園藝植物生物技術(shù)第七章2

第七章植物基因工程的基礎(chǔ)知識與技術(shù)

李英(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院)Tel科樓B6018E-mail:yingli@本文檔共164頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期一\14點9分課程主要內(nèi)容第一章緒論第二章園藝植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)第三章園藝植物脫毒與離體快速繁殖第四章園藝植物種質(zhì)離體保存與無性變異系篩選第五章園藝植物的細(xì)胞工程第六章園藝植物的染色體工程第七章植物基因工程的基礎(chǔ)知識與技術(shù)第八章園藝植物基因的分離與克隆第九章園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建第十章園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化第十一章轉(zhuǎn)基因技術(shù)在園藝植物育種的應(yīng)用第十二章園藝植物的分子標(biāo)記第十三章園藝植物生物信息學(xué)第十四章園藝植物生物技術(shù)的安全性評價與管理授課教師:李英,王建軍,侯喜林本文檔共164頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期一\14點9分

基因工程是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)的系列操作技術(shù)總稱。外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。本文檔共164頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期一\14點9分第七章植物基因工程的基礎(chǔ)知識與技術(shù)第一節(jié)植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識第二節(jié)植物基因工程常用的工具酶第三節(jié)植物基因工程常用的載體第四節(jié)植物基因工程的基本技術(shù)本文檔共164頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期一\14點9分第一節(jié)植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識核酸：是以核苷酸為基本單位組成的生物大分子。DNA,RNA核苷酸:堿基，戊糖，磷酸A,T,G,C;A,U,G,CΒ-D-2脫氧核糖遺傳物質(zhì)？本文檔共164頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期一\14點9分第一節(jié)植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識DNA的結(jié)構(gòu)與功能RNA的結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能遺傳信息的傳遞基因的概念本文檔共164頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期一\14點9分一、DNA的結(jié)構(gòu)與功能？DNA的一級結(jié)構(gòu)指DNA分子中脫氧核苷酸按照一定的排列順序，通過磷酸二脂鍵連接形成的多核苷酸。又稱堿基順序。DNA的二級結(jié)構(gòu)即雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA的三級結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋進(jìn)一步扭結(jié)、折疊形成的更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)稱為DNA三級結(jié)構(gòu)，這種雙螺旋結(jié)構(gòu)可再次螺旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)。本文檔共164頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期一\14點9分生物的遺傳信息儲存于DNA的核苷酸序列中，生物界物種的多樣性就在于DNA分子4種核苷酸千變?nèi)f化。本文檔共164頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期一\14點9分DNAModel本文檔共164頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期一\14點9分DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA分子在水性環(huán)境和生理條件下最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但并不是不變的，當(dāng)改變?nèi)芤旱碾x子強度或相對濕度時，DNA結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。本文檔共164頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期一\14點9分DNA超螺旋結(jié)構(gòu)DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的存在可能有兩方面的生物學(xué)意義，一方面，DNA雙鏈經(jīng)過盤繞壓縮使松弛性DNA更為緊密，體積更小，更能保持穩(wěn)定。另一方面，影響DNA雙螺旋的解鏈過程，從而影響與其他大分子如蛋白質(zhì)、酶的結(jié)合。本文檔共164頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期一\14點9分二、RNA的結(jié)構(gòu)與功能mRNAmRNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。tRNAtRNA是細(xì)胞內(nèi)分子質(zhì)量最小的一類核酸，由70~120核苷酸構(gòu)成。rRNA是最多的一類RNA，也是3類RNA中相對分子質(zhì)量最大的一類RNA，它與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成核糖體，其功能是作為mRNA的支架，使mRNA分子在其上展開，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的合成。rRNA單獨存在時不執(zhí)行其功能，它與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，作為蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機”。本文檔共164頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期一\14點9分三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)由氨基酸通過肽鍵連接成一條多肽鏈，由一個氨基酸的羥基和另一個氨基酸的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)產(chǎn)生。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)指多肽采取的不同構(gòu)象。兩種主要形式是α螺旋和β折疊，二者都由多肽的不同氨基酸之間形成的氫鍵所穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)指將多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)組分折疊成為三維構(gòu)型而形成的。主要被氫鍵、二硫鍵和疏水作用所穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)即兩條或更多已形成三級結(jié)構(gòu)的多肽鍵組合在一起形成一個多亞基蛋白。不是所有蛋白都有四級結(jié)構(gòu)。本文檔共164頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期一\14點9分定義：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序。1.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)主要化學(xué)鍵：肽鍵

