吉西他濱對人非小細胞肺癌A549細胞增殖與凋亡的影響

吉西他濱對人非小細胞肺癌A549細胞增殖與凋亡的影響【摘要】目的研究吉西他濱體外對人非小細胞肺癌A549細胞增殖及凋亡的作用。方法應(yīng)用MTT法，流式細胞儀，AnnexinVPI雙標法，Tunel法等多項方法，體外研究吉西他濱對A549細胞的促凋亡作用；采用免疫組化的方法，觀察藥物作用后bcl2表達的變化。結(jié)果吉西他濱對A549細胞生長具有抑制作用，并有促凋亡效應(yīng)，對細胞周期的影響表現(xiàn)為S期的阻滯，藥物處理的細胞凋亡，可見伴有bcl2的下調(diào)。結(jié)論吉西他濱可抑制人非小細胞肺癌A549細胞的生長，并誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)凋亡是吉西他濱抗腫瘤作用機制的原因之一，而且凋亡與bcl2的表達有一定關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】吉西他濱細胞凋亡非小細胞肺癌bcl2

0引言

非小細胞肺癌的預(yù)后比較差，盡管現(xiàn)在的治療不斷發(fā)展，生存率提高的還是很少[1]。凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的主要原因,誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡已成為當前腫瘤治療的熱點。吉西他濱是一種新型的脫氧胞苷類似物和核苷還原酶抑制劑，對多種實體瘤具有良好的抗腫瘤活性。但是體外研究其對非小細胞肺癌的凋亡作用及其凋亡機制的研究尚且不多。

1材料和方法

藥物與試劑

吉西他濱，RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清為Gibico公司產(chǎn)品，bcl2單克隆抗體購于北京晶美公司，HEPES，四氮唑藍、二甲基亞砜，碘化丙啶，免疫組化試劑盒，AnnexinVPI雙標凋亡試劑盒均為北京中山生物公司產(chǎn)品。

細胞培養(yǎng)

人肺腺癌細胞A549由同濟醫(yī)院呼吸內(nèi)科重點實驗室凍存。細胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在5%CO2,37℃，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),細胞呈貼壁生長,用%的胰酶和%EDTA(1∶1)消化傳代，用于實驗的細胞均處于指數(shù)生長期。

細胞體外生長活性的檢測

取指數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞,用%胰蛋白酶消化，以1×104/孔的密度接種于96孔板，每孔設(shè)3個復(fù)孔，以不含細胞的培養(yǎng)液做空白對照。貼壁后，加入不同濃度的吉西他濱,按常規(guī)方法操作后，用酶聯(lián)免疫儀測490nm處的吸光度值。

流式細胞儀分析細胞周期

各組藥物處理細胞72h后，進行細胞消化，收集所有懸浮細胞。調(diào)整細胞密度為5×105～1×106個/ml,取1ml細胞，1000r/min離心5min，去培養(yǎng)基。細胞收集后，加入70%乙醇置于-20℃冰箱固定過夜,PBS洗兩遍。依次加入50μg/ml碘化丙啶和1mg/mlRNaseA,室溫避光染色30min后上機檢測。

AnnexinVPI雙標記法分析細胞凋亡率

如上法收集藥物處理72h后的細胞，按試劑盒操作說明書操作后，上流式細胞儀檢測。采用CELIQUEST軟件分析早期細胞凋亡率。

TUNEL法

制作不同濃度不同時間作用后的細胞爬片,按試劑盒操作說明書操作。

bcl2癌基因產(chǎn)物表達檢測

將各實驗組和對照組在不同藥物濃度下分別培養(yǎng)24h,48h,72h后，制成蓋玻片培養(yǎng)細胞標本，按SP試劑盒說明書操作，用圖像分析儀進行分析。

統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以±s表示，用t檢驗分析差異顯著性，采用Pearson相關(guān)分析進行相關(guān)檢驗，運用統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

吉西他濱對A549細胞生長增殖能力的影響

吉西他濱不同濃度對細胞的抑制率可按公式計算:腫瘤細胞的生長抑制率(%)=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%,可見各濃度組對A549細胞均有抑制作用，呈時間、劑量依賴性，差異有顯著性(），見圖1。

圖1吉西他濱對人小細胞肺癌細胞A549生長抑制作用

吉西他濱對A549細胞周期的影響

在藥物作用72h，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細胞比例不斷增高，處于S期細胞比例降低，對細胞周期有明顯影響，將細胞阻滯與G0/G1期，見表1。

表1不同濃度吉西他濱對A549細胞周期的影響

AnnexinVPI聯(lián)合雙染測凋亡率

結(jié)果顯示，作用72h后，各濃度吉西他濱處理的細胞的凋亡率分別為(±)%、(±)%、(±)%、(±)%、(±)%、(±)%相關(guān)性分析顯示藥物濃度與凋亡發(fā)生呈正相關(guān)，即隨著藥物濃度增加細胞凋亡增加。

