分-子-生-物-學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011級(jí)生物科學(xué)師范組長(zhǎng)：組員：從甘薯中克隆ADK基因的核心片段（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715）摘要：甘薯為我國(guó)農(nóng)業(yè)主要栽培作物，并且是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)材料，本次實(shí)驗(yàn)主要以甘薯葉片（部分為莖）為實(shí)驗(yàn)材料，第一次實(shí)驗(yàn)從材料中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大量ADK基因核心片段，電泳檢測(cè)膠回收ADK基因核心片段，將其與T載體相連并導(dǎo)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)增之后在加有相應(yīng)抗生素的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆，這對(duì)后續(xù)生物信息學(xué)分析等有重要意義。第二次實(shí)驗(yàn)是用CTAB法提取甘薯DNA，PCR擴(kuò)增再凝膠電泳檢測(cè)純度。（提取DNA也能擴(kuò)增出ADK基因核心片段）關(guān)鍵詞：甘薯、PCR技術(shù)、腺苷酸激酶片段（ADK）、基因克隆、轉(zhuǎn)化Abstract:Sweetpotatoformyagriculturalmaincultivationcrop,andismolecularbiologylaboratorycommonmaterial,thistimesexperimentmaintosweetpotatoleaves(partforstems)forexperimentmaterial,firsttimesexperimentfrommaterialintheextractionRNAandreverserecordedcDNAfirstchain,byPCRspreadincreasedgetlargeADKgenecorefragments,electrophoresisdetectionrubberrecyclingADKgenecorefragments,willitsandtcarrierconnectedandimportEscherichiacoliDH5(feelStatecellinthe,spreadincreasedinplushascorrespondingantibioticsofLBTabletShangfilterpositivecloneThisimportancetosubsequentbioinformaticsanalysis.ThesecondexperimentwasextractedbyCTABmethodDNA,PCRamplificationandgelelectrophoresisandpurityofsweetpotato.(ExtractionofcorefragmentofDNAcanbeamplifiedADKgene)keywords:sweetpotato;PCRtechnologies;AdenylateKinaseGene(adk);geneclone;transformation綜述1.1甘薯2.2方法2.2.1植物RNA的提取及檢測(cè)及反轉(zhuǎn)錄植物RNA的提取實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程如下：1.在離心管中加入2ulRNA，2ul引物，2ulSuperPureDntps,8.5ulRNase-FreeddH2O2.70℃水浴加熱5分鐘后，冰上冷卻2分鐘，再進(jìn)行簡(jiǎn)短離心3.加入4ulBuffer，0.5ulRNasin4.加1ulTIANScriptM-MLV,輕輕用移液器混勻注意事項(xiàng)如下：1.第一次離心過(guò)后，吸取上清液400ul另一離心管中，呈淡粉色。2.共經(jīng)過(guò)7次離心，均為常溫離心，每次離心后加入的試劑不同，需細(xì)心。3.簡(jiǎn)短離心的步驟與正常離心不同，控制時(shí)間2.2.2PCR擴(kuò)增adk基因核心片段（1）在2個(gè)50ul的PCR反應(yīng)管中依次加入如下組分:PCR反應(yīng)體系：1)MiniQH2O39.5μl2)10×PCRbuffer（含Mg離子）5μl3)10mMdNTPmix1μl4)引物1(10μM)F-ADK 1μl5)引物2(10μM)R-ADK1μl6）Taq(2to5units/ul)0.5μl7)模板(DNA)2μl總體積50.0μl（2）短暫離心混勻各組分后，將PCR反應(yīng)管放入PCR儀。PCR反應(yīng)的程序如下:Ⅰ）94℃4minⅡ）94℃45s；56℃45s；72℃1min（33個(gè)循環(huán)）Ⅲ）72℃8minⅣ）4℃保存（3）將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.2.3膠回收adk基因片段和連接T載體及大腸桿菌的培養(yǎng)1）膠回收adk基因片段按照提供的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒—-離心柱型中所述的方法對(duì)已檢測(cè)并可使用的adk基因片段進(jìn)行回收1.