二硫鍵的位置屬于一級結(jié)構(gòu)研究范疇。本文檔共164頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期一\14點9分一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。胰島素的一級結(jié)構(gòu)3021本文檔共164頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期一\14點9分2.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。定義：穩(wěn)定因素：

氫鍵

本文檔共164頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期一\14點9分（一）肽單元(peptideunit)

參與組成肽鍵的6個原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽鍵平面。它是蛋白質(zhì)構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位。本文檔共164頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期一\14點9分肽單元HHHH本文檔共164頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期一\14點9分

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式

-螺旋(-helix)

-折疊(-pleatedsheet)

-轉(zhuǎn)角(-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

本文檔共164頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期一\14點9分（二）-螺旋結(jié)構(gòu)要點:

①多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)。②每圈螺旋含3.6個氨基酸，螺距為0.54nm。③每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。氫鍵與螺旋長軸基本平行。本文檔共164頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期一\14點9分（三）-折疊①多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈位于鋸齒結(jié)構(gòu)的上下方。②兩段以上的β-折疊結(jié)構(gòu)平行排列，兩鏈間可順向平行，也可反向平行。③兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固β-折疊結(jié)構(gòu)。氫鍵與螺旋長軸垂直。

本文檔共164頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期一\14點9分（四）-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲-轉(zhuǎn)角：無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性的肽鏈結(jié)構(gòu)。①肽鏈內(nèi)形成180o回折。②含4個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基與第四個形成氫鍵。③第二個氨基酸殘基常為Pro。本文檔共164頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期一\14點9分-轉(zhuǎn)角：本文檔共164頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期一\14點9分（五）模體蛋白質(zhì)分子中，二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個具有特殊功能的空間構(gòu)象，被稱為模體(motif)。本文檔共164頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期一\14點9分螺旋－環(huán)－螺旋

鋅指本文檔共164頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期一\14點9分3.蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。穩(wěn)定因素：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。定義本文檔共164頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期一\14點9分

肌紅蛋白(Mb)N端C端本文檔共164頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期一\14點9分纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(domain)大分子蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行其功能，稱為結(jié)構(gòu)域。本文檔共164頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期一\14點9分結(jié)構(gòu)域Triosephosphateisomerase本文檔共164頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期一\14點9分亞基之間的結(jié)合力主要是氫鍵和離子鍵。4.蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。每條具有完整三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈，稱為亞基(subunit)。本文檔共164頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期一\14點9分血紅蛋白（Hb）的四級結(jié)構(gòu)本文檔共164頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期一\14點9分（1.）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵本文檔共164頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期一\14點9分

天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性本文檔共164頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期一\14點9分（2）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Glu·Glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Val

·Glu·····C(146)本文檔共164頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期一\14點9分

這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。本文檔共164頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期一\14點9分肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)（3.）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系本文檔共164頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期一\14點9分（4.）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。本文檔共164頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期一\14點9分蛋白質(zhì)構(gòu)象病的機理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。本文檔共164頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期一\14點9分瘋牛病瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病本文檔共164頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期一\14點9分1.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（Watson

＆Crick,1953）四、遺傳信息的傳遞TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962本文檔共164頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期一\14點9分CentralDogma2.中心法則提出（Crick，1958）Crick,1916-2004本文檔共164頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期一\14點9分反轉(zhuǎn)錄機制闡明（Temin1970

）補充的中心法則本文檔共164頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期一\14點9分五、基因的概念三大成就40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識了遺傳信息的流動和表達(dá)。本文檔共164頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期一\14點9分現(xiàn)在人們認(rèn)為，基因是實體，它的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA或RNA，基因是具有一定遺傳效應(yīng)的DNA分子中特定的核苷酸序列，它是遺傳信息傳遞和性狀分化、發(fā)育的依據(jù)，基因是可分的。根據(jù)基因的產(chǎn)物可將其分為結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、無翻譯產(chǎn)物基因。簡而言之，基因是一個含有特定遺傳信息的核苷酸序列，它是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。本文檔共164頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期一\14點9分第二節(jié)植物基因工程常用的工具酶限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶DNA聚合酶其他工具酶本文檔共164頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期一\14點9分常用工具酶及其功能限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶5′末端切除單核苷酸本文檔共164頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期一\14點9分一、限制性內(nèi)切核酸酶限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。