TUNEL檢測

陰性組僅見藍灰色的凋亡陰性染色吉西他濱處理各濃度組可見核呈深棕黃著色的凋亡細胞呈小片或散在分布,細胞核碎裂、大小不一，提示處理后細胞發(fā)生特征性凋亡生化改變，見圖2。

bcl2的表達

通過免疫組化方法，DAB染色后，各組細胞漿中均可見顆粒樣分布深淺不一的棕黃色物質(zhì)。通過藥物處理前后細胞棕黃色物質(zhì)的平均吸光度分析，經(jīng)兩樣本均數(shù)比較的ｔ檢驗進行比較,Ｐ0.001,按α=0.05標準,說明吉西他濱處理后bcl2的表達下調(diào)具有顯著性差別。通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其表達與其凋亡率成負相關(guān)，見圖3。

3討論

吉西他濱是一種藥物前體，在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成磷酸化代謝物,才能發(fā)揮細胞毒作用。吉西他濱的藥物敏感性與體內(nèi)脫氧胞苷激酶水平有著正相關(guān)的關(guān)系[35]。吉西他濱被細胞攝入后,轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚源x物吉西他濱二磷酸酯或三磷酸酯，競爭性抑制DNA鏈的延長,導(dǎo)致DNA片段形成和細胞死亡。

我們研究了吉西他濱對于A549細胞增殖和凋亡的影響。MTT法示各濃度組對A549細胞增殖均有抑制作用，呈時間、劑量依賴性。通過PI染色的流式細胞測得細胞周期，如其藥理學特性，主要作用于Ｓ期,使細胞停滯于S期，對Ｇ2和Ｍ期無明顯作用[7,8]。通過雙標法，測得細胞的凋亡率為、%、%、%、%、%。

其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機理和途徑目前尚未完全明了，有研究報道Fas/FasL信號通道不介導(dǎo)吉西他濱誘導(dǎo)細胞凋亡。Chalfant等人研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱誘導(dǎo)細胞凋亡與神經(jīng)酰胺途徑有關(guān)，通過激活內(nèi)源性神經(jīng)酰胺，觸發(fā)Caspase3的激活，誘導(dǎo)caspase9和bclx的剪接變化。其介導(dǎo)的凋亡可被過表達的bcl2所抑制[10]。而bcl2介導(dǎo)的途徑是否參與吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡目前國內(nèi)外尚無明確的研究。bcl2蛋白過表達會提高細胞的存活率,相反將促進細胞凋亡。免疫組化方法染色后，采用t檢驗分析藥物作用前后兩者吸光度值，發(fā)現(xiàn)吉西他濱作用后，bcl2的表達下調(diào)，并通過相關(guān)分析得出其表達與其凋亡率為負相關(guān)。其表達下調(diào)可能通過阻斷Ｃａ２+,維持滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài),阻止凋亡的發(fā)生，也可能通過抑制Caspase3的激活,阻斷生理性或病理性刺激對細胞凋亡的誘導(dǎo)。

綜上所述，本研究表明吉西他濱可顯著地抑制非小細胞肺癌A549細胞的體外增殖，其機理可能與干擾細胞周期誘導(dǎo)，誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)，bcl2在此凋亡過程中有一定的作用。但其具體內(nèi)在機制目前尚不明了，還需要我們進一步研究和討論。

【參考文獻】

［1］MortensonMM,SchliemanMG,VirudachalamS,etoftheproteasomeinhibitorbortezomibaloneandincombinationwithchemotherapyintheA549nonsmallcelllungcancercellline[J].CancerChemotherPharmacol，2004,54(4):343353.

DongM,LinC,FengFY,etal.DevelopmentandcharacterizationofagemcitabineresistantvariantofhumanlungadenocarcinomacelllineA549[J].AiZheng，2004,23(6):667671.

BeausejourCM,GagnonJ,PrimeauM,etactivitityof2‘,2‘difluorodeoxycytidine,5aza2‘deoxycytidineandcytosinearabinosideincellstransducedwithdeoxycytidinekinasegeneBiochemBiophysResCommun[J].2002,293(5):14781484．

GiovannettiE，MeyV,DanesiR,etal.Interactionbetweengemcitabineandtopotecaninhumannonsmallcelllungcancercells:effectsoncellsurvival,cellcycleandpharmacogeneticprofile[J].BrJCancer，2005,92(4):681689．

KroepJR,LovesWJ,VanderWiltCL,etal.PretreatmentDeoxycytidineKinaseLevelsPredictinVivoGemcitabineSensitivity[J].MolecularCancerTherapeutics，2002,1(6):371376.

尤長宣,羅榮城.治療非小細胞肺癌的新藥吉西他濱［J］.國外醫(yī)學腫瘤學分冊,2000,27(5):309311．

JohnLTonkinson,JohnFWorzalla,ChiHseTeng，etal.CellCycleModulationbyaMultitargetedAntifolate,LY231514,IncreasestheCytotoxicityandAntitumorActivityofGemcitabineinHT29ColonCarcinoma[J].CancerResearch1999,59(15):36713676．

SerranoMJ,SanchezRoviraP,AlagarraI,etal.Evaluationofagemcitabinedoxorubicinpaclitaxelcombinationschedulethroughflowcytometryassessmentofapoptosisextentinducedinhumanbreastcancercelllines[J].CancerResearch，2002,93(5):559566.

RJBold,JChandra,DJMcConkey,etal.Gemcitabineinducedprogrammedcelldeath(apoptosis)ofhumanpancreaticcarcinomaisdeterminedbyBcl2content[J].