柱平衡步驟：向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL,12000rpm(～13400×g)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。2.將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。3.向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，因?yàn)槟z重為0.1g，其體積可視為100ul，以此類推。50℃水浴放置10分鐘，期間不斷溫和的上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。4.將上一步所得溶液加入另一個(gè)吸附柱CA2中室溫放置2分鐘，12000rpm（～13400×g）離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。5.向吸附柱CA2中加入700ul漂洗液PW，12000rpm（～13400×g）離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。6.向吸附柱CA2中加入500ul漂洗液PW，12000rpm（～13400×g）離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液。7.將吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm（～13400×g）離心2分鐘，盡量出去漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。8.將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30ul洗脫緩沖液EB，水浴37℃2分鐘。12000rpm（～13400×g）離心2分鐘收集DNA溶液。2)連接T載體1.在200ulEP管中加入下列組分：PMD-19TVector0.5ulInsertDNA4.5ulSolutionⅠ5ul2.輕輕混勻，16℃連接30分鐘3）大腸桿菌搖床培養(yǎng)部分同學(xué)在老師指導(dǎo)下已完成2.2.4DNA的提取及大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1）DNA的提取1、向10ml離心管中預(yù)先加入4mlCTAB抽提液及相應(yīng)量的β-巰基乙醇（2%-3%），65℃預(yù)熱；2、取適量的植物甘薯嫩葉用液氮充分磨成粉末，轉(zhuǎn)入該10ml離心管中，迅速混勻。3、于65℃水浴45min，中途間隔（輕柔）顛倒混勻三次或四次；4、冷至室溫后加入等體積(4ml)氯仿，輕柔顛倒混勻使乳化10min；5、10000轉(zhuǎn)／分離心10min（18-20℃）；6、吸取上清3-4ml于另一干凈的10ml離心管中；7、吸取上清加入與上清液等體積且已于-20℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置15分鐘至白色絮狀沉淀出現(xiàn)；8、用玻璃鉤子挑出DNA，放入盛有1ml75%乙醇的1.5mlEppendorf管中9、用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip頭吸干乙醇；10、用1ml75%乙醇再漂洗一次；11、用無(wú)水乙醇再漂洗一次；12、沉淀于室溫或60℃以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現(xiàn)半透明；13、用500μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，得DNA粗提物。14、取10μlDNA電泳檢查DNA的質(zhì)量；2）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1.將1ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液移入50mlLB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD值為0.3-0.62.取培養(yǎng)液3ml轉(zhuǎn)入10ml無(wú)菌離心管中，于4℃4000r／min離心10min，去上清3.沉淀用3ml預(yù)冷的0.1MCaCl2懸浮，與冰上放置30分鐘；4.4℃，4000r／min離心10min，去上清；5.沉淀用600μl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞6.分裝3管，每管200μl，冰上放置30分鐘2.2.5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、篩選及PCR檢測(cè)1.將10μlDNA的連接物加入一管感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后放置冰上30分種；2.42℃水浴中熱激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上2min，室溫下放置3-5min；3.