Ⅰ型限制性內(nèi)切酶Ⅱ型限制性內(nèi)切酶Ⅲ型限制性內(nèi)切酶本文檔共164頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期一\14點9分定義：凡在識別并切割雙螺旋DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。名稱屬名（大寫）種名（小寫）株名分離序號來源菌體EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacollR株HindⅢHindⅢHaemophilusInfluenzaed株HindⅡHindⅡHaemophllusInfluenzaed株HpaⅠHpa/ⅠHaemophllusParainfluenzae限制性內(nèi)切酶的命名舉例本文檔共164頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期一\14點9分Ⅱ型限制酶的作用性質(zhì)1、基本特性：（1）識別位點為4~8個核苷酸序列；（2）識別位點即為切割位點；（3）位點上核苷酸順序通常呈雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)，即呈回文結(jié)構(gòu)。5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點本文檔共164頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期一\14點9分切割方式通常有三種：①在識別順序兩條鏈對稱軸上同時切斷磷酸二酯鍵，形成齊平末端。如HaeⅢ，PvuII。②在識別順序兩條鏈對稱軸上兩側(cè)同時從5’端切斷磷酸二酯鍵，形成5’磷?；?-5個核苷酸單鏈粘性末端。如EcoRⅠ。③在識別順序兩條鏈對稱軸上兩側(cè)同時從3’端切斷磷酸二酯鍵，形成3’羥基端2~5個核苷酸單鏈粘性末端。如PstⅠ。本文檔共164頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期一\14點9分PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

本文檔共164頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期一\14點9分EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

Ho-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP本文檔共164頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期一\14點9分PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

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退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP本文檔共164頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期一\14點9分二、DNA連接酶（一）DNA連接酶和T4DNA連接酶DNA連接酶1976年發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)。目前應(yīng)用的多數(shù)來自于大腸桿菌，稱為E.coliDNA連接酶。分子量74000dal,輔因子NAD+,其作用是封閉雙螺旋骨架上具有5‘-磷?；?’-羥基的缺口，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick（T4DNA連接酶）本文檔共164頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期一\14點9分T4DNA連接酶T4DNA連接酶來自于T4噬菌體感染的E.coli，為T4噬菌體自身的表達(dá)產(chǎn)物。分子量6.8萬dal，輔因子位ATP，該酶既能連接粘性末端，亦能連接齊平末端。修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’本文檔共164頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期一\14點9分連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

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OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA連接酶本文檔共164頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期一\14點9分（二）連接酶的作用

用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組分子。具體做法是，在體外將具有粘性末端的DNA限制片斷，插入到適當(dāng)載體分子上，再用DNA連接酶連接，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。本文檔共164頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期一\14點9分

DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體。a.DNA的粘性末端；b.DNA的平末端；c.化學(xué)合成的具有粘性末端的DNA片段。本文檔共164頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期一\14點9分三、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段T4DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶T7噬菌體DNA聚合酶本文檔共164頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期一\14點9分（一）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要作用是采用缺口平移法標(biāo)記DNA，制備放射性DNA探針，用于核酸雜交分析。DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’-3’的聚合酶活性；

2.5’-3’的外切酶活性；

3.3’-5’的外切酶活性（較低）。本文檔共164頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期一\14點9分（二）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)舒替蘭酶處理，去除全酶中的5’3’外切核酸酶活性，保留了5’3’聚合酶活性和3’5’外切核酸酶活性。本文檔共164頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期一\14點9分（三）T4DNA聚合酶T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一種模板依賴的DNA聚合酶，可以在結(jié)合有引物的單鏈DNA模板上，從5‘→3’方向催化DNA合成反應(yīng)。T4

