復(fù)方甘草酸苷中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

復(fù)方甘草酸苷中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定【摘要】目的建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方甘草酸苷片中3個(gè)主成分有關(guān)物質(zhì)的反相高效液相色譜法，以控制其質(zhì)量。方法采用C18色譜柱，以mol·L-1醋酸鈉溶液-乙腈forsimultaneousdeterminationofrelatedsubstancesofthreemajorcomponentsincompoundglycyrrhizinC18columnwasusedwiththemobilephaseofmol·ml-1NaACsolution-acetonitrile(59∶41)andthedetectionwavelengthwasat251nmand360nm.ResultsResolutionanddetectablesensitivityofeachconstituentinsamplessatisfiedthedetectiondemandofrelatedsubstance.TheLODofglycyrrhizin,glycine,DL-methioninewereng，ngandng,respectively.ConclusionThemethodissensitive，accurate，simpleandspecific.Itcanbeusedasareliablemethodforthequalitycontrolofcompoundglycyrrhizintablet.

Keywords：Compoundglycyrrhizintablets;Glycyrrhizin;Glycine;DL-methionine;Relatedsubstance;RP-HPLC

復(fù)方甘草酸苷片是由甘草酸單銨鹽，甘氨酸，DL-蛋氨酸組成的復(fù)方制劑，于1948年在日本上市，現(xiàn)主要用于治療慢性肝病，改善肝功能異常，亦可用于治療過(guò)敏性反應(yīng)、斑禿、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及傳染性非典型肺炎等，療效確切，已于臨床應(yīng)用多年［1，2］。從傳統(tǒng)中藥材甘草中可提取得到甘草酸，再經(jīng)成鹽可制備得甘草酸單銨鹽，長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，食品和化妝品等領(lǐng)域，對(duì)其臨床以及其它用途的安全性檢驗(yàn)已獲得FDA的認(rèn)可［3］，但國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定甘草酸單銨鹽的含量為%［4］，說(shuō)明甘草酸單銨鹽原料藥的有關(guān)物質(zhì)含量高。為保證本制劑批間質(zhì)量的一致性和安全性，進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)考察實(shí)驗(yàn)。

1儀器與試藥

日本島津SCL-20AVP型高效液相色譜儀，SPD-M20二極管陣列檢測(cè)器，LC-solution島津色譜工作站；THZ-82型恒溫水浴振蕩器(上海常思工貿(mào)有限公司)；BP211D精密天平。

乙腈為色譜純，2,4-二硝基氟苯，冰醋酸，無(wú)水醋酸鈉，碳酸氫鈉，氫氧化鈉均為分析純。水為雙蒸水。

甘草酸單銨(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)11073-200513)；甘氨酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào))，DL-蛋氨酸(Sigma公司，批號(hào)0580123，含量＞99%)。復(fù)方甘草酸苷片(新疆特豐藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20070513，20070514，20070515)。復(fù)方甘草酸苷片(商品名：美能；日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社生產(chǎn)，批號(hào)06130)。

2方法與結(jié)果

色譜條件［5］ShimadzuVD-ODSC18色譜柱(250mm×mm,5μm)，流動(dòng)相為mol·L-1醋酸鈉溶液-乙腈；流速1ml·min-1；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)λ甘草酸=251nm，λ氨基酸=360nm；進(jìn)樣量20μl。以空白輔料溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定。甘草酸單銨鹽的保留時(shí)間為min，色譜見(jiàn)圖1；甘氨酸、DL-蛋氨酸及衍生劑DNFB的保留時(shí)間分別為，和min，色譜圖見(jiàn)圖2。理論塔板數(shù)分別以甘草酸單銨，甘氨酸，DL-蛋氨酸峰計(jì)均大于3000，各主成分與雜質(zhì)峰分離度均大于。

a-空白樣品b-甘草酸單銨對(duì)照品c-供試品1.甘草酸單銨鹽

圖1甘草酸單銨鹽的HPLC圖

專屬性考察

空白溶劑實(shí)驗(yàn)取用流動(dòng)相制成的空白溶液，照下述“有關(guān)物質(zhì)檢查法”進(jìn)樣，結(jié)果色譜圖上無(wú)色譜峰。

甘草酸單銨鹽的破壞實(shí)驗(yàn)取甘草酸單銨對(duì)照品5mg置10ml容量瓶，50%甲醇溶解定容，分別取此溶液1ml至5ml容量瓶，然后分別加入1mol·L-1的HCl溶液，1mol·L-1的NaOH溶液和30%H2O2溶液各ml，80℃水浴加熱30min，調(diào)pH至中性，50%甲醇稀釋至刻度，即得甘草酸單銨鹽的酸、堿、強(qiáng)氧化破壞樣品；取甘草酸單銨鹽適量，置130℃烘箱h，用50%甲醇溶解定容制得高溫破壞樣品。分別取各破壞樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖3。