加入800ml37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，混勻后37℃180rpm培養(yǎng)0.5h4.4000rpm離心10min，去800ml上清液，將剩余的200ml菌液混勻；5.用燒烤過(guò)的涂布棒將100ml的菌液涂布于加相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基涂勻，共2個(gè)6.置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)2.2.6連接產(chǎn)物的篩選及PCR檢測(cè)1.選取平板上合適菌落，標(biāo)記備用（共4個(gè)）2.用10μl移液器槍頭對(duì)準(zhǔn)所選菌落刮取，置于裝有1ml溶液的EP管中3.將EP管進(jìn)行搖床培養(yǎng)4，PCR檢測(cè)3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1甘薯RNA的提取及檢測(cè)+反轉(zhuǎn)錄圖1-2總RNA的電泳圖（末）圖1-1總RNA的電泳圖（初）圖1-2總RNA的電泳圖（末）圖1-1總RNA的電泳圖（初）結(jié)果分析：RNA極易被RNA酶降解，而RNA酶在自然界中廣泛而豐富的存在，因此要取得本次實(shí)驗(yàn)的成功關(guān)鍵之處在于嚴(yán)格防止RNA酶的污染。此外，為了達(dá)到更佳的效果，實(shí)驗(yàn)選用的材料是甘薯嫩葉，因?yàn)槠銻NA含量豐富，但實(shí)驗(yàn)中能否研磨充分，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。從RNA電泳的結(jié)果來(lái)看，我們組在該次實(shí)驗(yàn)中較好地做到了這兩點(diǎn)，因此獲得的條帶不僅區(qū)分度好，亮度也高。在實(shí)驗(yàn)中共進(jìn)行了兩次紫外檢測(cè)，首次檢測(cè)是在預(yù)期時(shí)間后，但發(fā)現(xiàn)RNA條帶跑的不是很開(kāi)（如圖1-1），分析原因是配制瓊脂糖凝膠時(shí)膠濃度比期望濃度大，致使RNA遷移速率減慢，因而電泳時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)。由于在電場(chǎng)中核酸分子的遷移速率取決于分子量大小和空間構(gòu)型，沉降系數(shù)大的RNA跑得慢，故從上到下的條帶分別代表28S、18S、5.8S（如圖1-2）。從電泳獲得的28S和18S兩條主帶的亮度來(lái)看，28S和18SRNA比值約為2:1，符合一般真核細(xì)胞RNA比值。3.2PCR擴(kuò)增adk基因核心片段圖2PCR擴(kuò)增adk基因的電泳圖圖2PCR擴(kuò)增adk基因的電泳圖結(jié)果分析：上次實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)獲得的甘薯RNA進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。本次實(shí)驗(yàn)利用上次實(shí)驗(yàn)獲得的cDNA進(jìn)行PCR，所用的10×PCRbuffer、taq是北京普博欣公司生產(chǎn)，而引物1、引物2系華大公司生產(chǎn)（1、2組），其他四組用其他公司生產(chǎn)的試劑盒。從擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，效果均不錯(cuò)（1-4組擴(kuò)增的是adk基因，5、6組擴(kuò)增的是adk核心片段，故結(jié)果有所差異）。通過(guò)與Marker跑出的條帶對(duì)比，擴(kuò)增的目的基因在1000~750bp之間（Marker各條帶從上到下分別表示2000、1000、750、500、250、100，后面3個(gè)不太明顯）。本次實(shí)驗(yàn)每個(gè)組共做了2個(gè)50μL反應(yīng)體系，但待加完所有試劑后，很多體系的體積明顯不同，分析原因可能是在操作過(guò)程中使用移液槍出現(xiàn)問(wèn)題，或是移液槍本身有誤差。3.3目的基因片段的回收、連接上次實(shí)驗(yàn)我們擴(kuò)增到了甘薯adk目的基因，并進(jìn)行了電泳，得到了單一目的DNA條帶，本次實(shí)驗(yàn)將該目的DNA條帶切下，進(jìn)行膠回收和T載體連接。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行順利。根據(jù)時(shí)間安排，本次連接過(guò)夜，是連接更加完全。3.4DNA的提取、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化3.4.1DNA的提取圖4-1提取DNA結(jié)果圖圖4-2提取DNA的電泳圖圖4-1提取DNA結(jié)果圖圖4-2提取DNA的電泳圖結(jié)果分析：本次提取DNA使用的材料仍是甘薯，所用植物材料的量和研磨是否充分是影響獲得DNA量多少的兩個(gè)主要方面，與其他組相比，我們組提取的DNA量比較充足（如圖4-1所示）。