動物基因工程

動物基因工程第一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

動物基因工程是利用DNA重組技術(shù)對動物所進(jìn)行的工程操作。從遺傳學(xué)角度分為：遺傳性動物基因工程：外源基因能夠通過配子進(jìn)行垂直傳遞并穩(wěn)定的遺傳。非遺傳性動物基因工程：轉(zhuǎn)基因僅在當(dāng)代表現(xiàn)，不能夠遺傳給子代。第二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)動物基因工程的發(fā)展?fàn)顩r與趨勢動物基因工程的實(shí)質(zhì)是改變動物的遺傳組成，增加動物的遺傳多樣性，賦予轉(zhuǎn)基因動物新的表型特征，使能夠更好地服務(wù)與人類社會。第三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日世界首只轉(zhuǎn)基因靈長類動物

——-安迪世界第一只轉(zhuǎn)基因動物第五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日HBV轉(zhuǎn)基因動物樹鼩第七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

從轉(zhuǎn)基因的技術(shù)手段來看，除DNA顯微注射法外，人們先后試過反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)法、精子介導(dǎo)法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法和核移植法等多種轉(zhuǎn)基因方法。

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的核移植技術(shù)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的主流方法。1、從簡單的顯微注射法向高效率的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植方向發(fā)展

第八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

轉(zhuǎn)基因在基因組中的存在方式有兩種，即隨機(jī)整合和定點(diǎn)整合。為了達(dá)到外源基因的高效表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)上增加了含有位點(diǎn)控制區(qū)（LCR）、核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)等調(diào)控元件，可以實(shí)現(xiàn)插入位點(diǎn)非依賴性、拷貝數(shù)相關(guān)的表達(dá)模式。LCR和MAR的功能不受種屬差異的限制，無論外源基因插入什么位點(diǎn)，都能夠維持一個開放的染色體結(jié)構(gòu)，有利于基因的表達(dá)。基因打靶技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了對目的基因的定位操作。2、從外源基因隨機(jī)插入（或整合）到定點(diǎn)整合的轉(zhuǎn)變

第九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

從轉(zhuǎn)基因的策略來看，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了兩個階段：第一階段為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動物階段，第二階段為條件性轉(zhuǎn)基因動物階段。借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將單一的功能基因和基因簇引入高等動物的基因組，或?qū)⒛康幕驈膭游锘蚪M中敲除，實(shí)現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間基因轉(zhuǎn)移或修飾，產(chǎn)生新的基因型和表型。目前轉(zhuǎn)基因動物主要應(yīng)用在生物學(xué)基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)疾病模型、動物生物反應(yīng)器、異種器官移植、動物遺傳改良等５個方面。３、從傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因到條件控制的轉(zhuǎn)變第十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)一、動物基因工程載體二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)第十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日一、動物基因工程載體作為動物基因工程載體必須具備以下幾個功能：

為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力為外源基因提供在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或整合的能力為外源基因提供在受體細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增和表達(dá)能力第十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日動物基因工程載體質(zhì)粒型表達(dá)載體病毒載體定向打靶載體第十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日1.質(zhì)粒型表達(dá)載體表達(dá)載體的共同特點(diǎn)是都帶有原核復(fù)制區(qū)和選擇性標(biāo)記基因，保證重組DNA分子能夠在大腸桿菌中擴(kuò)增，同時也必須包括能在真核細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)組件。一般包括轉(zhuǎn)錄外源DNA序列的啟動元件、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信號序列、真核細(xì)胞中的選擇性標(biāo)記，另外還增加了一些附加元件，如增強(qiáng)子、內(nèi)含子、剪接供體與受點(diǎn)，以保證外源基因的高效表達(dá)。第十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日以山羊乳腺特性表達(dá)載體pBC1為例第十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2.病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移的病毒載體須具備以下基本條件：攜帶外源基因并能夠包裝成病毒顆粒介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移與表達(dá)對機(jī)體不致病第十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（1）腺病毒（adenovirus）