DNA

Polymerase具有3‘→5’外切酶活性，但不具有5‘→3’外切酶活性。

特點：可以用于將5‘端突出末端補平或3’端突出末端削平。T4

DNA

Polymerase的3‘→5’DNA外切酶活性對于單鏈DNA要比雙鏈DNA活性更高，即單鏈DNA要比雙鏈DNA中的非配對鏈部分更容易被T4

DNA

Polymerase所消化。T4

DNA

Polymerase的3‘→5’外切酶活性比KlenowFragment要高約200倍。

本文檔共164頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期一\14點9分（四）反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。本文檔共164頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期一\14點9分（五）T7噬菌體DNA聚合酶

T7噬菌體DNA聚合酶來源于T7噬菌體感染的E.coli，為兩種緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體，一種是噬菌體基因5蛋白，另一個是宿主蛋白的硫氧還蛋白。T7噬菌體DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強的一個，產(chǎn)物平均長度要大得多，在測定核苷酸序列時有優(yōu)勢。它的活性功能與T4噬菌體DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶類似，但3‘--5’外切活性為Klenow的1000倍。T7噬菌體DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于長模板的引物延伸。Sequenase（測序酶）是美國UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌體DNA聚合酶，切除了99%以上的3'--5'外切活性。SequenaseVersion2切除了所有的3'--5'外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對長片段進(jìn)行測序的理想用酶。本文檔共164頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期一\14點9分四、其他工具酶末端轉(zhuǎn)移酶堿性磷酸酶DNA甲基化酶S1核酸酶本文檔共164頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期一\14點9分（一）末端轉(zhuǎn)移酶

分子克隆中常用的末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是存在于前淋巴細(xì)胞及分化早期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不尋常的DNA聚合酶，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。在二價陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3‘-OH。若dNTP為T或C，此二價陽離子首選CO2+；若dNTP為A或G此二價陽離子首選Mg2+。在基因工程中，利用末端轉(zhuǎn)移酶不需要模板，dNTP中任何一個都可以作為反應(yīng)前體物的特征，給平末端DNA片段3‘-OH加上同聚物poly(C)或poly(G)，也可以加上poly(T)或poly(A)，形成同聚物加尾構(gòu)建重組技術(shù)。本文檔共164頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期一\14點9分（二）堿性磷酸酶堿性磷酸酶：來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5’端同位素標(biāo)記或為了避免DNA片段自身連接（或環(huán)化）時可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。本文檔共164頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期一\14點9分堿性磷酸酶的活性本文檔共164頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期一\14點9分堿性磷酸酶的應(yīng)用本文檔共164頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期一\14點9分（三）DNA甲基化酶原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。在E.coli中，大多數(shù)都有三個位點特異性的DNA甲基化酶。甲基化酶使DNA分子的腺嘌呤或胞嘧啶堿基甲基化，免受內(nèi)源性限制酶切割，從而將能被限制性內(nèi)切酶識別的未被甲基化的DNA分子和不可識別的甲基化方式的DNA分子區(qū)別開來，起到保護DNA分子的作用。本文檔共164頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期一\14點9分（四）S1核酸酶來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。本文檔共164頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期一\14點9分核酸酶SⅠ的應(yīng)用本文檔共164頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期一\14點9分第三節(jié)園藝植物基因工程常用的載體能將目的基因攜帶至宿主細(xì)胞并可在其中自主復(fù)制的遺傳因子謂之為基因工程載體。本文檔共164頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期一\14點9分相關(guān)概念有用基因亦稱為目的基因或插入物用于接受重組DNA的擴增載體及其插入物或表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞謂之宿主插入物的擴增過程稱為分子克隆攜帶重組DNA分子的宿主為基因工程細(xì)胞（菌）或重組細(xì)胞（菌）本文檔共164頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期一\14點9分基因工程載體的必備條件1、能自主復(fù)制2、具有可供選擇的遺傳標(biāo)記3、具克隆位點4、能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小,

載力要大5、載體特征明確：基因，酶切位點，核苷酸序列本文檔共164頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期一\14點9分質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體本文檔共164頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期一\14點9分一、質(zhì)粒質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)①分子量小，差異顯著，1-500kb。②易于在宿主間轉(zhuǎn)移和遷移。③在宿主內(nèi)可伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制，與宿主呈共生關(guān)系。④且其存在與否與宿主生死無關(guān)。⑤編碼宿主染色體不具有的基因，賦予宿主細(xì)胞額外遺傳特性（如抗生素抗性）本文檔共164頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期一\14點9分pBR322