將此DNA沉淀溶解后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到3條清晰可區(qū)分的帶，從上向下依次代表蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)、DNA、RNA（如圖4-2所示），較其他組而言，我們組DNA條帶亮度高，說(shuō)明提取的DNA量多。RNA分帶不明顯，說(shuō)明有部分降解，但未被降解完全。3.5連接產(chǎn)物的篩選及PCR檢測(cè)圖5-2PCR菌檢圖圖5-1連接轉(zhuǎn)化后的E.Coli平板圖5-2PCR菌檢圖圖5-1連接轉(zhuǎn)化后的E.Coli平板結(jié)果分析：我們組的兩個(gè)加了氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基上共長(zhǎng)出了4個(gè)大腸桿菌菌落（分給了2組一個(gè)），這幾個(gè)菌落形狀都比較規(guī)則，判斷是由一個(gè)大腸桿菌長(zhǎng)成，由于它們能夠在加了氨芐抗生素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出，說(shuō)明它們具有氨芐抗性，說(shuō)明有T載體導(dǎo)入，但無(wú)法確認(rèn)該T載體上是否有我們所需的adk目的基因，還需進(jìn)一步菌檢。由PCR菌檢結(jié)果可知（如圖5-2），該3個(gè)菌落雖都是轉(zhuǎn)化子，但3號(hào)菌落菌檢無(wú)條帶，說(shuō)明3號(hào)菌落是假陽(yáng)性的，而1、2號(hào)菌落則是我們所要得到的菌落。整個(gè)分子實(shí)驗(yàn)取得成功。取得這樣的結(jié)果，有一部分運(yùn)氣在里面，但全組成員在此過(guò)程中的嚴(yán)謹(jǐn)操作也是必不可少的重要因素。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)感想四天的分子實(shí)驗(yàn)結(jié)束了，時(shí)間看似漫長(zhǎng)，卻也如此短暫，回首這四天的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷，有辛苦，有疲憊，但也不乏成就感和喜悅感，在老師的指導(dǎo)下，和同學(xué)們一起完成實(shí)驗(yàn)，這樣的過(guò)程總是那樣美好，讓人留戀，當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中收獲到的心得體會(huì)對(duì)于我來(lái)說(shuō)最為寶貴。作為我們一組的記錄員，說(shuō)實(shí)話，工作有些辛苦，但是我覺(jué)得很快樂(lè)，這份工作很適合我，也正是我喜歡與擅長(zhǎng)的方面。從實(shí)驗(yàn)當(dāng)初的迷茫，到實(shí)驗(yàn)最后的嫻熟，我也不得不佩服自己的耐心與細(xì)心，這是我以前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，希望以后可以得以施展和加強(qiáng)鞏固。由于做記錄員，工作比較繁雜，所以實(shí)驗(yàn)中我只做些簡(jiǎn)單的操作，比如離心、計(jì)時(shí)等，但對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程我還是比較了解的，這也是記錄員的好處吧！在這方面我的收獲還是蠻大的，至少懂得實(shí)驗(yàn)過(guò)程是馬虎不得的，有一步失誤，就可能導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗。我們組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都很順利，包括后面對(duì)菌的培養(yǎng)，長(zhǎng)出了四組明顯菌落，并且發(fā)現(xiàn)了2個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，這種結(jié)果是我們期待的，同樣也是我們沒(méi)有想到的，心里別提有多開(kāi)心了，感覺(jué)這四天的努力沒(méi)有白費(fèi)，一切辛苦都是值得的。以上所說(shuō)的都是我在實(shí)驗(yàn)中的體會(huì)，接下來(lái)我想說(shuō)的是實(shí)驗(yàn)過(guò)后我的感想，這些感想比實(shí)驗(yàn)中那些匆匆的心情增加了許多反思與積淀。給我留下最深印象的應(yīng)該是周四那天晚上，也就是實(shí)驗(yàn)結(jié)束，曾老師在講臺(tái)上給我們講了一些事情的那堂晚課，記得當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還沒(méi)出來(lái)，曾老師給我們講實(shí)驗(yàn)報(bào)告該怎么書(shū)寫(xiě)，其中提到了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問(wèn)題，曾老師說(shuō)“實(shí)驗(yàn)失敗了并不可怕，這很正常，不要被這件事影響了心情”，之后又舉了很多他經(jīng)歷的實(shí)驗(yàn)失敗，告訴我們要學(xué)會(huì)總結(jié)和反思，說(shuō)實(shí)話，有那么一大段時(shí)間我都是眼含淚花地聽(tīng)著他講話，不時(shí)地笑一下回應(yīng)，心里很溫暖，他真的是個(gè)好老師，懂得怎么教育學(xué)生，很多老師都會(huì)采用批評(píng)的口吻總結(jié)課堂，那樣的方式我們?cè)缇蛥捑肓?