姜黃素體內(nèi)外給藥及含藥血清對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

姜黃素體內(nèi)外給藥及含藥血清對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響【摘要】目的探討姜黃素3種不同給藥途徑對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。方法通過噻唑藍(lán)比色法比較姜黃素3種給藥途徑對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果姜黃素體內(nèi)給藥和含藥血清能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素能夠抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，并呈量效關(guān)系。結(jié)論姜黃素與其代謝產(chǎn)物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用的影響是相反的。

【關(guān)鍵詞】姜黃素；淋巴細(xì)胞；含藥血清

Abstract：ObjectiveToprobeintothehyperplasyeffectofdifferentcurcumineadministeredapproachesforthespleniclymphocyteofeffectofcurcumineontheproliferationofspleenlymphocytesthroughthreedifferentadministrationroutesweredeterminedwithMTTtest.ResultsCurcumineadministratedinvivoanditsdrugserumupregulatedtheproliferationofspleenexperiencecertifiedcurcuminecouldsuppressthehyperplasyofthemicespleniclymphocyte.Itpresenteddose-effectrelationship.ConclusionItiscontrarythattheeffectofcurcumineanditsmetaboliteontheproliferationofspleenlymphocytes.

Keywords：Curcumin;Lymphocyte;Drugserum

姜黃素是中藥姜黃的主要成分，有很重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的藥理作用。如抗氧化、抗炎、降血脂、抗腫瘤等［1］。近些年來有關(guān)姜黃素生物活性的研究越來越多。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素具有免疫調(diào)節(jié)的作用［2］，但其對(duì)體內(nèi)給藥的免疫調(diào)節(jié)的作用未見報(bào)道。本文通過體內(nèi)外及血清藥理學(xué)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)著重對(duì)此進(jìn)行了研究觀察，以期為進(jìn)一步研究其免疫藥理作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料1動(dòng)物ICR小鼠雌性，體重18～20g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：0034800。2試劑與儀器RPMI1640，批號(hào)1285082，GIBCO公司產(chǎn)品；刀豆蛋白，Sigma公司提供；四甲基偶氮唑藍(lán)，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：T15051/15181；姜黃素，由本所植化室提供；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：061201。CO2孵箱，REVCO；電子天平，METTLER，AE240；96孔板，由greinerbio-one提供；酶標(biāo)儀，wellscanMK3LabsystemsDragom。

2方法

姜黃素體內(nèi)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響ICR小鼠60只，分為5組，即正常對(duì)照組和姜黃素4個(gè)劑量組，對(duì)照組每日灌胃生理鹽水，姜黃素給藥組分別每日灌胃給藥50，100，200和400mg/kg的姜黃素。連續(xù)給藥7d，于末次給藥后，取各種小鼠脾臟無菌制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml，置于96孔板中，并增設(shè)ConA對(duì)照組，該組細(xì)胞懸液取自正常對(duì)照組。取每只小鼠的脾細(xì)胞懸液75μl加入96孔板中，并設(shè)4個(gè)復(fù)孔。除正常對(duì)照組，其余各組均加入25μlConA；隨后，正常對(duì)照組加入125μlRPMI1640培養(yǎng)液，其余各組各孔均加入RPMI1640培養(yǎng)液100μl，使反應(yīng)總體積為200μl/孔。置5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入10μlMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后，1000r/min離心10min，棄上清液，每孔加入150μlDMSO，充分振蕩后室溫靜置10min。進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀取A570nm值。

姜黃素體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響在無菌條件下，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml，然后按實(shí)驗(yàn)分組：細(xì)胞對(duì)照組、ConA對(duì)照組、ConA＋姜黃素組。將新分離的小鼠脾細(xì)胞懸液加入96孔板中，各組均加入細(xì)胞懸液75μl/孔，ConA對(duì)照組和ConA＋姜黃素組加ConA25μl/孔。然后ConA＋姜黃素組加入含有不同濃度姜黃素的RPMI1640培養(yǎng)液100μl/孔。設(shè)4個(gè)復(fù)孔。姜黃素藥物對(duì)照組加入含上述不同濃度姜黃素的RPMI1640培養(yǎng)液100μl，再加入RPMI1640培養(yǎng)液100μl。細(xì)胞對(duì)照組和ConA對(duì)照組分別加入RPMI1640培養(yǎng)液，使反應(yīng)總體積為200μl/孔。加樣完畢置5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入10μlMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后，1000r/min離心10min，棄上清液，每孔加入150μlDMSO，充分振蕩后室溫靜置10min。進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀取A570nm值。

姜黃素含藥血清對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

含藥血清的制備ICR動(dòng)物20只，分為5組，每組4只，即正常對(duì)照組和姜黃素50，100，200和400mg/kg，對(duì)照組灌胃生理鹽水，給藥組灌胃不同濃度的姜黃素，ml/10g體重，連續(xù)給藥5d，末次給藥后1，2和4h摘眼球無菌取血，3000r/min離心10min，無菌分離血清后，每組合并血清，經(jīng)56℃30min滅活，-20℃保存，1個(gè)月內(nèi)使用。

