molecular biology分子生物學(xué)基本研究法

操作主要包括DNA分子的切割與連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及 人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的 技術(shù)。工程是指在體外將核酸分子插入、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的?部分，只不過它 重組 的自 和世代交替問題GeneralizedmodelofreplicationofDNA.Newsynthesisisshowninblue.三、年代末至年代，相繼提出了“中心法則”和 遺傳信息傳遞規(guī)律（即中心則） 能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開第?個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer 在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分圖5-1幾種主要DNA內(nèi)切酶所識(shí)別的序列及WernerArber,HamiltonSmithandDanielNathanswereawardedthe1978NobelPrizefortheirworkonREs(restrictionendonuclease). RE切割隨機(jī)DNA分子（假定4種堿基在DNA 識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開聚合酶I（按5'到3'方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平雙把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5'-（進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行外切酶III從鏈的3λ噬菌體從鏈的5切除位于 ?9.09kb，帶有四環(huán)素抗性（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn)，在HindIII、BamHI和SalI等3個(gè)位點(diǎn)插入外源，會(huì)導(dǎo)致tetr失活。大腸桿菌 粒載體示是第? 克隆載體。缺點(diǎn)：它是?種嚴(yán)緊控制的低拷?質(zhì)粒，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1~2個(gè)拷?，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101 松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)數(shù)小時(shí)，使每個(gè)寄主細(xì)第?部分來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉 第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)優(yōu)點(diǎn)是具有較小的分子量(4363bp)，易于純化。即使 有較?的拷?數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞可累積 大腸桿菌β-半乳糖 （lacZ）啟動(dòng)子及編位于lacZ 5’-端的?段多克隆位 插入破壞lacZ IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)該 ），性及起點(diǎn)，其分子小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由于缺失rop，pUC質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)增時(shí)，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá) RNA1在RNA2的5’末端，轉(zhuǎn)錄方向相反，因此能通過氫鍵配對(duì)與后者相互作用 RNaseH加工RNA 沒有Rop蛋白，RNA1 pUC質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌 子的，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用。因此，可端（如EcoRI和BamHI）的外源DN段直接克隆到進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足工程的要求，只有將它們連接到具備自主能力的DNA分 獲得了用外源DN段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過?個(gè)被稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，才能保證重組DNA 年月日（79歲艾拉·珍·費(fèi)茲潔拉（EllaJane 年月日 年月日），雅號(hào)艾拉夫（LadyElla，即爵士樂，英文FirstLadyofSong），美國歌手，被公認(rèn)為20世紀(jì)最重要的爵士樂歌手之一，與比莉·霍利戴（BillieHoliday）和莎拉·沃恩（SarahVaughan）齊 擬聲吟唱（scatsinging），更特顯出像喇叭聲一樣的即興表演的才華。她亦被普遍認(rèn)為 5.2DNA521自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰重要實(shí)驗(yàn)。適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離 段的范圍為0.2~50kb之間表5-3瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DN50000~120000~161圖4溴化?錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)分子的插入作用。由于插入了溴化?錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。5.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA宿主細(xì)胞中。外源DNA通過自身載體上的起始點(diǎn)進(jìn)行增殖，能在宿主細(xì)胞中?期保存下來，并能受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。