CLA對2型糖尿病大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性及氧化應激的影響

CLA對2型糖尿病大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性及氧化應激的影響

作者：徐文，海春旭，楊晨，李嘉琳，王鵬

【關鍵詞】實驗二型糖尿病

Effectofconjugatedlinoleicacidsonhepaticoxidativestressandhepaticmitochondrialrespiratorychainenzymeactivitiesintype2diabeticrats

【Abstract】AIM:Toobservetheeffectofconjugatedlinoleicacidsonhepaticoxidativestressandenzymeactivitiesofhepaticmitochondrialrespiratorychainintype2diabetic(DM2)rats.METHODS:Sixtyratswererandomlydividedinto3groups:controlgroup,diabetic(DM)groupandconjugatedlinoleicacids(CLA)treatmentgroup.DM2ratmodelwasinducedbyfeedsofhighersugar,fatandcholesterolwiththeinjectionofstreptozotocin.Bloodglucosewasdeterminedbyabloodglucosetestinginstrumentandseruminsulinbyaradioimmunologicalmethod.Thecontentsofmalondialdehyde(MDA),reducedglutathioneandtheactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andcatalase(CAT)inhepatictissuesweretestedbybiochemicalmethods.TheenzymeactivitiesofhepaticmitochondrialrespiratorychainweremeasuredbyClarkoxygenelectrode.RESULTS:Comparedwiththoseincontrolgroup,thebloodglucose,seruminsulinandMDAinliverincreasedsignificantly()andGSHcontent,activitiesofSOD,andCATaswellasmitochondrialrespiratorychainenzymesinthehepatictissuesdecreasedremarkably()intheDMgroup.InCLAtreatmentgroup,theindexesaboveamelioratedtodifferentdegreeandthesechangeswereinadosedependentmanner.CONCLUSION:CLAamelioratestheenergymetabolismimpairmentofDMliverbysuppressingtheoxidativestressandimprovingtheactivityofenzymesinmitochondrialrespiratorychain,andCLAhaseffectiveprotectionfromtheoxidativeinjuryinducedbyDM.

【Keywords】conjugatedlinoleicacids;type2diabetes;respiratorychainenzymes；oxidativestress

【摘要】目的：觀察共軛亞油酸(CLA)對2型糖尿病(DM2)大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性及肝內(nèi)氧化應激的影響.方法：將60只SD大鼠隨機分為陰性對照組，DM組和CLA治療組.高糖、高脂及高膽固醇飼料誘導胰島抵抗聯(lián)合ip鏈脲佐菌素建立大鼠DM2模型.血糖儀檢測血糖濃度，放免法檢測血清胰島素水平，生化法測定肝組織丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性，Clark氧電極法觀察大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性.結果：成功誘導大鼠DM2模型，與對照組比，DM組大鼠血糖濃度、血清胰島素水平、肝臟MDA含量明顯升高()，同時肝臟線粒體呼吸鏈酶活性以及抗氧化酶活性(SOD，CAT)及GSH顯著降低()，與DM組相比，CLA治療組大鼠以上各項指標均有改善，并存在一定的劑量效應關系.結論：CLA通過抑制氧化應激增強大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性改善了DM大鼠肝臟的能量代謝障礙，對DM引起的氧化損傷有保護作用.

【關鍵詞】共軛亞油酸；實驗二型糖尿病；呼吸酶；氧化應激

0引言

共軛亞油酸是天然存在具有共軛不飽和雙鍵的脂肪酸，具有抑制腫瘤的形成、調(diào)節(jié)脂肪代謝、抗動脈粥樣硬化、改善免疫功能、降低膽固醇、促進生長等多種生物活性.提高胰島素對骨骼肌的作用［1］.2型糖尿病是一種以氧化應激為特征的病變，其線粒體氧化磷酸化能力受到損害，只有正常人的55％［2］.CLA對DM2線粒體呼吸酶活性影響研究尚未見報道.我們使用高糖、高脂及高膽固醇飼料誘導胰島抵抗聯(lián)合ip鏈脲菌素建立大鼠DM2模型，觀察CLA對DM2大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性及氧化應激的影響，探討CLA在預防和治療DM方面可能存在的機制和應用前景.

