第二章基因工程基本技術(shù)原理DNA序列分析

目的與要求掌握DNA測序的一般原理和方法，通過學習，分析DNA策序與蛋白質(zhì)策序的區(qū)別。重點：

Sanger雙脫氧鏈終止法策序原理和方法難點：如何根據(jù)凝膠電泳直接讀出DNA序列學時：2學時學習方法：課堂講授與討論相結(jié)合本文檔共28頁；當前第1頁；編輯于星期三\11點31分2.5.1Sanger雙脫氧鏈終止法■

2.5.2Maxam－Gilbert化學修飾法■

2.5.3序列分析自動化■2.5.4雜交測序■2.5.5DNA策序的商業(yè)運作及存在問題■2.5.6思考問題■本文檔共28頁；當前第2頁；編輯于星期三\11點31分2.5.1Sanger雙脫氧鏈終止法60年代末就已掌握了充分的理論知識，只是當時在某些技術(shù)能力上和研究思路上，存在著弱點，阻礙了從理論轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實第一，如何分離寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都沒有擺脫蛋白質(zhì)序列分析的束縛。返回DNA核酸序列分析歷程本文檔共28頁；當前第3頁；編輯于星期三\11點31分引物—延伸測序策略1968年華裔生物化學、生物學家吳瑞博士（Dr．RayWu）獨創(chuàng)性地設(shè)計出一種嶄新的引物延伸測序策略，并于1971年首次成功地測定了λ噬菌體兩個COS末端的完整序列；1977，F(xiàn).Sanger在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采納他的方法，完善了PCR擴增DNA的方法；M．Smith發(fā)明了堿基定點突變技術(shù)。這三位科學家全都獲得了諾貝爾獎。本文檔共28頁；當前第4頁；編輯于星期三\11點31分2.5.1.1Sanger雙脫氧鏈終止法原理利用DNA聚合酶的兩種酶催反應(yīng)特性：1、利用單鏈DNA模板，合成DNA互補鏈；2、利用2’，3’雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從而終止DNA鏈的生長。也稱引物合成法，或酶催引物合成法。本文檔共28頁；當前第5頁；編輯于星期三\11點31分反應(yīng)：同時加入引物和模板、DNA聚合酶1、一種ddNTP、以及四種dNTP（有一種帶放射性標記）。變性膠電泳分離反應(yīng)混合物。放射自顯影術(shù)，檢測單鏈DNA片段的放射性帶。結(jié)果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序。本文檔共28頁；當前第6頁；編輯于星期三\11點31分GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC考考你本文檔共28頁；當前第7頁；編輯于星期三\11點31分酶、原料比例dNTP／ddNTP=100：1時，譜帶分離效果較佳，可讀出多于200個以上的核苷酸順序。降低dNTP對ddNTP濃度比，會產(chǎn)生逐漸加長的片段，再配合使用長膠和低濃度的聚丙烯酰氨凝膠，分辨能力可提高到能判讀出300個左右的核苷酸順序。本文檔共28頁；當前第8頁；編輯于星期三\11點31分2.5.1.2Sanger雙脫氧-M13體系DNA序列分析法引物合成DNA序列測定法的特點及缺陷分析：這樣處理后，能策得高分子量DNA嗎？為了將這些降解的DNA片段，按其原來的順序“拼排”起來，至少還需要用一種或數(shù)種其它內(nèi)切限制酶，對同種DNA作酶切消化，并進行電泳純化和序列分析。高分子量DNA分子消化降解成一組具一定長度的限制片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離純化，從膠中抽取DNA片段，供進一步分析。費時、費力、費錢、DNA損傷嚴重本文檔共28頁；當前第9頁；編輯于星期三\11點31分克服缺點的一種途徑—DNA分子克隆將不同限制酶消化切割的DNA限制片段，隨機地克隆到載體分子上。選用天然的單鏈DNA噬菌體，例如M13作為載體，重組體噬菌體的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是從親本單鏈噬菌體DNA中分離出來的一種限制片段。其特點是能夠特異性地同載體分子上與克隆位點相連的單鏈DNA區(qū)段雜交。稱做“通用引物”。本文檔共28頁；當前第10頁；編輯于星期三\11點31分M13載體克隆DNA片段將DNA片段克隆在M13mp載體特定LacZ區(qū)段中重組體噬菌體在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上形成白色的噬菌斑;非重組體的噬菌體則形成藍色的噬菌斑。從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈DNA，就可以直接按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。本文檔共28頁；當前第11頁；編輯于星期三\11點31分這種隨機的方法，也需要通過順序的測定將派生的序列拼連起來，恢復(fù)成原來結(jié)構(gòu)形式的總DNA序列。本文檔共28頁；當前第12頁；編輯于星期三\11點31分使用M13載體系列的優(yōu)點所有的待測定的DNA片段，都可以共用一種引物。這樣，就避免了合成和分離各種不同引物的許多麻煩。應(yīng)用M13mp載體系列的雙脫氧鏈終止法，已經(jīng)成為一種最普遍采用的快速的DNA序列分析法。本文檔共28頁；當前第13頁；編輯于星期三\11點31分2.5.1.3Sanger雙脫氧—pUC體系DNA序列分析法將待測DNA片段克隆到質(zhì)粒載體上，直接用閉合環(huán)形的雙鏈質(zhì)粒DNA按雙脫氧鏈終止法作DNA序列分析。這種方法特稱為利用雙鏈質(zhì)粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法。由于通常使用的質(zhì)粒多是pUC載體系列，所以又稱之為Sanger雙脫氧鏈終止-pUC體系DNA序列分析法。本文檔共28頁；當前第14頁；編輯于星期三\11點31分Sanger雙脫氧—pUC體系DNA序列分析法基本步驟待測DNA與pBR322或pUC分子重組；轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在補加有Xgal-IPTG選擇性培養(yǎng)基平板上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)；挑選白色菌落，制備質(zhì)粒NA。堿變性處理，與引物一起退火，然后按雙脫氧法作序列分析。優(yōu)點：無需將DNA克隆到M13載體上，更為簡單快速，現(xiàn)已被許多研究工作者采用。返回目錄本文檔共28頁；當前第15頁；編輯于星期三\11點31分2.5.2Maxam－Gilbert化學修飾法是1977年由美國哈佛大學的A．M．Maxam和W．Gilbert

