染料木黃酮與順鉑聯(lián)用對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV

染料木黃酮與順鉑聯(lián)用對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV【摘要】目的：探討染料木黃酮與順鉑聯(lián)用對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞系SKOV3增殖與凋亡的影響.方法：采用MTT比色法檢測(cè)染料木黃酮和順鉑聯(lián)用對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響，Hoechst染色熒光顯微鏡下觀察聯(lián)合用藥后細(xì)胞形態(tài)的改變，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期并檢測(cè)凋亡率.結(jié)果：聯(lián)用不同濃度的染料木黃酮后順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞IC50降低率為%~%,兩藥聯(lián)合作用系數(shù)在~之間，為輕度至高度協(xié)同作用.染料木黃酮與順鉑聯(lián)用可顯著提高凋亡率，兩藥聯(lián)用誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡和阻滯G2/M期、干擾S期進(jìn)程，凋亡率與G1期細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān).結(jié)論:染料木黃酮可以增強(qiáng)順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用和殺傷作用，兩種藥物具有協(xié)同作用.染料木黃酮阻滯細(xì)胞于G2/M期并同時(shí)干擾S期進(jìn)程可能是兩藥發(fā)揮協(xié)同作用的重要機(jī)制.

【關(guān)鍵詞】染料木黃酮；順鉑；卵巢腫瘤；藥物協(xié)同作用

0引言

近年來(lái)染料木黃酮對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用日益受到重視，尤其是它可以增強(qiáng)常規(guī)化療藥物的療效［1-2］.而染料木黃酮和傳統(tǒng)化療藥物順鉑聯(lián)用能否增強(qiáng)順鉑對(duì)耐藥卵巢癌的殺傷作用呢？為此，我們研究了染料木黃酮與順鉑聯(lián)用對(duì)耐藥卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制.

1材料和方法

材料

人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV3由西京醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室保存，該細(xì)胞系對(duì)順鉑等多種藥物耐藥；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；新生牛血清(四季青公司)；順鉑(齊魯制藥廠)；染料木黃酮、二甲基亞砜,Hoechst33342(Sigma公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Amresco公司).細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒為DNAPrepStainkit(BeckmanCoulter公司)；WellscanMK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(LabsystemsDragon公司)；ELITEESP型流式細(xì)胞儀.

方法

法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，8×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，然后加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基200μL：對(duì)照組只加RPMI1640培養(yǎng)基(100mL/L小牛血清)；順鉑組加入順鉑濃度分別為，，，5，10，20mg/L的培養(yǎng)基；染料木黃酮組加入染料木黃酮濃度分別為，5，10，20，30，40，50mg/L的培養(yǎng)基；染料木黃酮和順鉑聯(lián)用組為，5，10，20mg/L的染料木黃酮與順鉑聯(lián)用，順鉑濃度同單藥組，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔.繼續(xù)培養(yǎng)至加藥后96h，每孔加入MTT(5g/L,20μL),繼續(xù)孵育4h后棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μL，振蕩10min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光值(A490nm)，按以下公式計(jì)算：細(xì)胞增殖抑制率=/對(duì)照組A490nm×100%，取6復(fù)孔均值繪制抑制率與藥物劑量關(guān)系曲線，按作圖法求出半數(shù)抑制濃度.同時(shí)采用聯(lián)合作用指數(shù)(combinedindex，CI)判斷染料木黃酮和順鉑聯(lián)用的性質(zhì).CI=DA／ICX,A+DB／ICX,B(A，B代表兩種不同藥物，ICX,A和ICX,B是兩種藥物單獨(dú)使用使生長(zhǎng)抑制率達(dá)X時(shí)的藥物濃度，DA和DB是兩藥聯(lián)用使生長(zhǎng)抑制率達(dá)X時(shí)兩種藥物的濃度)［3］.根據(jù)Soriano等［4］的判斷方法，≤CI≤為疊加作用，≤為低度協(xié)同作用，≤為中度協(xié)同作用，≤為高度協(xié)同作用，≤為強(qiáng)協(xié)同作用.

熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)的改變接種SKOV3細(xì)胞于蓋玻片，置于六孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后加入不同藥物，根據(jù)MTT結(jié)果分為4組：即對(duì)照，順鉑，染料木黃酮和染料木黃酮+順鉑.繼續(xù)培養(yǎng)36h，固定后加入mLHoechst33342，染色15min后棄染液清洗，抗熒光淬滅液封片，紫外光激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察.

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的變化收集SKOV3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，以每瓶8mL接種于75mL培養(yǎng)瓶，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基.根據(jù)MTT結(jié)果，順鉑濃度選mg/L,染料木黃酮濃度選5和10mg/L，設(shè)對(duì)照、單藥和聯(lián)用共6組.加藥36h后收集細(xì)胞，分別按DNAPrepStainKit試劑盒和ApoptosisDetectionKit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞固定、染色，上流式細(xì)胞儀分析.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：SPSS軟件進(jìn)行秩相關(guān)分析.

2結(jié)果

染料木黃酮與順鉑聯(lián)用對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響染料木黃酮、順鉑單藥的IC50分別為mg/L和mg/L，4種不同濃度的染料木黃酮與順鉑聯(lián)用后順鉑的IC50明顯降低，與單用順鉑組比較，4種不同濃度的染料木黃酮可使順鉑的IC50分別降低到，，和mg/L.當(dāng)達(dá)到半數(shù)抑制時(shí)，不同濃度組合的染料木黃酮與順鉑的CI分別為，，，其中10和5mg/L染料木黃酮與順鉑聯(lián)用達(dá)到高度協(xié)同作用；mg/L和mg/L染料木黃酮與順鉑聯(lián)用分別達(dá)到低、中度協(xié)同作用.