，而他卻用不同的方式告訴了我們真理，這讓我很感動(dòng)，也很崇拜，即使失敗，老師也還在關(guān)照著我們的內(nèi)心，那份感謝不知怎樣用語(yǔ)言來(lái)表達(dá)，我想我會(huì)永遠(yuǎn)地記得他的教育方式，來(lái)教育我的學(xué)生，用那份寬容來(lái)對(duì)待我身邊的人。曾老師讓我們對(duì)他提一些建議，我只想提一點(diǎn)：希望您繼續(xù)溫暖可愛(ài)的孩子們，用您一直寬容的心對(duì)待您的學(xué)生們！實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有老師幫助，同學(xué)的團(tuán)結(jié)，有工具、藥劑的陪伴，我感到很幸福，很充實(shí)，認(rèn)真對(duì)待每一件事，每一個(gè)人，正確看待自己，定位未來(lái)的道路，相信明天會(huì)更好。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)感想本次實(shí)驗(yàn)我們做了RNA的抽提與檢測(cè)、RNA逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA及檢測(cè)、PCR擴(kuò)增目的的基因及檢測(cè)、目的基因片段的回收與連接、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和篩選及PCR的檢測(cè)及DNA的抽提與檢測(cè)。此次為期大概四天，實(shí)驗(yàn)中小組成員都想積極參與，但由于實(shí)驗(yàn)不需要太多人動(dòng)手，部分人不得不只配和其他組員完成任務(wù)。本次實(shí)驗(yàn)成功不僅僅是小組成員間的合作成果，也是全班各小組共同合作的成果。充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)需要團(tuán)隊(duì)合作。我們充分利用時(shí)間自覺(jué)完成實(shí)驗(yàn)，相對(duì)而言效率較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為成功。經(jīng)過(guò)四天的實(shí)驗(yàn)，我們把DNA,RNA的提取，PCR擴(kuò)增目的基因，電泳，膠回收目的片段，連接—T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽(yáng)性克隆篩選，PCR鑒定連起來(lái)做，感覺(jué)能把整個(gè)實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來(lái)，更有利于實(shí)驗(yàn)知識(shí)的學(xué)習(xí)，這幾天實(shí)驗(yàn)做下來(lái)心里很踏實(shí)，老師要求寫(xiě)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告很特殊，我們小組合作的方式完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，對(duì)實(shí)驗(yàn)知識(shí)有進(jìn)一步的加深。思路得到了開(kāi)闊。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們把看不見(jiàn)的DNA提取出來(lái)了，也得到了PCR等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在理論中很難理解的東西，實(shí)驗(yàn)后理解起來(lái)更容易了。經(jīng)過(guò)曾令江老師的指導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)中反復(fù)操作后，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器使用技術(shù)提高了。此次分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)采取集中時(shí)間按技術(shù)路線流程完成，不僅節(jié)約時(shí)間，更是讓我們更深入的熟悉理解技術(shù)操作原理。相比于其他科目的實(shí)驗(yàn)，每周進(jìn)行一小部分實(shí)驗(yàn)操作，沒(méi)有很好地連接起來(lái)，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)更利于我們記憶，效率明顯的有大部分提高。再加上曾老師的悉心指導(dǎo)及包容，幫助我們從失敗的結(jié)果中得出的經(jīng)驗(yàn)及教訓(xùn)，改正錯(cuò)誤。從老師身上我們也學(xué)到了細(xì)心，耐心，堅(jiān)持不懈的實(shí)驗(yàn)精神。