發(fā)明的，所以又叫做Maxam－GilbertDNA序列分析法雖然說對于大分子量的DNA片段的序列測定而言，化學修飾法并不如雙脫氧法方便有效，其發(fā)展速度也不及后者迅速，但是至今在相當多的研究工作中仍被采用。本文檔共28頁；當前第16頁；編輯于星期三\11點31分2.5.2.1Maxam－Gilbert化學修飾法的原理化學試劑處理末端標記DNA片段，堿基的特異性切割產(chǎn)生的DNA片段混合物,電泳分離顯影后顯現(xiàn)譜帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。本文檔共28頁；當前第17頁；編輯于星期三\11點31分出發(fā)材料：局部消化的DNA分子群體中純化出特定的末端帶有放射性標記的DNA片段(雙鏈或單鏈）關(guān)鍵：4種核苷酸堿基中，有1～2種發(fā)生特異性的化學切割僅應(yīng)，包括堿基的修飾、修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去以及在失去堿基的部位發(fā)生DNA鏈的斷裂三個主要內(nèi)容。本文檔共28頁；當前第18頁；編輯于星期三\11點31分堿基特異的化學切割反應(yīng)——肼（NH2·NH2）肼能夠從C4或C6位置作用于T和C，并用C4-C5-C6環(huán)化形成一種新環(huán);進一步作用釋放出吡唑琳酮環(huán)，留下的N1－C2－N3片段則仍連在糖環(huán)上。在具有六氫吡啶的條件下，通過β-消除反應(yīng)，2個磷酸分子從糖片段上釋放出來，從而導致DNA鏈斷裂。反應(yīng)體系中加入lmol/L濃度的鹽，肼同T的反應(yīng)速率便會逐漸下降，以確保發(fā)生C特異的化學切割反應(yīng)。根據(jù)這一特點區(qū)別C和C+T之間的降解產(chǎn)物。本文檔共28頁；當前第19頁；編輯于星期三\11點31分堿基特異的化學切割反應(yīng)——硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］在硫酸二甲酯的作用下，堿基環(huán)中的氮原子發(fā)生甲基化反應(yīng)（G

N7和A

N3）。中性PH：甲基化導致配糖鍵水解，留下失去堿基的糖一磷酸骨架上的鍵。這種鍵十分微弱，易于使糖片段兩翼的磷酸脫落，造成DNA斷裂;堿性pH：采用六氫吡啶同DNA甲基化反應(yīng)，而這種反應(yīng)對甲基化的G是特異的。因此，DNA鏈的斷裂只在G發(fā)生。本文檔共28頁；當前第20頁；編輯于星期三\11點31分2.5.2.2化學修飾法測序圖解本文檔共28頁；當前第21頁；編輯于星期三\11點31分CT+CG+AATTATCAGGATGGCGACTTCGAG+AT+CC試試看你作對了嗎？本文檔共28頁；當前第22頁；編輯于星期三\11點31分2.5.2.3Maxam－Gilbert化學修飾法優(yōu)點不需要體外酶催合成反應(yīng)單雙鏈都可以需要末端標記兩端采用不同的標記，測序可從兩端進行本文檔共28頁；當前第23頁；編輯于星期三\11點31分2.5.3序列分析的自動化返回目錄