將快速生?期大腸桿菌置于經(jīng)0預(yù)處理的低滲CaCl2將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，外源DNA就轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到5×106~2×107個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg超螺旋質(zhì)將生?至對(duì)數(shù)中期的E.coli菌液冷卻至4 后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將?密度菌液（~2×1010/ml）獲得最大轉(zhuǎn)化效率時(shí)場強(qiáng)?般為12.5~15kV/cm，電擊轉(zhuǎn)化與溫度有關(guān)，?般在0~4進(jìn)行。由于轉(zhuǎn)化載體上常帶有LacZ，多用帶有不同抗生素5.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是快速擴(kuò)增DNA序列最常用的方法。PCR反應(yīng)的模板DNA若是 為genomic PCR，若是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的圖5-7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）圖5- PCR指數(shù)擴(kuò)增時(shí)循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的12月，著名的自然科 主編DanielKoshlandJr.寫道：第?篇有關(guān)PCR的論文于1985年。自那以后，PCR已經(jīng)發(fā)展成為日益強(qiáng)大的和有廣泛用途的技術(shù)?！辛薖CR，極少量 凱利 （KaryMullis），1944年出生，1962在佐治亞理工學(xué)院化學(xué)工程專業(yè)畢業(yè) 剛開始時(shí)，對(duì)拓寬自身知識(shí)面表現(xiàn)出極大的—知1983年8月 第?次在公司正式作了?個(gè)有 有少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員有些。 回憶說，“絕大多數(shù)人要么在我結(jié)束報(bào)告之前就離開了會(huì)場，要么故意留下來給我出難題。他們認(rèn)為這些肯定是胡說八。”普遍的觀點(diǎn)是，雖然我不夠聰明，沒看出問題的要首先將雙鏈DNA分子 沸點(diǎn)的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模經(jīng)不斷重復(fù)循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在?溫 ）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA 降低反應(yīng)溫度（退火，約 ），約1分鐘，使寡核 將反應(yīng)混合物的溫度上升到72左右保溫1-三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新 左右,按序列，這就需要應(yīng)用反向PCR（reversePCR）技術(shù)。用?種在靶序列上沒有酶切位點(diǎn)的核酸限制性內(nèi)產(chǎn)生大小不同的線性DN段群體，其中靶DNA按靶序列設(shè)計(jì)的?對(duì)引物與互補(bǔ)序列退火結(jié)合，反向PCR的基本操作程序。波紋線表示靶DNA示靶DNA區(qū)段的左側(cè)和TAIL-PCR（ThermalAsymmetricInter-PolymeraseChain入位點(diǎn)側(cè)翼序列，從而獲得轉(zhuǎn)植物插入位點(diǎn)特異性分子。第?輪反應(yīng)（Primaryreaction）是TAIL-PCR的重有AD序列）大大超過非特異性序列II（兩端均為ADTAILPCRRACE技術(shù)（rapidamplificationofcDNA在已知cDNA序列基礎(chǔ)上克隆5’或3’端缺失序列的技術(shù)。根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)片段內(nèi)部特異引物，由5’端的方法稱為5’RACE，用于擴(kuò)增3’端的稱為5’ 以連有oligo(dG)的錨定引物 1、用oligo(dT錨定引物啟始cDNA第?3、用通用錨定引物 異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的3’片段，用nestPCR法檢測.52.4實(shí)時(shí)定量（real tativePCR，Q-由于PCR敏感性?，擴(kuò)增產(chǎn)物總量變異系數(shù)大，定量確。90年代末期出現(xiàn)了Q-PCR，利用熒光檢測PCR儀繪制DNA擴(kuò)增過程中的累積速率動(dòng)態(tài)變化圖，基本消除在測定終端產(chǎn)物豐度時(shí)變異系數(shù)較大隨著新合成DN 段的增加，由于結(jié)合到DNA上非序列特異性熒 SYBRGreenI,激發(fā)光RealtimePCRSYBRGreenI作探針的實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度首次超過設(shè)定閾值時(shí)，PCR

HanP.,LiQ.,andZhuY.X.(2008)The Cell20:1482-1493.為確保熒光檢測的確實(shí)是靶DNA距離靠近，在熒光能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，TaqMan探針結(jié)合到目的DNA序列上，并且會(huì)被具有外切酶活性的TaqTaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR技5.2. 把某種生物的組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載 構(gòu) 組文庫最常用的是λ噬菌體載體（克隆能力約15—20kb）和限制性內(nèi)切酶部分消化法。例如用識(shí)別4個(gè)核苷酸的核酸限制性內(nèi)切酶Sau3A，與是?對(duì)同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切產(chǎn)生的DN圖5-13用Sau3A限制性核酸內(nèi)切酶消化真核生物 組DNA并利用l噬菌體載體構(gòu)建λ噬菌體作為克隆人工 （BAC）、P1源人工 （YAC）等都可用于組文庫的構(gòu)它們的優(yōu)點(diǎn)是可以插入更大片段DNA，但是穩(wěn)定性 5.3RNA真核生物組DNA龐大，有大量重復(fù)序列，很難直接分離得到靶片段。