生化大實(shí)驗(yàn)AKP堿磷酶的表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)

生化大實(shí)驗(yàn)AKP堿磷酶的表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)一、AKP大腸桿菌堿性磷酸酶(也稱大腸桿菌堿性磷酸酯酶，E.colialkalinephosphatase，簡稱AKP/ALP，EC.3.1.3.1)，在堿性環(huán)境下能水解多種磷酸單酯化合物的酶，需要鎂和錳離子為激活劑。AKP三維結(jié)構(gòu)模擬圖堿性磷酸酶的不同分子狀態(tài)堿性磷酸酶的理化性質(zhì)沉降系數(shù)(單體)沉降系數(shù)(二聚體)沉降系數(shù)(四聚體)固有粘度電泳遷移率等電點(diǎn)等離子點(diǎn)摩擦比率MWwMWzMWZ+1吸光率(278nmfor1mg/ml)激活劑抑制劑熱穩(wěn)定性6.0atpH8.06.2S9.6S3.4cm3/g3.3×10-5cm2/VsecatpH7.6pH4.5pH6.31.05(67-98)×103atpH8.0(88-99)×103atpH8.0(86-110)×103atpH8.00.72Mg2+，Mn2+，Zn2+，Ca2+氰化物,焦磷酸鹽85℃加熱30分鐘仍保留活性，Mg2+存在時(shí)可增加酶的熱穩(wěn)定性二、蛋白純化常用技術(shù)1.破碎機(jī)械法、溶脹和自溶、化學(xué)處理、生物酶降解2.分離純化沉淀：鹽析、有機(jī)溶劑、聚乙二醇、加熱層析：離子交換、凝膠過濾、親和層析、疏水層析、金屬螯合層析、吸附層析、分配層析等離心、超濾等3.濃縮的方法沉淀法、吸附法、超濾法、透析法、減壓蒸餾法、

冷凍干燥法4.測定方法光譜法：吸收光譜法（直接測定法、比色法）、熒光法、濁度法、熒光光譜技術(shù)、紅外光譜技術(shù)等電化學(xué)法、生物活性檢測法、免疫分析法、生物傳感器法5.鑒定方法電泳：瓊脂糖電泳、聚丙烯凝膠電泳免疫分析：凝集反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、固相免疫吸附、

免疫印跡等色譜：氣相色譜、高壓液相色譜、質(zhì)譜特定的化學(xué)反應(yīng)、PCR、生物芯片、DNA測序、

DNA重組雜交技術(shù)、表型變化等6.標(biāo)記技術(shù)7.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的測量、記錄、處理與分析8.試劑的配制與保存9.樣品的保存與處理三、AKP表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表達(dá)菌體超聲破碎高速離心去沉淀離子交換層析粗分離加熱除雜,高速離心硫銨沉淀富集分子篩層析進(jìn)一步分離透析濃縮培養(yǎng)表達(dá)，收集菌體純化監(jiān)測OD280比活力SDS紫外監(jiān)測濃度測定純化方案的評估組分體積mL蛋白mg/mL總蛋白mg活力U/mL總活力U比活力U/mg提純倍數(shù)回收率Ⅰ1100％ⅡⅢⅣ留樣！體積測定！培養(yǎng)、表達(dá)與菌體收集1.預(yù)培養(yǎng)：

挑一單菌落至30mLLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mLCarb)，37℃、190rpm振蕩培養(yǎng)過夜；2.擴(kuò)大培養(yǎng)：取2mL～3mL預(yù)培養(yǎng)菌液至300mLTM培養(yǎng)基中(含50μg/mlCarb)，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)3~4小時(shí)3.誘導(dǎo)表達(dá)：

加入IPTG（終濃度：50μmol/L），25℃、250rpm振蕩培養(yǎng)12～16小時(shí)4.收菌：

4℃，6000rpm×10min，－20℃保存菌體沉淀注意：平衡！

充分棄上清！細(xì)胞破碎加入30mLBufferB，重懸菌體；超聲破碎：

輸出功率1200W，超聲2秒，間隔10秒，超聲40次；12,000rpm4℃×20min，留取上清至一新管。取上清200uL加入200uL甘油（Ⅰ號(hào)樣品），

－20℃保存?zhèn)溆?；注意冰浴冷卻注意配平?。?！量體積上樣：將離心上清以的流速連續(xù)地加入已平衡好的DEAE-FF層析柱中,每管接收3mL；洗滌：用40mLBufferB洗滌雜蛋白

流速：1mL/min，每管接收3mL；洗脫：用200mLBufferB其中含0－的連續(xù)

