分光光度計(jì)的使用

關(guān)于分光光度計(jì)的使用第1頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三分光光度法的概念分光光度法：是利用物質(zhì)特有的吸收光譜，進(jìn)行物質(zhì)鑒定及測(cè)定其含量的一種分析技術(shù)。也稱為吸收光譜法。是光譜分析技術(shù)中最常見的一種，應(yīng)用最多的是紫外及可見分光光度法。特點(diǎn)：靈敏、精確、快速和簡(jiǎn)便。應(yīng)用：生物化學(xué)微量物質(zhì)定量分析測(cè)定研究中廣泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測(cè)。光譜范圍：200～1000nm。第2頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三分光光度法的概念紅外分光光度計(jì):大于760nm的紅外光區(qū)可見光分光光度計(jì):400～760nm的可見光區(qū)紫外分光光度計(jì):

200～400nm的紫外光區(qū)分光光度計(jì)的分類第3頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三722E可見分光光度計(jì)第4頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三722E可見分光光度計(jì)第5頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源單色光器吸收池檢測(cè)系統(tǒng)鎢絲燈氫燈氘燈棱鏡衍射光柵玻璃比色杯石英比色杯硒光電池光電管光電倍增管第6頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三當(dāng)一束單色光透過溶液時(shí)部分被吸收部分被反射部分被透過IrIaI入射光

I0出射光I比色皿吸收杯反射光

IrIa吸收光分光光度計(jì)基本原理第8頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三Ｉ/I0表示光線透過溶液的程度,稱為透光度,用T表示；－IgT表示溶液對(duì)光線的吸收程度，用吸光度（A）表示。即I0CIA＝－IgT＝－IgII0←L→

第9頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三Lambert-Beer定律（光吸收定律）Lambert定律：A＝K1LBeer定律：A＝K2C

Lambert-Beer定律：當(dāng)一束單色光垂直通過一均勻的溶液時(shí)，溶液的吸光度A，與溶液的濃度C及溶液的厚度L成正比。即A＝KCL其中：A－吸光度K－為消光常數(shù)，表示物質(zhì)對(duì)光線吸收的能力，受物質(zhì)種類和光線波長(zhǎng)的影響C－溶液的濃度L－溶液的厚度第10頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三Lambert-Beer定律的應(yīng)用1、利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測(cè)定物的含量用一已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和一個(gè)未知濃度的待測(cè)溶液同樣處理顯色，測(cè)定吸光度，根據(jù)Lambert-Beer定律得：A1=K1C1L1A2=K2C2L2

因?yàn)镵1=K2L1=L2

所以C2=A2A1×C1第12頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三Lambert-Beer定律的應(yīng)用2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定物含量先配制一系列已知濃度的測(cè)定物溶液，按要求方法處理顯色，在最大吸收波長(zhǎng)（λmax）處讀取各管的吸光度，以各管吸光度A為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度C為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后進(jìn)行測(cè)定時(shí)，待測(cè)樣品以相同條件在λmax處讀取吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得該待樣品的濃度。

第13頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三吸光度A蛋白質(zhì)濃度（μg/ml）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（雙縮脲法：λ＝540nm）0.20.40.6....40801201600第14頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三722E分光光度計(jì)使用基本操作：（示教）

通電→儀器自檢（BLA）→預(yù)熱20min→設(shè)定波長(zhǎng)→方式設(shè)定（MOOD→T（或A）

→儀器調(diào)“0.000”(將遮光杯）置入光路，在T方式下按“%T”鍵，→儀器自動(dòng)校正后顯示“0.000→參比液調(diào)“0.000”A→樣品測(cè)定→讀取“A”。

第15頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三722E分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)：1、預(yù)熱----保證儀器準(zhǔn)確穩(wěn)定；2、比色皿的清潔----待測(cè)液潤(rùn)洗、沖洗；3、比色皿配套----比色皿不能隨意；4、比色皿內(nèi)盛液體量----2/3，有液體，應(yīng)用擦鏡紙拭干，以保證光路通過時(shí)不受影響；5、拿放比色皿----應(yīng)持其“毛面”，杜絕接觸光路通過的“光面”；6、溶液濃度要適當(dāng)：吸光度讀數(shù)處于0.1～0.7范圍內(nèi)為宜，否則誤