當歸提取物的鑒定及鎮(zhèn)痛活性觀察

當歸提取物的鑒定及鎮(zhèn)痛活性觀察【摘要】目的鑒定當歸提取物的主要化學成分，并觀察其鎮(zhèn)痛作用。方法采用Molish反應和Fehling實驗反應對當歸提取物進行鑒定，苯酚硫酸法測定其糖含量;采用小鼠扭體法和熱板法觀察當歸提取物的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果當歸提取物的主要成分為多糖，其糖含量為%，此提取物可明顯抑制醋酸所致小鼠扭體反應，提高小鼠痛覺反應的痛閾。結(jié)論此當歸提取物主要成分為多糖，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

【關(guān)鍵詞】當歸提取物;鑒定;多糖;鎮(zhèn)痛作用

ABSTRACT：ObjectiveToidentifyandanalyzethemaincompositionofAngelicaSinensisextractandtoinvestigateitsanalgesicTheidentificationtestwasprocessedwithMolishtestandFehlingtest,thepolysaccharidecontentanalysiswasprocessedbyphenolsulfuricacidreaction.Theanalgesiceffectwasinvestigatedbyaceticacid—inducedwringingtestandhotplateprocedureinThemaincompositionofAngelicaSinensisextractwaspolysaccharide,thepolysaccharidecontentofAngelicaSinensisextractwas%.Thefrequencyofwringingreactioninducedbyaceticacidwasobviouslydecreased,andthepainthresholdofmiceinthehotplateprocedurewasincreasedaftertheanimalswereadministeredwithAngelicaSinensisTheresultindicatesthatthemaincompositionofAngelicaSinensisextractispolysaccharide,anditpossessessignificantanalgesiceffect.

KEYWORDS：AngelicaSinensisextract;Identification;Polysaccharide;Analgesiceffect

當歸AngelicaSinensis(Oliv.)Diels是祖國醫(yī)學中最常用的中藥材之一，可用于活血通經(jīng)、虛寒腹痛，亦可治跌打損傷。當歸在歷代方劑中應用頻度極高，已被證明具有復雜的生物活性[1~3]。我們從當歸中提取到一種組分，對其主要成分進行了初步鑒定，并觀察了其鎮(zhèn)痛作用。

1材料和方法

儀器與藥品

Savantecs100UVS400A冷凍真空干燥機;RB200智能熱板儀，成都泰盟科技有限公司。葡萄糖對照品，Amresco。阿司匹林片，昆明制藥廠，臨用前取研碎后配制成12g/L的濃度。

實驗動物

昆明小鼠50只，雌性，體質(zhì)量20±2g，購于湖北省醫(yī)學科學院。

當歸提取物的制備

當歸100g，切片，乙醇回流后100℃沸水提取，提取液60℃減壓濃縮至60ml，加入95%乙醇3200ml，充分攪拌，-20℃靜止48h后取上清，用乙酸乙酯萃取，收集水相，上大孔樹脂柱，分別用甲醇、乙醇、水過柱，收集水洗脫組分，60℃減壓濃縮后加入適量丙酮，4000rpm離心10min，收集沉淀，用水溶解后揮去溶劑，活性炭過濾，濾液-80℃冰箱預凍2天后于冷凍干燥機冷凍至干燥。

試劑制備

(1)Fehling試劑：CuSO4加水定容至，普通濾紙過濾;酒石酸鉀鈉與加水定容至，普通濾紙過濾。臨用前兩濾液等體積混合。

(2)5%苯酚試劑：取苯酚，加鋁片和，蒸餾，收集182℃餾分，稱取，加水150ml溶解，置棕色瓶內(nèi)冷藏備用。

(3)當歸溶液：取凍干的當歸提取物，分別配成/L、/L、/L的溶液，115℃滅菌30min后備用。

當歸提取物的鑒定

(1)Molish反應：取當歸提取物，加水溶解，加2滴15%α萘酚乙醇溶液，混合搖勻后，沿管壁緩緩加入硫酸，將試管靜置10min后50℃水浴5min觀察在兩液面交界處有無紫紅色環(huán)出現(xiàn)。

(2)Fehling實驗：取當歸提取物，加水定容至200ml，取置試管中，加5%鹽酸液，沸水水浴15min，室溫靜止至冷，加酚酞指示劑1滴，用10%NaOH試液中和至中性，加Fehling試劑4～5滴，50℃水浴5min，觀察是否生成棕紅色沉淀。

多糖含量測定

按照文獻方法，精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品120mg，加水定容到100ml，得/ml葡萄糖貯備液，分別精密吸取葡萄糖貯備液、、、、、，定容至100ml，搖勻，分別吸取上述標準葡萄糖溶液,加入10ml試管中,加入5%苯酚溶液，旋渦混勻,迅速滴加濃硫酸5ml，旋渦混勻，60℃水浴加熱20min，室溫冷卻，另取1ml蒸餾水作空白對照，在490nm波長處測定吸光值。

精密吸取當歸提取物，用蒸餾水溶解定容至100ml，取該溶液100μl加入900μl蒸餾水使樣品液為1ml，加5%苯酚溶液，旋渦振蕩，迅速加濃硫酸，旋渦振蕩，60℃水浴20min，取出冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度值。代入標準曲線求出當歸提取物中總糖含量。