染料木黃酮與順鉑聯(lián)用后SKOV3細(xì)胞形態(tài)的改變對(duì)照組細(xì)胞核均勻淡染，界限清楚，呈正常結(jié)構(gòu)(圖2A)；順鉑組與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖2B)；染料木黃酮組可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞(圖2C)；聯(lián)用組出現(xiàn)大量典型的凋亡細(xì)胞：細(xì)胞核染色明顯增強(qiáng)，熒光更為明亮，強(qiáng)度深淺不一，并可見(jiàn)濃染致密的染色質(zhì)凝集，呈顆粒狀、固縮狀或團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu).

染料木黃酮、順鉑單藥及聯(lián)用對(duì)SKOV3細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響對(duì)照組絕大多數(shù)細(xì)胞處于DNA合成前期，G1期細(xì)胞比例高，S期和G2期細(xì)胞較少，凋亡率很低；mg/L順鉑組對(duì)SKOV3細(xì)胞周期和凋亡率無(wú)明顯影響；5和10mg/L染料木黃酮組均成倍升高G2/M期細(xì)胞比例并增加凋亡率，10mg/L染料木黃酮還進(jìn)一步的升高了S期細(xì)胞比例；mg/L順鉑+5mg/L染料木黃酮和mg/L順鉑+10mg/L染料木黃酮組可使G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡得到顯著加強(qiáng).各組SKOV3細(xì)胞G1期比例隨著不同濃度染料木黃酮與順鉑的處理而改變，經(jīng)直線相關(guān)分析，表明細(xì)胞凋亡和G1期細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，與G2/M期+S期的細(xì)胞比例成正相關(guān).表1不同濃度染料木黃酮與順鉑誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞周期和凋亡率的改變(略)

3討論

鉑類藥物是卵巢癌聯(lián)合化療方案中最常用的藥物，而卵巢癌對(duì)鉑類藥物的耐藥性及其毒副作用常常導(dǎo)致化療方案難以奏效.近年來(lái)研究表明染料木黃酮具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡的作用，可以增強(qiáng)前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，提高化療的效果，而且可以在不降低療效的前提下減少化療藥物用量，從而減輕化療的毒副反應(yīng)［1-2］.那么染料木黃酮能否增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物順鉑對(duì)耐藥卵巢癌的療效呢？在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)SKOV3細(xì)胞明顯對(duì)順鉑耐藥，其IC50達(dá)到mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出順鉑的血漿峰值濃度，而染料木黃酮與順鉑聯(lián)用時(shí)則表現(xiàn)出不同程度的協(xié)同作用，可明顯降低順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的IC50，10mg/L濃度以上的染料木黃酮可將順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的IC50降至血漿峰值濃度以下，兩藥聯(lián)用也顯著的提高了凋亡率.采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以發(fā)現(xiàn)血漿峰值濃度的順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞幾乎沒(méi)有什么影響，而與染料木黃酮聯(lián)用時(shí)可誘導(dǎo)出大量凋亡.

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示周期阻滯和細(xì)胞凋亡是染料木黃酮與順鉑發(fā)揮協(xié)同作用的重要機(jī)制，而且兩藥協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與周期阻滯是有聯(lián)系的.凋亡率與G1期比例呈負(fù)相關(guān),間接的表明染料木黃酮與順鉑聯(lián)用誘導(dǎo)凋亡和阻滯G2/M期和干擾S期進(jìn)程有關(guān).染料木黃酮可將SKOV3細(xì)胞阻滯于G2/M期，并誘導(dǎo)一定程度的細(xì)胞凋亡，而G2/M期正是順鉑誘導(dǎo)凋亡的重要時(shí)期［5］，兩者在這方面的一致性可能是它們發(fā)揮協(xié)同作用的基礎(chǔ).在我們的結(jié)果中，10mg/L染料木黃酮可進(jìn)一步地將一部分細(xì)胞阻滯于S期.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)5，10mg/L染料木黃酮聯(lián)合順鉑作用時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例相近，但凋亡率卻差別甚遠(yuǎn)，提示兩種濃度的染料木黃酮對(duì)S期干擾程度的不同可能是造成凋亡率差異的原因.S期即DNA合成期，核苷酸雙鏈在S期分離，對(duì)外界環(huán)境非常敏感，更易于被腫瘤化療藥物所殺傷，干擾S期進(jìn)程理論上應(yīng)該會(huì)增加凋亡率.Kolfschoten等［6］采用順鉑加阿霉素化療方案治療15例包含不同組織學(xué)類型的卵巢癌移植瘤裸鼠，發(fā)現(xiàn)順鉑不敏感裸鼠S期腫瘤細(xì)胞比例較低，而S期腫瘤細(xì)胞比例較高的裸鼠對(duì)順鉑敏感性較強(qiáng)，順鉑敏感性與S期細(xì)胞比例成正相關(guān).高濃度的染料木黃酮可干擾S期進(jìn)程可能是其與順鉑發(fā)揮協(xié)同作用的另外一個(gè)重要機(jī)制.

我們的研究表明，染料木黃酮和順鉑可協(xié)同抑制耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖、促進(jìn)其凋亡，這對(duì)強(qiáng)化常規(guī)化療的效果、減輕化療的毒副作用是非常有意義的.其作用機(jī)制可能與染料木黃酮干擾細(xì)胞周期，從而增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性有關(guān).染料木黃酮增強(qiáng)順鉑對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV3的殺傷作用的分子機(jī)制還有待探討.

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