這次試驗(yàn)老師才是最辛苦的人。實(shí)驗(yàn)中我們收獲了很多，不但獲得了實(shí)驗(yàn)的相關(guān)知識(shí)，讓我們近距離更直觀的理解了課本上的理論知識(shí)，也讓我們加強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的操作技能，更加注意實(shí)驗(yàn)的相關(guān)事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)中要十分嚴(yán)謹(jǐn)并且要積極觀察相關(guān)現(xiàn)象。另外，有點(diǎn)小遺憾就是實(shí)驗(yàn)中人數(shù)太多了，器材不夠，很多同學(xué)沒(méi)有真正的參與到實(shí)驗(yàn)的具體操作中來(lái)。最后，感謝曾令江老師對(duì)本次實(shí)驗(yàn)悉心指導(dǎo)與幫助。————古麗克孜·吐熱克分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)與體會(huì)從5月12日開(kāi)始到5月15日持續(xù)四天沒(méi)有嚴(yán)格作息時(shí)間的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，也是大學(xué)里最后的一門(mén)實(shí)驗(yàn)課結(jié)束了，反而有一點(diǎn)失落，不再整天那么忙碌，不習(xí)慣了。實(shí)驗(yàn)中同學(xué)們都和積極，每節(jié)課都能全勤，并且參與實(shí)驗(yàn)，這一門(mén)實(shí)驗(yàn)課是我大三學(xué)年上的最實(shí)在的實(shí)驗(yàn)課，跟有的實(shí)驗(yàn)是不一樣的，老師全程陪同、指導(dǎo)，有一個(gè)基本思路，技術(shù)路線，使得實(shí)驗(yàn)不再那么茫然，不會(huì)給一堆新鮮的實(shí)驗(yàn)儀器，PPTl瀏覽一遍然后就把實(shí)驗(yàn)室扔給我們，最后只要交實(shí)驗(yàn)報(bào)告就行了。在本次實(shí)驗(yàn)中，我體會(huì)到了實(shí)驗(yàn)以人為本，科研都是為人服務(wù)的，雖然科研工作者都要有為科研獻(xiàn)身的精神，但還是要在實(shí)驗(yàn)中采取措施保護(hù)工作者，以免去不必要的人身?yè)p失，就比如在用液氮里研磨甘薯葉片，操作者都要用棉手套和一次性塑料手套，防止凍傷；DNA提取中，研磨得到的植物組織粉末和經(jīng)65攝氏度預(yù)熱的試劑溫差太大，加入粉末是，離心管口要朝無(wú)人的地方；電泳制膠，染色劑用了GV來(lái)替代強(qiáng)致癌劑EB等。實(shí)驗(yàn)在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)要節(jié)約資金，做了這么多次實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室我首次見(jiàn)到了好幾個(gè)量筒上半部分無(wú)刻度的部分損壞但仍然堅(jiān)守崗位，還在用于實(shí)驗(yàn)，盡管這只是幾只量筒，足以表現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)室管理者節(jié)約的原則。小組實(shí)驗(yàn)重于合作，本次實(shí)驗(yàn)我們組雖然全是女生，但是在大家合理分工相互合作下，實(shí)驗(yàn)還是取得了成功，最后挑出的三個(gè)菌落，有兩個(gè)都是陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。并且在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)第一步研磨植物組織，我們組都率先高質(zhì)量完成。作為師范生，我從曾老師身上學(xué)到了要適時(shí)給予學(xué)生鼓勵(lì)，在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化步驟后，培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中7攝氏度培養(yǎng)12到14小時(shí)，再去挑菌落篩選的時(shí)候，有兩個(gè)組培養(yǎng)皿中一個(gè)菌落也沒(méi)有，然后就從其他組挑取單菌落繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，但后續(xù)過(guò)程中扔不忘去關(guān)心一下自己組的培養(yǎng)基中有沒(méi)有再長(zhǎng)出菌落，老師說(shuō)了一番話讓人心里暖暖的，給予了大家鼓勵(lì)，老師說(shuō)他們起碼是關(guān)心本次實(shí)驗(yàn)的，實(shí)驗(yàn)失敗很正常，只要下去思考了失敗的原因可能比實(shí)驗(yàn)成功的同學(xué)收獲更多，一次實(shí)驗(yàn)的成功與否與運(yùn)氣也有一點(diǎn)點(diǎn)關(guān)系······制膠、點(diǎn)樣、感受態(tài)細(xì)胞的制備、挑菌落、配PCR反應(yīng)體系等等步驟一個(gè)也不能馬虎，在第二次實(shí)驗(yàn)點(diǎn)樣用以跑電泳篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體時(shí)，我點(diǎn)第三個(gè)孔有點(diǎn)抖，差點(diǎn)把孔捅破，因?yàn)榍皟蓚€(gè)加10微升，都從孔里浸出來(lái)了，實(shí)驗(yàn)技能有待提高。