而cDNA來自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快地分離到相關(guān)。細(xì)胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及?些?個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNAmRNA約占總RNA的1%-圖5-RNA的濃度和純度可以通過測定其OD260和OD280判斷。OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之間，表示所提取OD260/OD280的比值將明顯低于1.8。optical由于RNA為了研究mRNA所包含的功能信息，?般將其反DNA），再插入到可以自我的載體中。圖5-15cDNA合圖5-16定向cDNAcDNA的?度?般在0.5-8kb之間，質(zhì)粒載體和噬菌體cDNA文庫常用Uni-zapXR（?種λ噬菌粒載體）做載篩選的便利，可容納0-10kbDNA插入片段，含有重組后可通過體內(nèi)剪切反應(yīng)（InVivoExcision）將文庫的篩選是指通過某種特殊方法 文中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為將待篩選菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，適當(dāng)溫育。圖5-1780烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，通過放射性自將整個(gè)文庫（以質(zhì)粒的形式或者細(xì)菌的形式均可）存在多孔培養(yǎng)板上，用設(shè)計(jì)好的目的探針對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行PCR篩選，鑒定出陽性的孔，把每個(gè)陽性孔中的克隆再稀釋到次級(jí)多孔板中進(jìn)行PCR篩選。重復(fù)以上程序，直到鑒定出與目的對(duì)應(yīng)的單個(gè)克隆該法僅適用于對(duì)表達(dá)文庫的篩選。若實(shí)驗(yàn)中靶基 圖5-18達(dá)文庫的免疫化5. 在多細(xì)胞的?等生物水平上，克隆表示由具有相同型的同?物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)組成的群體。從同? 而來的單卵雙生子（monozygotictwins）在細(xì)胞水平上，克隆?詞是指由同?個(gè)祖細(xì)胞 而來的?群帶有完全相同在分子生物學(xué)上，人們把將外源DNA插入具有能力的載體DNA中，使之得以永久保存和 這種Gateway技術(shù)利用λ噬菌體進(jìn)行位點(diǎn)特異性 大規(guī)?？藢⒛康腜CR產(chǎn)物連入Entry載體。載體上的CCCTT被拓?fù)洚悩?gòu)酶所識(shí)別，通過與切口處的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)鍵，將該酶偶聯(lián)在載體上。5’GTGG粘性末端PCR產(chǎn)物的互補(bǔ)性末端并將目的片段從Entry載體中重組入表達(dá)載體。Entry載體上兩端具有attL1和attL2位點(diǎn)，目的載體上含有attR1和attR2位點(diǎn)，在重組蛋白的作用下發(fā)生定向重組，形成新的位點(diǎn)attB1和attB2，將目的轉(zhuǎn)移GetEntryGetExpressionGetEntryGetExpressionGetBlackrockBurningman,7days,party,55蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)（protein） （genome） 蛋白質(zhì)組 組既相互對(duì)應(yīng)又有顯著不同，組是確定的，每個(gè) 只有?個(gè) 組，而 Two－DimensionalElectrophoresis，2-等電聚焦（Isoelectricfocusing，IEF）及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）雙向電泳技術(shù)。蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同pH緩沖液中表現(xiàn)出不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)會(huì)在介質(zhì)上不同的區(qū)域（等蛋白質(zhì)的分子量決定了SDS-蛋白復(fù)合物在凝膠電2D-EmapofproteinfromArabidopsisseeds30haftergermination ysisofcp29Aandcp29Bfromseedsat0-96haftergermination現(xiàn)行質(zhì)譜儀主要有三個(gè)連續(xù)的組成部分，即離子源，（Matrix-AssistedLaserDesorptionTime-Of-Flightspectrometry，MALDI-TOF）電噴霧質(zhì)譜（Electrosprayionization，ESI-MS）MALDI-TOF的工作原理：將蛋白質(zhì)酶解成小肽段后與基質(zhì)（主要是有機(jī)酸）混合，將樣品混合物點(diǎn)到金屬靶表面上并使之干燥結(jié)晶，然后用激光轟擊，將呈離子化氣體狀態(tài)的待分析物從靶表面噴射出去。離子化氣體肽段在電場中被加速后到達(dá)檢測器的時(shí)間由肽段Nano-ESI-MS/MSidentificationofN-terminalacetylationofproteinspots2蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WesternBlotting）：是檢a、蛋白樣品的b、SDS分離;（sodiumdodecylpolyacrylamidegelelectrophoresis）DiagnosisofDiagnosisofhepatitisYeasttwo-hybridisamolecularbiologytechniqueusedtodiscoverprotein–protein ctionsandprotein–DNAin bytestingforphysicalin ctions(suchasbinding)betweentwoproteinsorasingleproteinandaDNAmolecule