甘氨酸、DL-蛋氨酸的破壞試驗(yàn)分別取甘氨酸、DL-蛋氨酸對(duì)照品6mg置10ml容量瓶，蒸餾水溶解定容，作為儲(chǔ)備液。分別取1ml儲(chǔ)備液至10ml容量瓶，然后分別加入1mol·L-1的HCl溶液，1mol·L-1的NaOH溶液和30%H2O2溶液各1ml，80℃水浴加熱30min，調(diào)pH至中性，依條件衍生處理后［5］，即得甘氨酸、DL-蛋氨酸對(duì)照品的酸、堿、強(qiáng)氧化破壞樣品；分別取甘氨酸、DL-蛋氨酸對(duì)照品適量，置130℃烘箱h，蒸餾水溶解后，進(jìn)行衍生后，制得高溫破壞樣品。分別取各破壞樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖可見(jiàn)，本色譜條件可將甘草酸單銨、甘氨酸、DL-蛋氨酸各破壞條件下的降解產(chǎn)物與主成分峰能夠完全分離，分離符合藥典要求，不影響主藥的含量測(cè)定。

線性關(guān)系

甘草酸單銨鹽線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)精密稱取甘草酸單銨對(duì)照品適量，以50%甲醇配制成濃度為，，，，，，506μg·ml-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取20μl進(jìn)樣測(cè)定，以濃度對(duì)峰面積回歸，得回歸方程：Y=15311X-5888，r=，線性范圍～506μg·ml-1。

甘氨酸，DL-蛋氨酸線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)分別精密稱取甘氨酸，DL-蛋氨酸對(duì)照品適量，分別配制成約600μg·ml-1溶液，取此液適量衍生后［5］，配成甘氨酸濃度為，，，，μg·ml-1的對(duì)照品溶液，DL-蛋氨酸濃度為，，，，，，μg·ml-1的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以濃度對(duì)峰面積回歸，得回歸方程。甘氨酸：Y=132572X-4，r=8，線性范圍為～μg·ml-1；DL-蛋氨酸：Y=71699X-84781，r=7，線性范圍為～μg·ml-1。

靈敏度實(shí)驗(yàn)在“”色譜條件下，信噪比S/N=3時(shí)，甘草酸單銨鹽、甘氨酸、DL-蛋氨酸的檢測(cè)限分別為，，ng；而信噪比S/N=10時(shí)，甘草酸單銨鹽、甘氨酸、DL-蛋氨酸的定量限分別為，，ng。

精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取甘草酸單銨鹽、甘氨酸、DL-蛋氨酸對(duì)照品的高、中、低溶液各平行3份于1日內(nèi)和連續(xù)5日內(nèi)分別測(cè)定，日內(nèi)精密度(n=5)分別為：%，%，%；日間精密度(n=5)分別為%，%，%。

甘草酸單銨、甘氨酸、DL-蛋氨酸連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積的RSD值分別為%，%，%。

回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的產(chǎn)品，分別加入一定量的甘草酸單銨鹽、甘氨酸、DL-蛋氨酸對(duì)照品，配制成高、中、低3種濃度，按對(duì)照品溶液測(cè)定項(xiàng)下處理，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率分別為：甘草酸單銨鹽為%，RSD為%；甘氨酸%，RSD為%；DL-蛋氨酸為%，RSD為%。

PDA的測(cè)定在各專屬性試驗(yàn)中，采用PDA檢測(cè)器檢測(cè)了主成分峰的純度，純度均大于%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本法測(cè)定甘草酸單銨鹽、甘氨酸、DL-蛋氨酸有關(guān)物質(zhì)專屬性良好。

有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

甘草酸單銨鹽有關(guān)物質(zhì)測(cè)定精密稱取復(fù)方甘草酸苷片粉末適量，加50%甲醇制成每毫升中約含甘草酸200μg的溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液適量，用50%甲醇稀釋制成每毫升中含甘草酸2μg的溶液，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)整檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程10%，再精密量取供試品溶液與對(duì)照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。

甘氨酸，DL-蛋氨酸有關(guān)物質(zhì)測(cè)定精密稱取復(fù)方甘草酸苷片粉末適量，加水制成每毫升中約含甘氨酸，DL-蛋氨酸600μg的溶液，即得儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液2ml置10ml容量瓶中，加入mol·L-1NaHCO32ml和2%DNFB溶液ml，置60℃水浴中暗處加熱60min進(jìn)行衍生化后，冷卻，以KH2PO4緩沖液定容，即得每毫升中約含甘氨酸，DL-蛋氨酸60μg的供試品溶液。精密量取供試品溶液適量，用KH2PO4緩沖液稀釋制成每毫升中含甘氨酸，DL-蛋氨酸μg的溶液，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)整檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程10%，再精密量取供試品溶液與對(duì)照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。