另外反應(yīng)體系的制備是不能想當(dāng)然的，用的不同產(chǎn)品，配方、濃度不同加的體積也不一樣，需要慎重，自己計(jì)算。建議：實(shí)驗(yàn)的每一步操作需要的人并不多，這樣的分組使得一部分同學(xué)不能很好的參與進(jìn)來(lái)，因此個(gè)人建議3人左右為一組。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)與體會(huì)2014年5月12日，我們班的分子生物學(xué)開(kāi)始動(dòng)手做了。我們先對(duì)本門(mén)課程的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一個(gè)初步的認(rèn)識(shí)：以甘薯葉片為實(shí)驗(yàn)材料，首先進(jìn)行甘薯的總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，PCR擴(kuò)增ADK基因核心片段，電泳檢測(cè)膠回收ADK基因片段，然后將目的基因ADK與T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，隨后進(jìn)行PCR的檢測(cè)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，后續(xù)的還有測(cè)序及生物信息的分析等就不需要我們做了。有了初步的認(rèn)識(shí)和技術(shù)流程的熟悉后，我們下午就開(kāi)始了實(shí)驗(yàn)。第一天實(shí)驗(yàn)做了甘薯RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。這是第一次做關(guān)于分子生物的實(shí)驗(yàn)，老師講了原理和注意事項(xiàng)之后，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行過(guò)程中都非常的安靜。以后的實(shí)驗(yàn)上老師對(duì)我們的要求也很?chē)?yán)格，所以最后我們每個(gè)組基本上都有了結(jié)果。當(dāng)然從效果上看，我們組的效果是最好的：我們挑了三個(gè)菌落進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出來(lái)我們有兩個(gè)是陽(yáng)性的。在本次實(shí)驗(yàn)中我收獲的東西不僅僅是實(shí)驗(yàn)結(jié)果，收獲更多的是實(shí)驗(yàn)時(shí)的一些操作方法（如PCR技術(shù)、凝膠的配制等）和與伙伴們的協(xié)調(diào)配合，還有對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析等（如果一次實(shí)驗(yàn)失敗了，懂得如何分析出失敗的原因）。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，讓我真正地清楚了克隆ADK基因的核心片段整個(gè)操作流程，記住了很多主要步驟的原理。當(dāng)然，有收獲也有遺憾的地方，比如：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我容易出現(xiàn)“照方抓藥”的情況，自己并不完全的明白我所做的這一個(gè)步驟有什么作用，就跟著實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)上的步驟跟著做了，缺乏了很多的思考。所以在今后的學(xué)習(xí)中，希望自己能多學(xué)會(huì)思考所做的每一步有什么意義。實(shí)驗(yàn)分組中每個(gè)組的人太多，每個(gè)組都有5個(gè)人或以上，但是在做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候真正能夠操作的也就是那么兩三個(gè)人，這樣的話就會(huì)有人空閑下來(lái)不知道做什么事。如果是交換著今天你做什么，明天我來(lái)做剩下的內(nèi)容。那么這樣的實(shí)驗(yàn)又會(huì)出現(xiàn)一個(gè)問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)者就無(wú)法真正的參與到這一個(gè)連續(xù)的實(shí)驗(yàn)中?？倳?huì)覺(jué)得自己有一部分操作沒(méi)有做，在腦海中就不會(huì)對(duì)這一整個(gè)實(shí)驗(yàn)有一個(gè)較好的連續(xù)的整體。所以建議以后的實(shí)驗(yàn)每個(gè)組三個(gè)人，最多四個(gè)人就夠了。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有很多空閑的時(shí)間，我希望我們能夠自