1材料和方法

材料

雄性二級SD大鼠60只，體質(zhì)量g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供.共軛亞油酸(順9位、反11位CLA，%；反10位、順12位CLA，%；C18:1,%；C18:0，%)，由青島澳海生物有限公司提供.硫代巴比妥酸、丙二醛標準品系Merk公司產(chǎn)品；磷鎢酸、牛血清白蛋白由Boehringer公司分裝；鹽酸羥胺由天津化學試劑一廠生產(chǎn)；NBT、苯二醛OPT(Ophenaldehyde)購自華美公司；GSH標準、TritonX100由上?；瘜W試劑有限公司提供；鏈脲菌素購自Sigma公司；胰島素放免試劑盒；血糖儀；UV3000雙波長雙光束分光光度計；722型光柵分光光度計；CPS1A超聲粉碎儀；GL20A全自動高速冷凍離心機；SP2溶氧測定儀；SHZ881臺式水浴恒溫震蕩器.

方法

將動物隨機分為陰性對照組、DM組、CLA治療組，其中CLA治療組又分為3個不同劑量組.陰性對照組給予普食，DM組、CLA治療組給予高糖高脂飲食(普通飼料加200g/kg蔗糖、100g/kg豬油、50g/kg膽固醇)，喂養(yǎng)4wk后將大鼠空腹8h后自尾靜脈取血，測空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)，血清胰島素水平(seruminsulinlevel,SIL)，計算胰島素敏感性指數(shù)［ISI=In(1/FBG×SIL)］確定產(chǎn)生胰島抵抗，一次性30mg/kg鏈脲菌素(STZ)ip，1wk后測禁食血糖，以禁食血糖≥16mmol/L伴胰島素抵抗為標準判定DM2大鼠模型成功［3］.成模后對CLA治療組每日固定時間以，和g/kgCLA灌胃,陰性對照組和DM組給予相同劑量的生理鹽水灌胃，共4wk.第9周末處死大鼠，取血分離血清，取肝臟一部分用生理鹽水制成200g/L的組織勻漿、1000r/min離心10min，取上清測定MDA，GSH含量和SOD，CAT的活性以及總蛋白的含量，一部分肝組織用來分離提取線粒體，測定線粒體呼吸鏈酶活性.造模期間在大鼠空腹8h后自尾靜脈取血，測定血糖濃度及血清胰島素含量，計算ISI.MDA測定采用八木國夫熒光法;GSH測定采用熒光法;SOD測定采用改良的鹽酸羥胺法;CAT活性測定用改良比色法;線粒體呼吸鏈酶活性測定用Clark氧電極法［4］.按Kesavulu等［5］方法分離線粒體.Lowrys法測定線粒體懸液蛋白量，并根據(jù)肝組織質(zhì)量計算出每克肝組織的線粒體含量.分別測定3個氧化酶活性：①NADH氧化酶(NADHOX)：10mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH，2mmol/LNADH；②琥珀酸氧化酶(SUCOX)：80mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH，5mmol/L琥珀酸，5μmol/L魚藤酮；③細胞色素氧化酶(CYTOX)：10mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH，5mmol/L抗壞血酸，mmol/L四甲基對苯二胺，5μmol/L抗霉素A.

統(tǒng)計學處理：結果采用x±s表示，統(tǒng)計軟件SPSS，Tab1數(shù)據(jù)采用重復測量設計的方差分析，其余數(shù)據(jù)用OnewayANOVA進行分析，表示有顯著性差異.

2結果

DM模型組大鼠經(jīng)高糖高脂飲食1mo后血糖較對照組有不同程度的升高，血胰島素較對照組則有顯著升高.計算ISI，發(fā)現(xiàn)有胰島素敏感性降低，說明高糖高脂飲食已成功誘導出胰島素抵抗.注射STZ后1wk，各DM組血糖明顯上升()到DM標準，而血胰島素則下降至與Ａ組相當水平(Ｐ)，計算ISI，胰島素抵抗繼續(xù)存在(Ｐ)，表明成功誘導了大鼠DM2模型.實驗6，9wk末，單純DM組血糖仍保持在較高水平，而各組間血胰島素差異則無統(tǒng)計學意義，經(jīng)CLA治療后血糖降低，g/kgCLA治療4wk及g/kgCLA治療1wk降低血糖更好(Ｐ)，有劑量效應趨勢(Tab1).表1CLA治療后空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數(shù)