有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果參照2005版《中國(guó)藥典》，采用主成分自身對(duì)照法。供試品溶液色譜圖上如有雜質(zhì)峰，則各雜質(zhì)峰面積的總和與對(duì)照溶液主成分峰的面積進(jìn)行比較。分別測(cè)定原料藥，3批復(fù)方甘草酸苷片的0月和加速試驗(yàn)6個(gè)月樣品，以及市售產(chǎn)品美能中3個(gè)主成分的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表1。表1有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，3批復(fù)方甘草酸苷片的0月和加速試驗(yàn)6個(gè)月樣品中甘氨酸，DL-蛋氨酸的有關(guān)物質(zhì)含量與原料藥相比，變化均小于1%，色譜圖中所有雜質(zhì)峰面積均小于對(duì)照溶液主峰面積，已低于定量限，因此可忽略不計(jì)。該制劑的有關(guān)物質(zhì)主要為甘草酸單銨鹽原料藥中帶入，3批復(fù)方甘草酸苷片的0月和加速試驗(yàn)6個(gè)月樣品中甘草酸單銨鹽與原料藥相比，未知物的種類和數(shù)量無(wú)明顯增加，說(shuō)明制劑過(guò)程中和加速試驗(yàn)6個(gè)月放置過(guò)程中藥物間、藥物與輔料間未產(chǎn)生明顯的未知物；與市售產(chǎn)品美能對(duì)比，3批樣品中三組分的雜質(zhì)種類和數(shù)量無(wú)顯著增加。以上結(jié)果說(shuō)明該制劑的質(zhì)量可靠。鑒于甘草酸單銨鹽原料藥純度低，因此，應(yīng)將制劑中的有關(guān)物質(zhì)與原料藥進(jìn)行比較，參照文獻(xiàn)［6］和本研究結(jié)果，各有關(guān)物質(zhì)峰面積之和(扣除輔料峰，溶劑峰和原料藥有關(guān)物質(zhì)峰外)應(yīng)不大于對(duì)照品溶液主峰面積的2倍。

3討論

新藥的純度檢查是保證安全有效的重要指標(biāo)之一，所涉及的有關(guān)物質(zhì)檢查早已為國(guó)際上“人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)”所關(guān)注，在國(guó)內(nèi)也逐漸引起新藥研發(fā)者的重視［7，8］。甘草酸單銨鹽原料藥有關(guān)物質(zhì)含量高，在復(fù)方甘草酸苷注射劑和甘草酸二銨產(chǎn)品的藥學(xué)研究中就存在確定甘草酸類制劑主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、獲取其安全性數(shù)據(jù)有相當(dāng)難度等問(wèn)題［9，10］。本制劑為復(fù)方制劑，含有3個(gè)主藥組分和6種輔料，因此需考察制劑過(guò)程中和有效期的放置過(guò)程中，藥物間、藥物與輔料間是否有相互作用，是否產(chǎn)生新的有關(guān)物質(zhì)。

進(jìn)口市售產(chǎn)品美能片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)甘草酸單銨鹽、甘氨酸、DL-蛋氨酸的含量測(cè)定分別采用HPLC法、薄層色譜法和反滴定法，無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)［11］；甘草酸單銨鹽的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)〔WS-10001-(HD-1269)2002〕［4］中規(guī)定含量不得少于%，無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)；注射用復(fù)方甘草酸單銨中采用HPLC法只測(cè)定了甘草酸單銨鹽的有關(guān)物質(zhì)［6］，未考察復(fù)方制劑中3個(gè)主成分間是否有相互作用而產(chǎn)生新的雜質(zhì)。本研究建立了在同一色譜條件下測(cè)定復(fù)方甘草酸苷片中3個(gè)主成分有關(guān)物質(zhì)的HPLC法，經(jīng)方法學(xué)考察和酸、堿、氧化和高溫破壞試驗(yàn)，3種主成分與輔料及降解產(chǎn)物能很好分離，表明該法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便，適用于該制劑的有關(guān)物質(zhì)分析，也可作為中藥材甘草或甘草酸類制劑的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)，保證臨床用藥安全。

采用《中國(guó)藥典》不加校正因子的自身對(duì)照法［12］深入進(jìn)行了復(fù)方甘草酸苷片3組分的有關(guān)物質(zhì)研究，根據(jù)多批樣品中有關(guān)物質(zhì)的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)合穩(wěn)定性考察中有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果，并與原料藥，市售產(chǎn)品美能中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比研究，為本制劑有關(guān)物質(zhì)限度的確定提供了依據(jù)。

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