腺病毒作為轉(zhuǎn)染載體有許多特點(diǎn)：基因組的重排率低外源基因與病毒DNA重組后能遺傳幾個周期安全性好，不會整合到人的染色體上，不導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生宿主范圍廣，對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不高外源基因在載體上容易高效表達(dá)第十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（2）腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus,AAV）腺相關(guān)病毒是一種天然復(fù)制缺陷型非致病性單鏈DNA病毒，其復(fù)制需要有輔助病毒的共轉(zhuǎn)染。無共轉(zhuǎn)染時，野生型AAV優(yōu)先（70%）整合在人染色體的19q13.3位點(diǎn)處，潛伏存在直至被輔助病毒拯救出來。其整合需要基因組兩端的ITR，以及非結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白Rep78和Rep68的存在。

第十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日AAV具有以下幾個方面特點(diǎn)：非致病性、無免疫原性和無炎癥反應(yīng)能感染靜止期的細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞插入的外源基因表達(dá)時間長，一般能夠達(dá)到1年之多宿主范圍廣熱穩(wěn)定性強(qiáng)，容易通過滅活輔助腺病毒純化第十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（3）反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒是一種整合型單鏈RNA病毒，感染宿主細(xì)胞后，病毒顆粒中的pol基因表達(dá)出反轉(zhuǎn)錄酶，以單鏈的RNA基因組為模板，立即轉(zhuǎn)錄出一份線形雙鏈DNA復(fù)本，然后在整合酶（Int）介導(dǎo)下，整合到宿主的基因組內(nèi)，此時整和的病毒序列被稱為前病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合到宿主細(xì)胞基因組后，其DNA隨宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制，并由5`-LTR中的一個強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄出病毒RNA鏈，它既是病毒基因組，同時又具有mRNA模板活性，翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白和反轉(zhuǎn)錄酶。在宿主細(xì)胞質(zhì)中，兩條相同的RNA鏈和反轉(zhuǎn)錄酶被包裝與內(nèi)殼中，形成的成熟病毒顆粒以芽植方式分泌至細(xì)胞外，但通常不致死宿主細(xì)胞。第二十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日3.定向打靶載體基因打靶是通過外源基因與靶細(xì)胞染色體上的同源序列間的同源重組，將外源基因定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞特定位置上，而使某一個特定位點(diǎn)上的基因發(fā)生定點(diǎn)突變的技術(shù)。在細(xì)胞內(nèi)存在兩條相同的DNA鏈（同源染色體），在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下，可以將其切開，發(fā)生交叉，然后重新連接，從而發(fā)生DNA鏈的交換并引發(fā)重組。第二十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（1）基因敲除敲除型載體由兩段與基因組內(nèi)靶基因座序列同源的DNA片段（又稱同源臂）組成，中間為正向選擇標(biāo)記，同緣臂外側(cè)為真核細(xì)胞中的負(fù)選擇標(biāo)記及在原核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與篩選的載體DNA序列。第二十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（2）基因敲入基因敲入是利用同源重組原理將外源基因插入到染色體的特定位點(diǎn)上。基因敲入的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上相似于基因敲除結(jié)構(gòu)，但區(qū)別在于：

或用外源基因替換并失活靶基因或在不影響拔基因功能的前提下插入新的基因或在染色體上特定位點(diǎn)插入新的外源基因，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，并使得外源基因高效表達(dá)第二十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（3）基因下調(diào)（knock-down）

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）又被稱為基因下調(diào)，通過干擾RNA（smallinterferencesiRNA）分子的作用達(dá)到轉(zhuǎn)錄后基因沉默的效應(yīng)。

siRNA的制備方法主要包括體外合成siRNA和siRNA表達(dá)載體兩種。體外合成的siRNA易轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后，可直接發(fā)揮作用，一般不存在siRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄效率低及細(xì)胞毒性等問題。但是體外合成的siRNA只能瞬間干擾，不能達(dá)到長久抑制病毒的效果。

第二十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

物理轉(zhuǎn)染法

化學(xué)轉(zhuǎn)染法

生物法第二十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日1.物理轉(zhuǎn)染法（1）電擊法（electroporation）其基本原理是在外加電場的作用下，細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，細(xì)胞質(zhì)膜瞬間出現(xiàn)可逆性的電穿孔，從而使一定數(shù)量的外源DNA從細(xì)胞外擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，并進(jìn)一步整合到宿主DNA上，達(dá)到轉(zhuǎn)基因目的。第二十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日圖1.利用點(diǎn)穿孔法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移第二十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（2）顯微注射法