是一種人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒

特點：①帶有多種抗藥性的強選擇標(biāo)記②具有低分子量，高拷貝③外源DNA插入不影響復(fù)制功能④有多種核酸內(nèi)切限制酶單切割位點命名:p：表示質(zhì)粒

BR:分別取自兩位主要構(gòu)建者F.Bolioax

和R.L.Rodrignez姓氏的頭一個字母

322:指實驗室編號本文檔共164頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期一\14點9分普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖1、來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的ampr2、來源于pSC101質(zhì)粒的tetr3、來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點本文檔共164頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期一\14點9分pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點①自身分子量小4363bp②同時具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號③具有較高的拷貝數(shù)本文檔共164頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期一\14點9分pUC質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒是在pBR322載體質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，組入了一個在其5‘端帶有一段多克隆位點的lacZ’基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。pUC取名是根據(jù)它們的加州大學(xué)(UniversityofCalifornia)的科學(xué)家J.Messing和J.Vieria于1987年首先構(gòu)建的本文檔共164頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期一\14點9分(1)pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)pUC系列質(zhì)粒載體包括以下四個組成部分：①來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點ori）；②氨芐青霉素抗性基因Ampr，但它的DNA中核苷酸序列已發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識別位點；③大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ`基因；④位于lacZ’基因中的靠近5`端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。本文檔共164頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期一\14點9分pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal5-溴-4-氯靛藍(lán)（藍(lán)色）本文檔共164頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期一\14點9分(2)pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點①具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷貝數(shù)(500～700)②適用于組織化學(xué)方法檢測重組體③具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以更方便的插入外源基因本文檔共164頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期一\14點9分二、噬菌體載體(一)λ噬菌體DNA1、λ噬菌體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)λ噬菌體為雙鏈DNA病毒，宿主為E.Coli。在宿主內(nèi)有溶菌和溶源兩種形式，在溶源方式中，噬菌體感染宿主后其DNA整合到宿主染色體DNA中，伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制。本文檔共164頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期一\14點9分λ噬菌體DNA是有48502bp組成的線性雙螺旋分子，分子量3.1×107dal。迄今已定位的基因至少61個，其中一半?yún)⑴c了噬菌體生命周期的活動，我們稱這類基因為λ噬菌體的“必要基因”；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱這類基因為λ噬菌體的“非必要基因”。這為其作為基因工程噬菌體的基礎(chǔ)。本文檔共164頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期一\14點9分2、

λ噬菌體DNA克隆載體野生型的λDNA不適宜作為克隆載體。因為⑴其分子量較大，⑵常用的限制酶切點較多。如EcoRI切點5個，HindⅢ切點7個，而這些切點大多位于溶菌周期生長所必須基因內(nèi)，容納不下比其更大的外源性DNA片段，必須對其進(jìn)行改造。本文檔共164頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期一\14點9分改造后，可構(gòu)建兩類λ噬菌體派生載體①取代型載體或替換型載體（replacementvector）它具有成對的克隆位點，這兩個位點之間的λDNA

區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。如λEMBL4

和Charon40。本文檔共164頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期一\14點9分②插入型載體（insertionvectors）只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點（也有一些具有兩個插入位點）。外源性DNA克隆到插入型的λ載體分子上會使噬菌體的某中生物功能喪失，即所謂插入失活效應(yīng)。如免疫功能失活的和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。本文檔共164頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期一\14點9分特點：以λ噬菌體DNA為載體構(gòu)成的重組DNA分子必須包裝成完整病毒顆粒后才具有感染宿主的能力。經(jīng)包裝后重組DNA分子轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍。這類載體可以有效克隆15kb大小的外源基因。本文檔共164頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期一\14點9分1、概述λ噬菌體一般有效克隆外源基因范圍僅為15kb左右，但有些基因可達(dá)35-40kb，甚至更大，同時λ噬菌體不能夠同時克隆兩個連鎖基因。為此，1978年，J.Collins及B.Hohn等人發(fā)展出科斯質(zhì)粒載體，可滿足以上需要?！癱osmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成，其愿意是指帶有粘性末端位點(cos)的質(zhì)粒。三、柯斯載體(cosmid)

