氨溴索對(duì)環(huán)丙沙星透過(guò)銅綠假單胞菌生物膜的影響

氨溴索對(duì)環(huán)丙沙星透過(guò)銅綠假單胞菌生物膜的影響【摘要】目的研究氨溴索對(duì)環(huán)丙沙星透過(guò)銅綠假單胞菌生物膜的影響。方法孔徑為μm的醫(yī)用微孔濾膜建立銅綠假單胞菌生物膜的體外模型；用高效液相色譜(HPLC)方法測(cè)定環(huán)丙沙星透過(guò)生物膜的量，并測(cè)定在2和/ml氨溴索作用后環(huán)丙沙星透過(guò)細(xì)菌生物膜的量。結(jié)果經(jīng)過(guò)7d的連續(xù)培養(yǎng)后，銅綠假單胞菌可在微孔濾膜上形成均勻致密的生物膜。環(huán)丙沙星可緩慢透過(guò)細(xì)菌生物膜，8h左右達(dá)到平衡；2和/ml氨溴索作用后可以明顯增加環(huán)丙沙星8h內(nèi)透過(guò)生物膜的量。結(jié)論以醫(yī)用微孔濾膜為載體可建立銅綠假單胞菌生物被膜體外模型；氨溴索可以顯著地促進(jìn)環(huán)丙沙星對(duì)細(xì)菌生物膜的透過(guò)。

【關(guān)鍵詞】細(xì)菌生物膜環(huán)丙沙星氨溴索銅綠假單胞菌滲透限制

Effectofambroxolonpermeabilityofciprofloxacinacross

ABSTRACTObjectiveToinvestigatetheeffectofambroxolonthepermeabilityofciprofloxacinacrossthebacterialbiofilmofPseudomonasaeruginosa.MethodsInvitromodelofbiofimusingμmporediametermedicalmicroporefilmwasestablished.TheamountsofciprofloxacinacrossthebacterialbiofilmwasmeasuredbyHPLCunderdifferentcircumstances:physiologicalsaline,2mg/mland/mlambroxol,andclarithromycinwasusedaspositivecontrol.ResultsAftercontinuoussevendaycultivation,couldformcompactandwelldistributedbiofilmonthesurfaceofmicroporefilm.Ciprofloxacincouldslowlypermeatethroughthebiofilmandequilibrationwasachievedin8h.Whencombinedwithambroxol,thepermeabilityrateofciprofloxacinsignificantlyincreased.ConclusionsInvitromodelofbiofilmwassuccessfullyestablishedusingmedicalmicroporefilmasasupporter,andambroxolcansignificantlypromotethepermeabilityofciprofloxacinacrossthebacterialbiofilmofPseudomonasaeruginosa.

KEYWORDSBacterialbiofilm;Ciprofloxacin;Ambroxol;Pseudomonasaeruginosa;Penetrationlimitation

細(xì)菌生物膜(biofilm，BF)是一個(gè)具有結(jié)構(gòu)性、協(xié)調(diào)性和功能性的高度組織群體，BF菌生物學(xué)特性與浮游菌顯著不同，其環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)，可抵抗吞噬細(xì)胞作用，逃避宿主免疫，故耐藥性極強(qiáng)，使BF相關(guān)感染的臨床治療變得非常棘手。在BF細(xì)菌的耐藥機(jī)制中，滲透限制顯得尤為重要。由于BF的特殊結(jié)構(gòu)，使抗生素難以滲透，導(dǎo)致只有BF表面的細(xì)菌暴露于有效劑量的抗生素中，而B(niǎo)F深層的細(xì)菌難以被殺滅，這也是臨床上BF感染難以治愈或遷延反復(fù)的原因之一。國(guó)外有報(bào)道，化痰藥N乙酰半胱氨酸干擾生物膜形成，破壞生BF結(jié)構(gòu)的作用［1］，被認(rèn)為是一種具有抗菌性質(zhì)的非抗生素藥物。氨溴索(商品名：沐舒坦)是臨床治療中常用的化痰藥物之一，與N乙酰半胱氨酸作用機(jī)制上有一定的相似性，但它是否具有破壞BF結(jié)構(gòu)，增加藥物滲透的作用還不確切。本實(shí)驗(yàn)在建立體外BF模型的基礎(chǔ)上，探討氨溴索對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素環(huán)丙沙星透過(guò)BF的影響，為臨床上選擇氨溴索作為抗生素治療的輔助藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

藥物

氨溴索標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)20051011)、鹽酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)30451200302)和克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)20040613)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

BF載體及模型材料

μm的醫(yī)用微孔濾膜(上海興亞凈化材料廠)，直徑1cm高的玻管(重慶醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司訂做)。

