Genomiccontext:Chromosome?MPFlFlRfinn1ronOTfiCT然后下載相關(guān)的alkalinelipase基因序列，在vectorNTI(或者NNASTAR等DNA分析軟件)分析基因的ORF等信息。如沒(méi)有相關(guān)模板用來(lái)擴(kuò)增，則可以直接將分析的NC_007195，和NC_011585.1基因的編碼框進(jìn)行全基因合成，進(jìn)行基因表達(dá)分析。在有特定的DNA模板的情況下，可以將來(lái)源相近的菌株的相關(guān)脂肪酶基因利用ClustalX進(jìn)行比對(duì)，需找同源區(qū)域設(shè)計(jì)引物單次或多次擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)基因。該方法關(guān)鍵在于能找到多個(gè)基因的同源片段，或者能找到目標(biāo)酶一致性較高的基因。設(shè)備：計(jì)算機(jī)，PCR儀，紫外成像系統(tǒng)