淋巴細(xì)胞增殖活性的測(cè)定無菌制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml，按上“含藥血清的制備”分組進(jìn)行加樣。參照文獻(xiàn)［3］，于96孔培養(yǎng)板每孔加入100μl脾細(xì)胞懸液，再加入80μlConA及20μl不同時(shí)相含藥血清，使每孔含藥血清的含量為10%，設(shè)4個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入相應(yīng)體積的無藥血清培養(yǎng)。加樣完畢置5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入10μlMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后，1000r/min離心10min，棄上清液，每孔加入150μlDMSO，充分振蕩后室溫靜置10min。進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀取A570nm值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以±s表示，用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。

3結(jié)果

姜黃素體內(nèi)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可見，姜黃素在50，100，200和400mg/kg之間，在ConA的誘導(dǎo)下，隨著藥物濃度的增加，增殖活性也在逐漸增加，基本呈量效關(guān)系。

表1姜黃素體內(nèi)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

姜黃素體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響由表2可見，姜黃素體外實(shí)驗(yàn)各給藥組與ConA組比較，在濃度為～μg/ml時(shí)，除濃度μg/ml似有促進(jìn)增殖作用外，基本可以看出在該濃度范圍姜黃素對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用無明顯的影響。姜黃素在濃度～225μg/ml之間時(shí)則表現(xiàn)出明顯的抑制ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的作用，該抑制作用基本上呈劑量依賴性。

表2姜黃素體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

與ConA對(duì)照組比較，※P＜

姜黃素含藥血清對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響由表3可見，姜黃素含藥血清濃度為10%時(shí)，400mg/kg組與ConA對(duì)照組比較1，2h時(shí)相未表現(xiàn)出增殖活性，4h時(shí)增殖活性明顯。50～200mg/kg組與對(duì)照組比較，1，2和4h時(shí)均表現(xiàn)出明顯的增殖活性，P＜。

表3姜黃素體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

與對(duì)照組比較，※P＜

4討論

維持機(jī)體免疫功能主要依賴于各種功能正常的免疫細(xì)胞和細(xì)胞之間的相互作用。其中T淋巴細(xì)胞多數(shù)寄居在脾臟，參與細(xì)胞免疫，是特異性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)［4］。本實(shí)驗(yàn)通過3種作用途徑觀察姜黃素對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響。姜黃素口服給藥50，100，200和400mg/kg這4個(gè)劑量組的脾淋巴細(xì)胞，在ConA的誘導(dǎo)下，隨著藥物濃度的增加增殖活性也在增加，說明姜黃素口服給藥可以提高機(jī)體的特異性免疫功能。姜黃素體外實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素在～μg/ml時(shí)，對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的增殖無影響，在濃度～225μg/ml之間明顯的抑制了ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相近［2］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］，我們采集了姜黃素口服末次給藥后1，2，4h的血，分離出血清，在體外實(shí)驗(yàn)中，姜黃素含藥血清表現(xiàn)出一定的增殖活性與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

姜黃素體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相佐，即姜黃素體外表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒活性，而體內(nèi)表現(xiàn)出明顯地促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的活性，提示姜黃素口服后可以吸收，通過吸收入血后發(fā)揮其藥理作用；口服姜黃素所產(chǎn)生的體內(nèi)免疫增強(qiáng)作用其物質(zhì)基礎(chǔ)很可能不在于姜黃素本身而是其相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。有關(guān)姜黃素的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，姜黃素的血藥濃度低或基本測(cè)不到，生物利用度不高，可能與其吸收、代謝有關(guān)?？诜S素在小腸吸收時(shí)有生物轉(zhuǎn)化，但結(jié)合和還原的比例還不明確。在肝中也有姜黃素結(jié)合或還原產(chǎn)物。姜黃素主要是在小腸還是在肝中進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的作用尚未確定［5］。

總之本項(xiàng)研究表明，姜黃素與其“代謝產(chǎn)物”有著不同的生物活性，體外姜黃素表現(xiàn)出明確的細(xì)胞毒活性［2］，而其“代謝產(chǎn)物”的細(xì)胞毒活性“消失”。我們另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與姜黃素本身比較它的含藥血清不具有抗腫瘤增殖的生物活性。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚可證實(shí)，姜黃素口服給藥在體內(nèi)最終發(fā)揮生物作用的是其代謝產(chǎn)物而非原型藥物，當(dāng)然這一結(jié)論的確證最終尚需進(jìn)一步證實(shí)。

此外，通過本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)觀察進(jìn)一步驗(yàn)證了中藥體內(nèi)給藥與其含藥血清體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，即含藥血清體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。4h采集的含藥血清誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖的活性明顯高于1和2h采集的血清，這一現(xiàn)象與一般認(rèn)為大多含藥血清采集在1～2h活性較強(qiáng)不符［6］，結(jié)合文獻(xiàn)資料單次口服姜黃素達(dá)峰時(shí)間為～1h［5］，進(jìn)一步提示姜黃素體內(nèi)免疫增強(qiáng)作用來自其代謝產(chǎn)物而非其本身。

【參考文獻(xiàn)】

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