本文檔共164頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期一\14點9分定義：科斯質(zhì)粒是人工構(gòu)建的，含有λDNA的粘性(cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與λ噬菌體DNA載體雙重性質(zhì)的特殊載體。本文檔共164頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第110頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第111頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第112頁；編輯于星期一\14點9分2、Cosmid的特點目前已有許多不同類型的科斯質(zhì)粒載體，其特點如下：①具有λ噬菌體的特性；②具有質(zhì)粒載體特性；③具有高容量的克隆能力；④具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。本文檔共164頁；當(dāng)前第113頁；編輯于星期一\14點9分四、人工染色體載體

YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。真核生物染色體的幾個關(guān)鍵部分：著絲粒端粒自主復(fù)制序列本文檔共164頁；當(dāng)前第114頁；編輯于星期一\14點9分本文檔共164頁；當(dāng)前第115頁；編輯于星期一\14點9分第四節(jié)植物基因工程的基本技術(shù)核酸分離技術(shù)核酸電泳技術(shù)核酸體外擴增技術(shù)分子雜交技術(shù)本文檔共164頁；當(dāng)前第116頁；編輯于星期一\14點9分一、核酸分離技術(shù)（一）

DNA的提取CTAB法SDS法本文檔共164頁；當(dāng)前第117頁；編輯于星期一\14點9分DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中本文檔共164頁；當(dāng)前第118頁；編輯于星期一\14點9分1.RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活（二）

RNA的提取本文檔共164頁；當(dāng)前第119頁；編輯于星期一\14點9分

2’-deoxyribosesugarsPhosphodiesterlinkagesDirectionalchain(5’to3’)4Basespurines:adenine&guaninepyrimidines:cytosine&thymineDNAisapolymerof

2’-deoxyribonucleotidesGCTAp5’end3’endCGTAHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOOPOCH2OOCNNCHCCHNH2NH2CCNNNCHCNHCOOOPOCH2OO-PO32OOOPOCH2ONCCOHNCHCOCH31’2’3’4’5’3’本文檔共164頁；當(dāng)前第120頁；編輯于星期一\14點9分RNAisapolymerofribonucleotides

ribosesugarsPhosphodiesterlinkagesDirectionalchain(5’to3’)4Basespurines:adenine&guaninepyrimidines:cytosine&uracilGCUApCGUA5’end3’end1’2’3’4’5’3’OHHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOOPOCH2OOCNNCHCCHNH2OHOOOPOCH2ONCHCOHNCHCOOHNH2CCNNNCHCNHCOOOPOCH2OO-PO32OH本文檔共164頁；當(dāng)前第121頁；編輯于星期一\14點9分RNAiseasilyhydrolyzedunderalkalineconditionsThereactionproceedsthrougha2’,3’-cyclicmonophosphateintermediate.EnzymatichydrolysisofRNAbyRNaseproceedsthroughasimilarintermediate.BecauseDNAlacksthe2’-OHgroup,itisstableunderalkalineconditions.....OPO-CH2OOONOHOOPOCH2OONOHOOPOO...OHONOHOOPOO...HOCH2O....OPO-CH2OONOOPOOH+....OPO-CH2OOONOHOOPOHOmixtureof2’-and3’-monophosphatederivativesH2OshortenedRNARNA本文檔共164頁；當(dāng)前第122頁；編輯于星期一\14點9分提取RNA的注意事項(1)玻璃制品、塑料制品和電泳槽:玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。(2)研究人員造成的污染:經(jīng)常更換新手套(3)污染的溶液:避免交叉污染。本文檔共164頁；當(dāng)前第123頁；編輯于星期一\14點9分常用RNA酶抑制劑

焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時也使RNA酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。本文檔共164頁；當(dāng)前第124頁；編輯于星期一\14點9分RNA提取的步驟材料的裂解雜質(zhì)的去除RNA的吸附或沉淀異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使DNA及蛋白沉淀到有機相。硅質(zhì)材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮RNA。經(jīng)DEPC處理的水溶解RNA本文檔共164頁；當(dāng)前第125頁；編輯于星期一\14點9分材料準(zhǔn)備及裂解盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提。組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位,細(xì)菌和酵母需要勻漿處理。對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲存液中保存。液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。本文檔共164頁；當(dāng)前第126頁；編輯于星期一\14點9分雜質(zhì)的抽提采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間，使蛋白質(zhì)、多糖和DNA分布到中間層和有機相中，RNA留在水相中對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機溶劑抽提本文檔共164頁；當(dāng)前第127頁；編輯于星期一\14點9分RNA的沉淀和溶解含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質(zhì)或使用異丙醇沉淀RNA應(yīng)充分的混勻并放置10min左右離心收集沉淀，70％乙醇洗滌，晾干用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解RNA樣品收集后或需長期保存時應(yīng)置于－70℃或加入RNase抑制劑，分裝使用本文檔共164頁；當(dāng)前第128頁；編輯于星期一\14點9分二、核酸電泳技術(shù)自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段。本文檔共164頁；當(dāng)前第129頁；編輯于星期一\14點9分基因組DNA的檢測提取的基因組DNA片段在20kb－30kb之間高質(zhì)量的基因組DNA

帶型單一無拖尾現(xiàn)象DNA濃度及純度的檢測（A260=1約50μg/mL雙鏈DNA；A260/280約為1.8）

本文檔共164頁；當(dāng)前第130頁；編輯于星期一\14點9分RNA的檢測電泳槽系統(tǒng)的處理含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳RNA純度及濃度的檢測（A260=1，約40μg/mLRNA；

A260/A280

約為1.9-2.1）本文檔共164頁；當(dāng)前第131頁；編輯于星期一\14點9分瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（EtBr）染料對核酸分子進(jìn)行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。本文檔共164頁；當(dāng)前第132頁；編輯于星期一\14點9分

溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。本文檔共164頁；當(dāng)前第133頁；編輯于星期一\14點9分

普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進(jìn)行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。本文檔共164頁；當(dāng)前第134頁；編輯于星期一\14點9分三、核酸體外擴增技術(shù)——PCR技術(shù)PCR基本概念PCR基本原理及示意圖PCR反應(yīng)的組成物質(zhì)PCR反應(yīng)體系及擴增程序由基本PCR拓展的相關(guān)技術(shù)本文檔共164頁；當(dāng)前第135頁；編輯于星期一\14點9分PCR技術(shù)

（Polymerasechainreaction）本文檔共164頁；當(dāng)前第136頁；編輯于星期一\14點9分

PCR(Polymerasechainreaction)即：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù)，也稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)。是1985年由美國的KaryB.Mullis等人首創(chuàng)并由美國Getus公司開發(fā)的一項專利，應(yīng)用該方法可使極微量的特定DNA片斷在幾小時內(nèi)迅速擴增到百萬倍。具有特異性強，靈敏度高和快速準(zhǔn)確的優(yōu)點，因而發(fā)展迅速，應(yīng)用范圍越來越廣泛，不僅可用于基因表達(dá)調(diào)控，基因克隆與測序，特異基因篩選等基礎(chǔ)研究，而且在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993KaryB.Mullis（1944–）

LaJolla,CA,USA1.PCR基本概念本文檔共164頁；當(dāng)前第137頁；編輯于星期一\14點9分2.PCR技術(shù)的基本原理

根據(jù)已知的待擴增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補的兩段寡核苷酸引物，在體外將DNA模板在酶促作用下進(jìn)行擴增。PCR全過程可分為DNA模板變性、退火、延伸三個步驟，經(jīng)若干循環(huán)所組成。首先高溫作用使模板DNA變性解鏈，然后降低溫度使引物與模板DNA鏈退火，在TaqDNA聚合酶作用及dNTP底物存在下，引物鏈將沿著5’

～3’方向延伸與模板互補的新鏈，新鏈則可作為下一次反應(yīng)的模板，因此擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)級方式增加。通常單一拷貝的基因經(jīng)25~30循環(huán)可擴增100萬～200萬拷貝。本文檔共164頁；當(dāng)前第138頁；編輯于星期一\14點9分未擴增的DNAA上游引物B下游引物5'端是人工合成的引物，是特定的，3'端沒有固定的終止點特定的擴增產(chǎn)物在第2個循環(huán)中出現(xiàn)，以后快速擴增，成為主要擴增產(chǎn)物BABBABAABABABABA循環(huán)1變性退火延伸循環(huán)2變性、退火延伸靶序列未擴增的DNA本文檔共164頁；當(dāng)前第139頁；編輯于星期一\14點9分循環(huán)3n個循環(huán)后，5'端是特定的人工合成的引物，3'端沒有固定的終止點的DNA鏈擴增量為2n。變性、退火延伸ABBBAABAABBABABABABBA本文檔共164頁；當(dāng)前第140頁；編輯于星期一\14點9分3.PCR反應(yīng)的組成物質(zhì)