NaCl梯度洗脫AKP

流速：1mL/min，每管接收3mL

收集：收集有活性的AKP，取200uL加入200uL甘油

（Ⅱ號(hào)樣品），－20℃保存?zhèn)溆肈EAE-FF離子交換層析？？？量體積熱變性：80℃，水浴30min

4℃，12000rpm×20min

留上清硫銨沉淀：每100mL

AKP溶液+加入60克固體硫酸銨

溶解后靜置10分鐘，10000rpm×10min

充分棄上清，沉淀-20℃保存，備用。濃縮III號(hào)樣品的制備：取此步上清200μL，加入200μL甘油，混勻，-20℃保存量體積沉淀溶解：沉淀用左右BufferA充分溶解，

10000rpm×10min，留上清

分子篩層析：

將上述離心上清上樣、洗脫（BufferA）

洗脫流速為15mL/小時(shí)，每管接收2mL透析濃縮：合并光吸收及酶活高峰管

BufferC透析濃縮4小時(shí)

分裝-20℃保存?zhèn)溆?Ⅴ號(hào)樣品)SephacylS-200HR分子篩層析IV號(hào)樣品制備：取50uL離心上清+150uLBufferB+200uL甘油

混勻，-20℃保存?zhèn)溆昧矿w積量體積pNP（對硝基酚）酶活測定pNPP（對硝基酚磷酸）AKP410nm測定OD值無色＋Pi黃色Na3PO4A=ε（λ）CLpNP的摩爾消光系數(shù)ε（λ）：

17500mol-1·L·cm-11.LB培養(yǎng)基(預(yù)培養(yǎng)用培養(yǎng)基)30mL/班胰蛋白胨0.3g

酵母提取物0.15g

氯化鈉0.3g5mol/LNaOH調(diào)pH至7－8（經(jīng)驗(yàn)值：200ul／L）蒸餾水定容至30mL2.TM培養(yǎng)基(表達(dá)培養(yǎng)基)300mL/組胰蛋白胨3.6g

酵母提取物7.2g

氯化鈉3.0g

甘油1.8mL

用1mol/LTris調(diào)pH至7－8（經(jīng)驗(yàn)值：9.3mL／L）蒸餾水定容至300mL溶液配制3.BufferApH8.51000mL/組

Tris-HCl50mmol/LNaCl

4.BufferBpH8.51000mL/組Tris-HCL50mmol/LEDTA1mmol/LMgAc22mmol/L5.NaOH0.5mol/L(40mL/組)降低蛋白與介質(zhì)的非特異性結(jié)合溶液配制6.考馬斯亮藍(lán)溶液500mL

考馬斯亮藍(lán)G-25050mg溶于25mL95%乙醇中，

加入50mL85%磷酸,加水至500mL，濾紙過濾（棕色瓶）7.1mg/mLBSA10mL（全班）

10mgBSA用BufferA溶解，10mL容量瓶定容溶液配制溶液配制8.測活液pH8.5100mL50mmol/LTris-HCl10mmol/LpNPP2mmol/LMgAc29.終止液500mL10.BufferC600mL11.30%膠貯液300mL（棕色瓶，4℃室溫保存)每100mL中含丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺，溶解后過濾12.分離膠緩沖液200mL：

（4℃室溫保存）13.濃縮膠緩沖液100mL：

（4℃室溫保存）14.10%（m/V）過硫酸銨10mL（分裝，－20℃室溫保存）15.SDS電泳緩沖液500mL（（全班,室溫保存）25mmol/LTris，，0.1%(W/V)SDS溶液配制下周實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

分子篩層析濃縮保存純化參數(shù)測定純化方案的評估組分體積mL蛋白mg/mL總蛋白mg活力U/mL總活力U比活力U/mg提純倍數(shù)回收率Ⅰ1100％ⅡⅢⅣ管號(hào)測活液（uL）酶稀釋液（uL）AKP（uL）300C反應(yīng)10min終止液（mL）13604003.623600403.6組份稀釋倍數(shù)A410A410平均值活力U／mL樣品Ⅰ樣品Ⅱ樣品Ⅲ樣品Ⅳ樣品Ⅴ酶活測定組份稀釋倍數(shù)A595nmA595nm平均值蛋白濃度mg/mL樣品Ⅰ樣品Ⅱ樣品Ⅲ樣品Ⅳ樣品Ⅴ管號(hào)1234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液uL0102030405060H2OuL100908070605040考馬斯亮蘭G-2505mL搖勻,1h內(nèi)以1號(hào)試管為空白對照,在595nm處比色A59500平均值0

蛋白濃度的測定未完，待續(xù)………預(yù)習(xí)堿性磷酸酶分離純化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)誤差準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確度表示實(shí)驗(yàn)分析測定值與真實(shí)值相接近的程度。誤差：測定值與真實(shí)值之間的差值為誤差。包括絕對誤差和相對誤差。誤差愈小，測定值愈準(zhǔn)確，即準(zhǔn)確度愈高。絕對誤差：測定值與真實(shí)值之差。相對誤差