受試菌株

銅綠假單胞菌PAO1菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑

乙腈色譜純(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20051119)；磷酸分析純(批號(hào)20050907)和三乙胺色譜純(批號(hào)20041105)均為成都市科龍化工廠產(chǎn)品。

儀器

津島LC2010A高效液相色譜系統(tǒng)，NC2000色譜工作站，SPD10A型紫外可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器。

2方法

體外BF模型的建立［2］

用孔徑為μm的醫(yī)用微孔濾膜封閉直徑為1cm的玻管一端。玻管無(wú)菌處理后，濾膜端向下置于24孔板中。向玻管中加入500μl菌液和一定量LB培養(yǎng)基，24孔板的每孔內(nèi)加入適量培養(yǎng)基，使液面與玻管內(nèi)液面相平，37℃連續(xù)培養(yǎng)7d后，每個(gè)玻管內(nèi)加入相應(yīng)藥物，作用不同時(shí)間取樣，以HPLC測(cè)定24孔板中每孔玻管外的環(huán)丙沙星濃度。

濾膜上BF的鑒定［3］

加藥前隨機(jī)抽取3孔，用銀染法鑒定濾膜上BF形成的情況。

最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用微量稀釋法測(cè)定環(huán)丙沙星、克拉霉素對(duì)PAO1菌株的MIC。

用HPLC法測(cè)定LB培養(yǎng)基中環(huán)丙沙星的濃度［4］

(1)色譜條件色譜柱：AlltechAlltimeC18(150mm×，5μm)，柱溫35℃；流動(dòng)相：稀磷酸∶乙腈為87∶13(三乙胺調(diào)節(jié)pH至±)；檢測(cè)波長(zhǎng)278μm，流動(dòng)相流速/min。理論板數(shù)按鹽酸環(huán)丙沙星峰計(jì)算不低于2000，鹽酸環(huán)丙沙星峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度符合規(guī)定。

(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱(chēng)取于105℃干燥至恒重的鹽酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品適量(相當(dāng)于環(huán)丙沙星40mg)溶于100ml容量瓶中，加LB培養(yǎng)基溶解至刻度，搖勻；精密量取1、2、4、6和8ml置100ml容量瓶中，加LB培養(yǎng)基溶解至刻度，搖勻，即得不同濃度的系列環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液(、、、和/ml)。

(3)樣品預(yù)處理精密吸取樣品500μl于EP管中，加入乙腈1000μl，渦旋30s，離心5min(10000r/min)，取上清液20μl進(jìn)樣分析。

(4)精密度試驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法配制低、中、高三種濃度(、、/ml)的環(huán)丙沙星LB溶液，按樣品預(yù)處理方法進(jìn)行預(yù)處理，分別于1d內(nèi)和1周內(nèi)加樣檢測(cè)6次，以求得日內(nèi)和日間標(biāo)準(zhǔn)偏差。

(5)回收率試驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法配制低、中、高三種濃度(、、/ml)的環(huán)丙沙星LB溶液，按樣品預(yù)處理方法處理后加樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算回收率。

3結(jié)果

BF銀染鑒定結(jié)果

濾膜經(jīng)銀染后，肉眼可見(jiàn)膜表面呈灰黑色著色，色澤均勻、致密，表明濾膜表面有銅綠假單胞菌BF形成。

環(huán)丙沙星及克拉霉素對(duì)PAO1的MIC

結(jié)果見(jiàn)表1。

HPLC測(cè)量孔內(nèi)滲出環(huán)丙沙星量的結(jié)果

(1)HPLC測(cè)定環(huán)丙沙星濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為

y=6741+3439513xr=

在～/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。最低檢測(cè)濃度為/ml。

(2)HPLC環(huán)丙沙星精密度的考察結(jié)果見(jiàn)表2。

(3)HPLC環(huán)丙沙星回收率的考察結(jié)果見(jiàn)表3。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該HPLC色譜條件可用于LB溶液中環(huán)丙沙星濃度的檢測(cè)。