完成PCR反應(yīng)的組成物質(zhì)主要有引物、dNTPs、DNA聚合酶(Taq酶)、緩沖液、Mg2+及DNA模板等，其基本特征和要求介紹如下。本文檔共164頁；當(dāng)前第141頁；編輯于星期一\14點9分3.1引物引物是與待擴增DNA片斷兩側(cè)互補的寡核苷酸，是決定PCR擴增特異性的關(guān)鍵因素，引物設(shè)計與合成的好壞直接決定PCR擴增的成效。引物設(shè)計主要考慮：⑴引物長度一般為15～30堿基，太短容易產(chǎn)生許多不同的DNA擴增片段，產(chǎn)生與非靶序列的雜交；太長影響PCR效率。⑵堿基組成引物3’不應(yīng)超過3個連續(xù)的G（或C），引物自身及引物間不應(yīng)存在互補序列，否則易形成引物二聚體。⑶引物3‘不能進(jìn)行修飾，由于引物與模板結(jié)合后，是從3’開始延伸引物的，第一位的錯配將影響擴增效率。本文檔共164頁；當(dāng)前第142頁；編輯于星期一\14點9分3.2dNTP

dNTPs是PCR反應(yīng)所必須的底物，為四種核苷酸的混合物(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)。最適宜的dNTPs終濃度應(yīng)根據(jù)被擴增片斷的長度和堿基組成來確定。本文檔共164頁；當(dāng)前第143頁；編輯于星期一\14點9分3.3DNA聚合酶

目前PCR擴增中最常用的DNA聚合酶是TaqDNA，它是由水生棲熱菌產(chǎn)生，熱穩(wěn)定性好。它的用量多少對PCR擴增效率及特異性有一定影響。另外近年來還使用耐熱的PfuDNA聚合酶和rTthDNA聚合酶，nTthDNA聚合酶可由其將RNA反轉(zhuǎn)錄后擴增出大量的DNA片斷，大大減化操作程序，提高了效率。本文檔共164頁；當(dāng)前第144頁；編輯于星期一\14點9分3.4緩沖液、Mg2+、DNA模板PCR常用的緩沖液是10～50mmol/L的Tris-HCl(pH8.3～8.8)體系，注意不能把不同廠家的Taq酶與緩沖液交叉使用。Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑，其濃度高低明顯影響PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。一般選用2～5mmol/L的濃度。作為模板的可以是染色體DNA，也可是質(zhì)粒DNA，通常PCR反應(yīng)體系中所需的模板的量是102～105拷貝的靶序列。本文檔共164頁；當(dāng)前第145頁；編輯于星期一\14點9分4.PCR反應(yīng)體系（20μl反應(yīng)體系）1.6μldNTP(2.5mmol/L)，1.6μlMg2+(10mmol/L)，0.2μlTaqE(5U/μl)，1μlDNA(25ng/μL)，1μlupperPrimer(10μmol/L)，1μllowerPrimer(10μmol/L)，2.0μl10×Buffer，11.6μlH2O本文檔共164頁；當(dāng)前第146頁；編輯于星期一\14點9分PCR擴增程序

94℃變性3min；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，30個循環(huán)；72℃保溫10min。反應(yīng)停止后加溴酚藍(lán)5μL進(jìn)行電泳，擴增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE作電泳緩沖液。電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外可見分析儀上觀察照相。

本文檔共164頁；當(dāng)前第147頁；編輯于星期一\14點9分5.由基本PCR拓展的相關(guān)技術(shù)簡并PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR)、反向PCR(invertedPCR)、巢式PCR(nestedPCR)、錨定PCRRealtimePCR分子標(biāo)記：RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、AFLP(Amplified