肝組織MDA,GSH水平及SOD,CAT活性CLA治療4wk后DM大鼠肝組織中MDA含量與對照組相比顯著升高，GSH，SOD，CAT的水平與對照組相比顯著降低，經(jīng)CLA治療后上述指標均有不同程度的改善，隨著CLA劑量增加，肝臟組織中MDA含量降低更顯著，使GSH，SOD和CAT的水平明顯升高，有劑量效應趨勢(Tab2).表2CLA治療4wkDM大鼠肝組織MDA,GSH及SOD,CAT的活性

肝組織線粒體呼吸鏈酶活性CLA治療4wk后DM大鼠肝組織線粒體呼吸鏈酶NADHOX，SUCOX及CYTOX活性顯著降低(Ｐ，Ｐ)，CLA治療后提高，其中g/kgCLA治療組對NADHOX，CYTOX活性有顯著提高(Ｐ)，對SUCOX的活性沒有明顯改變，g/kgCLA治療組對NADHOX，CYTOX活性有顯著提高(Ｐ)，對SUCOX的活性也沒有明顯改變，g/kgCLA治療組對NADHOX，CYTOX活性有顯著提高(Ｐ)，對SUCOX的活性也有明顯提高(Ｐ)，有劑量效應趨勢.值得注意的是g/kgCLA治療組使NADHOX，SUCOX和CYTOX活性基本恢復到正常對照組的水平(Tab3).表3CLA治療4wk后DM大鼠肝組織線粒體呼吸鏈酶活性

3討論

近年研究［5,6］發(fā)現(xiàn)DM動物及人體出現(xiàn)明顯的氧化損傷和自由基介導的過氧化作用，生物大分子氧化損傷產(chǎn)物增加，抗氧化酶系修復損傷的緩沖能力降低.因此我們觀察CLA對DM2大鼠氧化應激水平和肝組織線粒體呼吸酶的活性的影響，旨在探討DM2發(fā)病的分子機制確定研究靶位.本實驗證實CLA確有降低血糖的作用，顯示出劑量效應趨勢.肝組織線粒體MDA,GSH水平及SOD,CAT活性變化，可以反映CLA是否通過對抗自由基而發(fā)揮其治療作用.本實驗表明DM大鼠肝組織中MDA含量與對照組相比顯著升高，GSH，SOD和CAT的水平與對照組相比顯著降低，說明DM大鼠處在嚴重的氧化應激狀態(tài)，經(jīng)不同劑量CLA治療后對上述指標均有不同程度的改善，隨著CLA劑量的增加，能更加顯著降低肝臟組織中MDA的含量，使GSH，SOD和CAT的水平明顯升高.DM大鼠肝組織線粒體呼吸鏈酶NADHOX，SUCOX，CYTOX的活性與對照相比顯著降低(Ｐ，Ｐ)，經(jīng)CLA治療后得到提高，具有劑量效應趨勢.值得注意的是g/kgCLA治療組使NADHOX，SUCOX和CYTOX活性基本恢復到正常對照組的水平.表明DM對線粒體呼吸酶NADHOX和CYTOX活性的影響尤為重要.因此CLA有可能通過抑制DM產(chǎn)生的氧化應激對線粒體的損傷作用，增強大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性，改善了DM大鼠肝臟的能量代謝障礙，從而有效降低血糖，對DM引起的氧化損傷起到保護作用.

【參考文獻】

［1］RyderJW，PortocarreroCP，SongXM，etal.Isomerspecificantidiabeticpropertiesofconjugatedlinoleicacidimprovedglucosetolerance,skeletalmuscleinsulinaction,andUCP2geneexpression［J］.Diabetes,2001;50(5):1149-1157.

［2］TurkoIV,MuradF.Quantitativeproteinprofilinginheartmitochondriafromdiabeticrats［J］.BiolChem,2003;278(37):35844-35849.

［3］郭嘯華,劉志紅,李恒,等.實驗性2型糖尿病大鼠模型的建立［J］.腎臟病與透析腎移植雜志,2000;9(4):351