是將外源DNA在顯微鏡操作系統(tǒng)的輔助下，通過玻璃微管直接將外源DNA注入哺乳動物受精卵的原核內(nèi)，使外源基因整合到基因組上，制備轉(zhuǎn)基因動物。第二十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（3）基因槍法

基本原理是將要轉(zhuǎn)染的DNA吸附到高黏度的金屬（鈣或金等）顆粒上，在一種加速裝置的作用下，將這些粒子高速打入細(xì)胞或組織內(nèi)，達(dá)到轉(zhuǎn)基因目的第二十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（4）超聲波法（sonoporation）

超聲波增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染法的主要機(jī)制是聲波的空化效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞的通透性增高，而通過添加超生造影劑能降低空化域值，增強(qiáng)空化效應(yīng)，促進(jìn)外源基因進(jìn)入細(xì)胞，提高基因的轉(zhuǎn)染效果第三十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2.化學(xué)轉(zhuǎn)染法（1）磷酸鈣法

將待轉(zhuǎn)染的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2后，DNA片段與磷酸鈣共沉淀并形成大的顆粒；將此顆粒懸浮液加入貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中，外源DNA就被靶細(xì)胞所吸收，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因。 第三十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日圖2.利用磷酸鈣共沉淀法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染第三十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日圖3.質(zhì)脂體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（2）脂質(zhì)體法（lipofection）將待轉(zhuǎn)染的DNA溶液與磷脂混合，后者在表面活性劑存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。當(dāng)這種脂質(zhì)體懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會與受體細(xì)胞膜發(fā)生融合，DNA片段隨即進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)。第三十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（3）原生質(zhì)體融合法

含有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母細(xì)胞。大量擴(kuò)增，利用溶菌酶或蝸牛酶去除胞壁部分，在高鹽條件下制成原生質(zhì)體，然后散鋪在單層培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞上，在融和劑（如聚乙二醇）作用下，使染色體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)如細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因第三十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

構(gòu)建含有選擇性標(biāo)記的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組部分DNA與質(zhì)粒的雜合型載體分子，在多克隆位點(diǎn)插入外源基因形成重組DNA分子，克隆到大腸桿菌中擴(kuò)增鑒定；重組DBA分子通過物理或化學(xué)方法轉(zhuǎn)入一個特制的病毒包裝細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系的重組DNA轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的重組RNA分子，包裝細(xì)胞系分泌出來的重組反轉(zhuǎn)錄病毒，便可感染其他類型動物受體細(xì)胞，重組RNA分子以DNA形式整合到染色體上，并表達(dá)外源基因。3.病毒感染法

第三十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

圖4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體穩(wěn)定、長期表達(dá)外源基因

原病毒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞中，包裝原病毒產(chǎn)生將病毒RNA包裝成感染性病毒粒子的所有蛋白質(zhì)，但卻不能包裝自身的RNA第三十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動物制備轉(zhuǎn)基因動物的制備程序轉(zhuǎn)基因鑒定表達(dá)水平的檢測轉(zhuǎn)基因動物傳代與檢測第三十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日一轉(zhuǎn)基因動物的制備程序DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛第三十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日1、DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠超數(shù)排卵

基因制備

胚胎移植顯微注射

轉(zhuǎn)基因個體的鑒定

第三十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第四十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日顯微注射技術(shù)第四十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2、胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠

胚胎干細(xì)胞是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的未分化、具有正常二倍體染色體和發(fā)育全能性的細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：

可以在體外進(jìn)行人工培養(yǎng)、長期擴(kuò)增、冷凍保存第四十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日胚胎干細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動物過程（1）轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞的獲得（2）囊胚注射（3）嵌合體的檢測和育種

轉(zhuǎn)基因嵌合個體的制備目的是為了獲得轉(zhuǎn)基因后代第四十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日胚胎干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化法(引自G1ick&Pasternak，1998)第四十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日判斷是否是種系嵌合

首先用轉(zhuǎn)基因嵌合體的小鼠與正常的小鼠交配，對其后代進(jìn)行檢測，如果后代中有轉(zhuǎn)基因個體出現(xiàn)，證明為種系嵌合，然后將轉(zhuǎn)基因雜合子個體進(jìn)行橫交就會獲得轉(zhuǎn)基因純合子和雜合子個體。如果在后代中沒能發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因純合子，應(yīng)注意是否因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的純合造成了胚胎的早期死亡，無法得到成活個體所致。第四十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日基因的準(zhǔn)備供體細(xì)胞獲取傳代培養(yǎng)、擴(kuò)增供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因

轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞的篩選與擴(kuò)增卵母細(xì)胞的獲得體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞的去核核移植重構(gòu)胚體外培養(yǎng)胚胎移植獲得轉(zhuǎn)基因個體3、轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛第四十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日二轉(zhuǎn)基因鑒定標(biāo)記篩選法（1）正負(fù)選擇標(biāo)記篩選法（2）無啟動子篩選法利用靶基因上的啟動子來轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的mRNA并翻譯出特定的蛋白質(zhì)，而達(dá)到篩選的目的。分子鑒定法（1）PCR擴(kuò)增（2）斑點(diǎn)雜交（3）Southern雜交（4）熒光原位雜交第四十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日三表達(dá)水平的檢測獲得高效表達(dá)、具有較強(qiáng)生物學(xué)活性的目的是蛋白是轉(zhuǎn)基因的主要目的之一。得到的目的蛋白的的形式：

表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)，可通過對組織或細(xì)胞裂解獲?。环置诘郊?xì)胞外，可通過酶學(xué)或免疫學(xué)方法進(jìn)行測定。第四十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日1、報(bào)告基因

報(bào)告基因是編碼容易檢測的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，一般用以替換難于測定的蛋白質(zhì)基因，或制備融合蛋白，或利用IRES與目的蛋白形成一條mRNA序列，分別翻譯出兩種蛋白，來研究目的蛋白的功能及其表達(dá)特性。第四十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2、Northern雜交可以檢測轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否轉(zhuǎn)錄出目的基因所對應(yīng)的mRNA3、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是將由mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行目的基因或片斷擴(kuò)增的PCR反應(yīng)。利用RT-PCR方法擴(kuò)增出目的基因的電泳條帶，以檢測目的基因是否表達(dá)。第五十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日4、聚丙烯酰胺凝膠電泳分析靶組織或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的總蛋白，依據(jù)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)判定是否有目的蛋白條帶出現(xiàn)，進(jìn)而判定外源基因的表達(dá)情況，同時可以初步判定目的蛋白的表達(dá)水平。5、Western雜交

可用來檢測混合蛋白質(zhì)樣品中是否存在目的蛋白，最小檢出量為1ng。6、目的蛋白的生物活性

應(yīng)選擇相應(yīng)的生物學(xué)測定方法進(jìn)行測定。當(dāng)產(chǎn)品生物學(xué)活性較天然蛋白活性低時，應(yīng)當(dāng)對蛋白質(zhì)結(jié)合的功能分子集團(tuán)進(jìn)行研究。第五十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日四轉(zhuǎn)基因動物傳代與檢測判斷是否生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因動物的重要標(biāo)準(zhǔn)是檢查外源基因是否整合到動物的生殖系統(tǒng)中，即是否能夠穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)基因動物傳代常用常規(guī)繁殖方法進(jìn)行，如有必要，也可采用特殊的方法。一般用轉(zhuǎn)基因檢測陽性動物與已知的非轉(zhuǎn)基因動物交配，這樣做可以較好的度量被整合的外源基因的傳遞規(guī)律。

第五十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用與未來一、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用二、轉(zhuǎn)基因動物的生物安全性三.動物轉(zhuǎn)基因的未來第五十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日一、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用

提高動物的生產(chǎn)性能（1）改良畜禽生產(chǎn)性狀

在轉(zhuǎn)基因“碩鼠”的啟發(fā)下，人們試圖通過外源基因的導(dǎo)入提高畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量，加快生長速度，減少飼料消耗和改良產(chǎn)品品質(zhì)。（2）提高畜禽抗病力

傳染病的流行以及動物源性人畜共患病的爆發(fā)，已對畜牧生產(chǎn)和人類生活產(chǎn)生了巨大的影響。第五十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日轉(zhuǎn)基因“碩鼠”（右）第五十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)基因牛轉(zhuǎn)基因豬第五十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2.動物生物反應(yīng)器

轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)引導(dǎo)人們試圖把轉(zhuǎn)基因動物作為一種生物反映器，生產(chǎn)人