當歸提取物的鎮(zhèn)痛作用

(1)當歸提取物對醋酸致小鼠扭體的影響。小鼠隨機分成5組，空白組，陽性對照組，低劑量當歸提取物組及中、高劑量組，每組10只。低、中、高劑量當歸提取物組分別腹腔注射9g/L、18g/L、36g/L的當歸提取物溶液，陽性對照組按照300mg/kg給予阿斯匹林灌胃，空白組給予等量NS腹腔注射，給藥1h后，每只小鼠腹腔注射%醋酸溶液，記錄15min內(nèi)小鼠扭體反應次數(shù)。

(2)當歸提取物對小鼠痛閾的影響。以熱板測痛儀測定動物在(±)℃的基礎痛閾，低于10s或高于30s以及入儀器跳躍的小鼠剔除不用，記錄動物放至熱板上至動物出現(xiàn)舔足反應的時間記為基礎痛閾。各組小鼠給藥1h后測定動物痛閾，若動物60s內(nèi)未出現(xiàn)舔足反應，痛閾記為60s。

2結(jié)果

當歸提取物的鑒定結(jié)果

Molish反應：試液中有明顯紫紅色環(huán)出現(xiàn)，提示此當歸提取物中含有糖類物質(zhì)。

Fehling實驗：試液中生成棕紅色沉淀，提示當歸提取物中含有糖類物質(zhì)。

當歸提取物糖含量測定

以葡萄糖含量為橫坐標,吸光度值為縱坐標,得回歸方程為：A=+(r=),線性范圍6～60μg/ml，標準曲線如圖1。將當歸提取物溶液的OD490值代入回歸方程，求得當歸提取物的糖含量為%。

當歸提取物的鎮(zhèn)痛作用

熱板法觀察當歸提取物對小鼠痛閾的影響，結(jié)果顯示高劑量當歸提取物可明顯提高小鼠對熱刺激致痛的痛閾()，痛閾提高百分率為%，中劑量當歸提取物雖可提高小鼠對熱刺激致痛的痛閾(痛閾提高百分比為%)但給藥前后配對檢驗，不具有統(tǒng)計學意義。阿司匹林對動物痛閾提高率百分比為%，900mg/kg的當歸提取物對動物痛閾提高率雖較阿司匹林為高，但此兩組的組間比較沒有顯著性差異，結(jié)果見表1。表1熱板法觀察當歸提取物對小鼠痛閾的影響

當歸提取物對小鼠扭體反應的影響

中、高劑量當歸提取物可明顯減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)(、)，高劑量當歸提取物的扭體抑制率為%，接近阿司匹林(%)，高劑量當歸提取物的抑制率雖高于中劑量當歸提取物組，但無統(tǒng)計學意義(P=)。低劑量的當歸提取物并未對動物的扭體反應產(chǎn)生明顯影響。結(jié)果見表2。表2當歸提取物對醋酸所致小鼠扭體反應的影響與空白組比較，*，**

3討論

多糖是廣泛存在于自然界的天然高分子化合物，由單糖通過糖苷鍵連接而成。根據(jù)植物多糖溶于水、遇乙醇沉淀的性質(zhì)采用水提醇沉法提取植物多糖是最常用的提取方法[5~7]。從當歸中提取多糖常用的方法是乙醇處理當歸水提液，在水提液中含醇量達到80%時，幾乎可除去全部的蛋白質(zhì)和多糖、無機鹽類，對所得沉淀中進行純化、分離，即可獲得當歸總多糖(或稱當歸粗多糖)。

本文所涉及的當歸提取物為當歸水提液經(jīng)乙醇處理(含醇量80%)后的上清中提取到的組分，此提取物在Molish反應中的二層界面出現(xiàn)紫色環(huán)，在Fehling實驗中生成了棕紅色沉淀，均提示此當歸提取物中含有糖類物質(zhì)。

提取當歸多糖時乙醇濃度一般控制在60%～80%,不同提取、分離方法從當歸水提醇沉的沉淀中獲得的當歸多糖組分的化學屬性存在很大差別。本文的當歸提取物來源于當歸水提組分中可溶解于80%的乙醇溶液的部分，而非來源于當歸醇沉物，實驗結(jié)果提示在傳統(tǒng)的水提醇沉法的上清液中仍含有多糖組分，這一部分當歸多糖組分的分子量、單糖組成等化學屬性以及藥理學活性與來自于醇沉的沉淀中的多糖組分是否存在差別，尚待進一步研究。

實驗結(jié)果表明此當歸提取物能明顯提高小鼠對熱刺激致痛的痛閾，抑制小鼠對化學刺激致痛的扭體反應。有研究報道從水提醇沉的沉淀中得到的當歸總多糖也具有鎮(zhèn)痛效應，當歸中的這兩個組分的藥理學活性是否存在差異，鎮(zhèn)痛機理如何，尚待進行相關(guān)實驗研究比較。

【參考文獻】

[1]左增艷，柳鐘勛，李健蕊，等.新型生物反應調(diào)節(jié)劑、當歸多糖(ASDP)抗腫瘤作用及其對荷瘤小鼠免疫功能的影響[J].中國免疫學雜志，2000，16(10)：545

洪艷，張渝侯，王紅玲，等.當歸多糖對60Co照射小鼠免疫功能影響的研究[J].華中醫(yī)學雜志，2000，24(6)：291

凌小曼，丁虹，羅順德，等.當歸多糖對血瘀癥動物免疫功能和抗氧化功能的影響[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2002，22(10)：584

董群，鄭麗伊，方積年.改良的苯酚硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究.中國藥學雜志，1996,31(9):550

韋巍，李雪華.多糖的研究進展[J].國外醫(yī)