(4)環(huán)丙沙星透過(guò)生物膜的速度體外生物膜模表1環(huán)丙沙星及克拉霉素對(duì)PAO1的MIC表2不同濃度的環(huán)丙沙星日內(nèi)和日間精密度表3不同濃度的環(huán)丙沙星回收率型建立后，向玻管內(nèi)加入環(huán)丙沙星至終濃度20μg/ml，分別在0、2、4、6、8、10和12h取樣，動(dòng)態(tài)觀察滲出的環(huán)丙沙星濃度依次為0、(±)、(±)、(±)、(±)、(±)和(±)μg/ml(n=6)。結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星可以緩慢的透過(guò)生物膜，其濃度隨時(shí)間而增加，在8h左右達(dá)到平衡。(5)氨溴索對(duì)環(huán)丙沙星透過(guò)生物膜的影響結(jié)果見(jiàn)表4。表4氨溴索對(duì)環(huán)丙沙星透過(guò)細(xì)菌生物膜的影響結(jié)果表明，空白組可見(jiàn)一定量的環(huán)丙沙星透過(guò)生物膜，隨著環(huán)丙沙星濃度的升高，透過(guò)BF的環(huán)丙沙星量增加。加入氨溴索2mg/ml后，透過(guò)生物膜的環(huán)丙沙星量有明顯的增加，與空白組相比()有顯著性差異。加入低濃度的氨溴索/ml，透過(guò)生物膜的環(huán)丙沙星量與空白組相比也有明顯增加()，有顯著性差異，但增加不及高濃度氨溴索2mg/ml組。氨溴索2mg/ml組透過(guò)的環(huán)丙沙星量除環(huán)丙沙星10μg/ml組外，均與克拉霉素陽(yáng)性對(duì)照組相似，無(wú)顯著性差異。

4討論

已有很多研究報(bào)道胞外多糖復(fù)合物形成分子屏障和電荷屏障(大多帶負(fù)電荷)可阻止或延緩某些抗生素的滲入，固定在BF基質(zhì)中一些抗生素水解酶［5］也可促使進(jìn)入BF的抗生素滅活［6］。近年來(lái)，細(xì)菌BF相關(guān)感染已成為臨床上常見(jiàn)的感染類(lèi)型。由于細(xì)菌BF本身的生理結(jié)構(gòu)特性以及某些醫(yī)療器材(如氣管內(nèi)插管的導(dǎo)管)本身的非通透性，使抗生素的滲透成為治療BF相關(guān)感染的一大難題。條件致病菌銅綠假單胞菌導(dǎo)致慢性難治性感染的原因就是因?yàn)殂~綠假單胞菌以BF形式存在，而B(niǎo)F的特殊結(jié)構(gòu)可以保護(hù)細(xì)菌逃避機(jī)體的免疫機(jī)制，并且BF的滲透限制還可以避免深層細(xì)菌接觸有效濃度的抗生素［7］，使感染遷延不愈。因此解決細(xì)菌BF對(duì)抗生素的滲透限制問(wèn)題，對(duì)臨床上細(xì)菌BF感染的治療將有很大幫助。

本實(shí)驗(yàn)利用醫(yī)用微孔濾膜為載體，構(gòu)建了細(xì)菌BF的體外模型，為研究細(xì)菌BF的滲透性提供了很好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。藻酸鹽是銅綠假單胞菌BF胞外多糖的主要成分，胞外多糖對(duì)細(xì)菌的滲透限制起重要作用?？死顾刈鳛槭脑h(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，已有報(bào)道它對(duì)BF通透性好，能抑制藻酸鹽形成，破壞BF結(jié)構(gòu)進(jìn)而減少細(xì)菌BF的滲透限制［8］，故該實(shí)驗(yàn)選擇克拉霉素1×MIC作為陽(yáng)性對(duì)照。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在高濃度氨溴索(2mg/ml)作用下，環(huán)丙沙星滲出BF的量較空白組有明顯增加，與陽(yáng)性對(duì)照組相比差別沒(méi)有顯著性，說(shuō)明該濃度的氨溴索作用與克拉霉素相似。臨床上，氨溴索作為常用的化痰藥，它可以使痰液變稀薄，纖毛運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)使痰液易咳出，近年來(lái)有報(bào)道氨溴索不僅具有祛痰的作用，還可以增加氨芐西林/舒巴坦向肺部轉(zhuǎn)運(yùn)，增加氨芐西林/舒巴坦的殺菌作用［9］。本實(shí)驗(yàn)證明對(duì)呼吸道細(xì)菌BF感染的患者使用氨溴索，不光可以易化痰液的咳出，對(duì)抗生素滲透入細(xì)菌BF也將有很大幫助，可作為臨床上治療BF相關(guān)感染的輔助用藥。

測(cè)定生物樣品中環(huán)丙沙星濃度的HPLC法，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道［10，11］。本法采用乙腈為蛋白沉淀劑，直接沉淀蛋白后進(jìn)樣，簡(jiǎn)單易操作。優(yōu)化流動(dòng)相，對(duì)考察LB培養(yǎng)基中的環(huán)丙沙星濃度適用。

氨溴索增加BF對(duì)抗生素的滲透的機(jī)制，可能與其抑制細(xì)菌胞外多糖的形成有關(guān)，本課題組正在對(duì)此作進(jìn)一步研究。

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